Analiza żywności – kolokwium wykładowe częśd I

POJĘCIA PODSTAWOWE:

Żywność- (środki spożywcze), produkty roślinne i zwierzęce, które są przeznaczone do konsumpcji przez ludzi.

Pożywienie- produkty pochodzenia roślinnego i zwierzęcego, a także substancje syntetyczne, które w stanie naturalnym lub po obróbce kulinarnej są przyjmowane doustnie, trawione w przewodzie pokarmowym, wchłaniane do krwiobiegu i stają się źródłem naturalnej energii.

Do żywności nie zalicza się:

*pasz *żywych zwierząt

*roślin przed zbiorem *kosmetyków

*środków farmaceutycznych *tytoniu i wyrobów tytoniowych

*narkotyków

Dozwolone substancje- substancje nie spożywane, nie są typowym składnikiem żywności, które posiadają lub nie wartość odżywczą. Mogą stać się pośrednio lub bezpośrednio składnikami żywności, gdy ich użycie technologiczne jest uzasadnione i nie stwarza zagrożenia dla życia człowieka.

Główne substancje odżywcze:

-białka -tłuszcze

-węglowodany -witaminy

-mikro i makroelementy -woda

Analiza-postępowanie badawcze, polegające na fizycznym lub myślowym rozłożeniu całości na części i badaniu cech i właściwości składników.

Ocena – postępowanie polegające na wyznaczeniu stopnia zaspokojenia potrzeb lub oczekiwań przypisywanych danemu przedmiotowi lub zjawisku.

Sucha substancja- Przez suchą substancję danego produktu rozumiemy pozostałość po usunięciu wody.

• Zawartośd suchej substancji [%] = 100-zawartosd wody

• Zawartośd wody [%]= 100-zawartośd suchej substancji

W analityce rozróżnia się dwa pojęcia suchej substancji:

a) Sucha substancja całkowita – skałda się ze składników rozpuszczalnych w wodzie i substancji nierozpuszczonych np. celulozy

b) Sucha substancja rozpuszczalna – w wodzie czyli ekstrakt.

WODA – jest jednym z głównych składników surowców i produktów żywnościowych. Zawartość jej wpływa na jakość, wartość odżywczą i trwałość przechowalniczą, możliwość zbrylania, trwałość mikrobiologiczną, oraz zawartość odpowiednich parametrów przepływu lepkości.

W surowcach i produktach żywnościowych występuje jako woda:

• Wolna (rozpuszczalnik i wypełniacz wolnych przestrzeni)

• Związana

• Higroskopijna (powiększająca powierzchnię wolne produktu)

• Kapilarna (w naczynkach włoskowatych i podlegająca zjawiskom kapilarnym)

• Krystaliczna

• Konstytucyjna

Metody oznaczania wody w produktach spożywczych

• Termograwimetryczne (termicznego suszenia)

• Refraktometryczne

• Chemiczne (Fischera i pokrewne)

• densymetryczne

• Destylacji azeotropowej

• Spektrofotometryczne w bliskiej podczerwieni

• Dielektryczne

• Rezonansu NMR

1. Metoda termicznego suszenia- Polega na usunięciu wody z badanego materiału przez suszenie w podwyższonej temperaturze pod normalnym lub zmniejszonym ciśnieniem w warunkach umownych, w których pozostałe składniki nie ulegają rozkładowi i przy złażeniu że woda jest jednym składnikiem lotnym.

Większość produktów suszy się w temperaturze w temperaturze 100-105oC pod ciśnieniem normalnym 4-6h .

W przypadku produktów termostabilnych (zboża i ich przetwory) 130 oC przez 1-2h.

Produkty termolabilne stosuje się temperaturę 60-70 oC oraz obniżone ciśnienie (ok. 100mm Hg). Dużym usprawnieniem są wagosuszarki.

2. Metoda refraktometryczna- Opiera się na pomiarze współczynnika załamania światła (refrakcji) światła.

Wartość refrakcji stanowią :

• suma refrakcji poszczególnych atomów wchodzących w skład związku i ich udziałów procentowych,

• refrakcja grup funkcyjnych, wiązań, konfiguracji.

W wodnych roztworach cukrów prostych lub złożonych współczynnik refrakcji rośnie wraz ze wzrostem stężenia. Dla wody wynosi: nD20=1,3330 zaś dla sacharozy nD20=1,57.

Jeżeli w roztworach znajduje się kilka substancji o różnych współczynnikach załamania to refrakcji roztworu będzie wypadkowa tych współczynników załamania.

3. Metody chemiczne- umożliwiają oznaczenie całkowitej ilości wody, zarówno wolnej jak i związanej. Stosowane są dwie metody:

• Karla Fischera (oraz modyfikacje tej metody)

Oznaczenie polega na bezpośrednim miareczkowaniu metanolowego roztworu próbki badanego produktu odczynnikiem K. Fischera (metanolowy roