Metoda Sangera

Metoda Sangera (metoda dideoksy, ang. chain-termination method, dideoxy termination method, Sanger method) - jeden ze sposobbów sekwencjonowania DNA; opracowany przez Fredericka Sangera. i nagrodzony nagrodą Nobla w 1980 roku; do dziś stanowi (z różnymi modyfikacjami) podstawę odczytywania sekwencji DNA. Metoda ta polega na kopiowaniu badanej cząsteczki DNA warunkach in vitro, katalizowanym przez enzym polimerazę DNA.

Opis metody

Przebieg reakcji można podzielić na pięć etapów:

1. Preparatywny PCR - otrzymanie homogennego DNA

2. Denaturacja - otrzymanie jednoniciowej matrycy

3. Synteza nowych nici z użyciem dNTP i ddNTP oraz primera

4. Elektroforeza na żelu poliakrylamidowym ze stałym stężeniem środka denaturującego

5. Analiza prążków.

Reakcja przeprowadzana jest w czterech wersjach (probówkach), w każdej z nich przy wykorzystaniu próbki tego samego badanego DNA, ale różnych odczynników. W jednym z wariantów reakcja przeprowadzana jest tak, że wszystkie jej produkty zakończone są nukleotydem adeninowym. Powstają cząsteczki DNA, których sekwencja jest wprawdzie jeszcze nieznana, ale wiadomo, że są komplementarnymi kopiami pewnych fragmentów badanego DNA, a ich ostatnim nukleotydem jest nukleotyd adeninowy. Zgodnie z zasadą komplementarności adenina ma w matrycowym DNA swój odpowiednik w formie nukleotydu tyminowego. Ponieważ w naturalnych cząsteczkach DNA każdy z czterech rodzajów nukleotydów występuje wiele razy, to fragmenty zakończone jednego rodzaju nukleotydem mogą mieć bardzo różną długość. Wszystkie jednak fragmenty i to we wszystkich wariantach doświadczenia, zaczynają się takim samym odcinkiem - primerem dodanym na początku reakcji wraz z pozostałymi substratami. Podobnie w pozostałych wariantach reakcji otrzymuje się produkty mające różną długość, lecz zawierające primer na jednym końcu (końcu 5'), a jednego rodzaju nukleotyd na drugim końcu (końcu 3'). Cztery możliwe warianty reakcji sekwencjonowania to wariant A - prowadzący do otrzymania różnej długości produktów zawsze zakończonych nukleotydem adeninowym, C - wszystkie produkty zakończone nukleotydem cytozynowym i analogicznie warianty dla T i G.

Podczas kopiowania jednej cząsteczki DNA o tym, kiedy nastąpi przerwanie syntezy DNA, decyduje przypadek. Ponieważ każda z czterech probówek zawiera miliony cząsteczek analizowanego DNA i każda z tych cząsteczek ulega kopiowaniu, to zgodnie z prawem wielkich liczb w probówkach tych pojawiają się łańcuchy o wszelkich możliwych długościach (zależnych od sekwencji matrycy). Na przykład jeśli cząsteczka badanego DNA ma następującą postać: odcinek komplementarny do primera_AGCTAATGCATACGGATA, to w reakcji typu A może powstać następujące pięć rodzajów produktów:

• primer_TCGA

• primer_TCGATTA

• primer_TCGATTACGTA

• primer_TCGATTACGTATGCCTA

• primer_TCGATTACGTATGCCTAT

DNA matrycowe (badane):

• odcinek komplementarny do primera_AGCTAATGCATACGGATA.

Jak widać, od reguły, że w reakcji A wszystkie produkty zakończone są nukleotydem adeninowym może zdarzyć się wyjątek, ale dotyczy to tylko najdłuższych produktów, łatwych do rozpoznania (najdłuższe produkty pomija się w analizie). W probówce wszystkie te cząsteczki są wymieszane, można je jednak uporządkować pod względem wielkości, poddając roztwory otrzymane po reakcji sekwencjonowania rozdziałowi elektroforetycznemu. Sanger zastosował do tego wysokorozdzielczą elektroforezę żelową, umożliwiającą rozróżnienie nawet łańcuchów DNA różniących się tylko jednym nukleotydem. Im mniejsze są cząsteczki DNA, tym dalej wędrują podczas doświadczenia od ujemnej elektrody. Produkty czterech wariantów reakcji sekwencjonowania nanosi się na żel tuż obok siebie, aby łatwiej było je porównywać. Po przeprowadzeniu rozdziału cząsteczek DNA trzeba je uwidocznić. Do niedawna standardowym podejściem do tego było takie przeprowadzanie reakcji sekwencjonowania, aby jej produkty były radioaktywne (znakowane izotopowo); w takim przypadku do żelu elektroforetycznego należy przyłożyć kliszę fotograficzną (rentgenowską) i przez kilkadziesiąt godzin przeprowadzać jej naświetlanie. Ostatecznie uzyskuje się autoradiogram - obraz różnych frakcji DNA w formie ciemnych prążków na wywołanej kliszy. Najmniejszym cząsteczkom odpowiadają prążki położone najdalej od jednej z krawędzi kliszy (odpowiadającej miejscu naniesienia próbek na żel). Pozostaje wtedy przeprowadzenie analizy układu frakcji DNA. W przypadku sekwencjonowania powyższego przykładowego DNA zobaczylibyśmy gdzieś na autoradiogramie prążek odpowiadający frakcji złożonej z bardzo niewielkich, szybko wędrujących cząsteczek skopiowanego DNA. Powiedzmy, że dostrzeżemy go w linii rozdziału produktów reakcji typu G. Będzie to oznaczać, że produkty sekwencjonowania zawierają nukleotyd guaninowy gdzieś w niewielkiej odległości od primera. Powinniśmy wtedy odszukać na autoradiogramie prążek odpowiadający fragmentom DNA minimalnie dłuższym od analizowanych poprzednio (minimalnie dłuższe to dłuższe o jeden nukleotyd). Przy użyciu podanej tu przykładowej sekwencji taki minimalnie dłuższy fragment zostałby znaleziony wśród produktów reakcji typu A. Kojarząc wnioski z analizy obu sąsiednich prążków dojdziemy do wniosku, że produkty sekwencjonowania w pewnej niewielkiej odległości od primera zawierają kolejno nukleotydy G i A. Podobnie następne prążki (pod względem odległości od linii naniesienia prób) zobaczylibyśmy wśród produktów reakcji typu T, znowu wśród produktów reakcji T, potem reakcji typu A, C, G, T itd. W ten sposób uzyskujemy sekwencję nici DNA komplementarnej do tej, która była kopiowana w reakcji sekwencjonowania, odczytujemy kolejno nukleotydy coraz dalsze od primera. Ponieważ DNA składa się z dwóch wzajemnie komplementarnych do siebie nici, jest to zarazem gotowa sekwencja tej drugiej nici, komplementarnej do skopiowanej matrycy.

Część autoradiogramu uzyskanego w metodzie Sangera.

Jak wynika z powyższego, warunkiem odczytania sekwencji DNA, być może dość długiej, liczącej np. 400 - 600 nukleotydów jest wcześniejsze poznanie niewielkiego jej fragmentu (w idealnych warunkach mającego długość około 20 nukleotydów), tak by można było przygotować primer odpowiedni do tej matrycy. Problem ten jest często rozwiązywany w ten sposób, że badane, nieznane DNA wbudowuje się (przy pomocy enzymu ligazy) do pomocniczej cząsteczki DNA o znanej sekwencji, zwanej wektorem klonującym czy wektorem do klonowania DNA (genów). Przystępując do sekwencjonowania, dobiera się primer komplementarny do fragmentu wektora (znanego) sąsiadującego z nieznanym, badanym fragmentem DNA.

Istotnym elementem metody Sangera jest otrzymywanie populacji cząsteczek DNA będących komplementarnymi kopiami matrycy i zakończonych jednego rodzaju nukleotydem. Powielanie cząsteczki matrycowego (badanego) DNA przeprowadza się w mieszaninach reakcyjnych, zawierających wszystkie substraty niezbędne dla polimerazy DNA i jeszcze jeden substrat nietypowy. Składnikami typowymi, identycznymi we wszystkich wariantach tego doświadczenia są (poza samym matrycowym DNA i enzymem): primery, dATP, dCTP, dGTP, dTTP (2'-deoksyadenozynotrójfosforan itp., ogólnie dNTP), bufor nadający roztworowi odpowiednie pH i zawierający odpowiednie jony aktywatory - jony Mg²⁺. Ponadto jedna z probówek (wariant A) zawiera nietypowy nukleotyd ddATP (2',3'-dideoksyadenozynotrójfosforan). Podobnie jak dATP, również ddATP może być wykorzystane przez polimerazę DNA i jako ddAMP wbudowane do nowo tworzonej nici jako odpowiednik deoksytymidynomonofosforanu w cząsteczce matrycowej (ddATP przekształca się w ddAMP, bo produktem ubocznym tej reakcji jest wolny jon dwufosforanowy, zwany też pirofosforanem; ten produkt uboczny powstaje także w przypadku użycia przez enzym zwykłego dATP). Kiedy polimeraza DNA odczytuje w matrycy nukleotyd tyminowy, to ma do wyboru dATP i ddATP, jako surowce do wykorzystania. O tym który z tych nukleotydów zostanie przez enzym wykorzystany na danym etapie kopiowania decyduje przypadek. Jeśli przyłączony zostanie dAMP, to jako następny może zostać dowolny nukleotyd, zależnie od sekwencji matrycy. Jeśli wbudowany zostanie ddAMP, to żaden więcej nukleotyd nie zostanie już do tej cząsteczki przyłączony - proces kopiowania matrycy ulegnie zakończeniu. Jest tak dlatego, że w ddAMP cukrem jest 2',3'-dideoksyryboza, cząsteczka nie mająca grupy hydroksylowej przy trzecim atomie węgla, a ta właśnie grupa byłaby potrzebna do przyłączenia następnego nukleotydu. Podobnie mieszanina reakcyjna typu C zawiera poza dNTP, także ddCTP, mieszanina typu G - dNTP i ddGTP, a roztwór typu T - dNTP i ddTTP.

Modyfikacje metody Sangera:

• sekwencjonowanie cykliczne

• znakowanie fluorescencyjne.

SEKWENCJONOWANIE - SĄ JUŻ DO TEGO MASZYNY.

Sekwencjonowanie - metoda , dzięki której możliwe jest ustalenie sekwencji czyli określenie kolejności nukleotydów. Jeden z etapów analizy genu. Na podstawie sekwencji istnieje możliwość przewidzenia kolejności aminokwasów w białku , które jest kodowane przez dany gen.

Są dwie metody sekwencjonowania :

- Enzymatyczna - metoda Sangera

Na jednoniciowej matrycy syntetyzuje się in vitro DNA. Syteza przebiega od radioaktywnego , oligonukleotydowego startera komplementarnego do 3` końca matrycy. Reakcję wykonuje się równolegle w czterech probówkach , w których oprócz kompletu deoksytrifosforanów nukleotydów (dATP , dCTP , dTTP , dGTP) dodana jest niewielka ilość jednego z nich w postaci dideoksytrifosforanu nukleotydu , co uniemożliwia kontynuowanie reakcji w momencie włączenia takiego nukleotydu w syntetyzowany łańcuch , ponieważ brakuje wtedy grupy hydroksylowej na 3` końcu.


Synteza zostaje zahamowana losowo - powstaje mieszanina fragmentów o różnej długości.

Produkty reakcji poddawane są elektroforezie w czterech równoległych ścieżkach na żelu poliakrylamidowym. Pozwala to na ustalenie sekwencji nici komplementarnej do badanej.

- Chemiczna - metoda Maxama-Gilberta

Jest to metoda praktycznie już nie stosowana.

Polega na degradacji wyznakowanych na 5` końcu cząsteczek DNA związkami chemicznymi przecinającymi specyficznie wiązania fosfodiestrowe za nukleotydem odpowiadającym określonej zasadzie azotowej. Wynikiem reakcji jest zbiór fragmentów DNA o różnej długości co spowodowane jest takim doborem warunków , że w poszczególnych cząsteczkach przecinane jest tylko jedno lub dwa wiązania. Fragmenty z czterech niezależnych reakcji (dGTP , dGTP i dATP , dCTP , dCTP i dTTP) rozdziela się elektroforetycznie po czym poddaje autoradiografii. Prążki na autoradiogramie odpowiadają fragmentom DNA posiadającym na końcu 5` znakowany fosfor a na końcu 3` określoną zasadę.

Obydwie metody pozwalają na odczytanie sekwencji około 400 do 700 nukleotydów w jednym doświadczeniu. Jeśli sekwencjonujemy dłuższy odcinek należy go pociąć enzymem restrykcyjnym i ustalać sekwencję każdego fragmentu osobno.

---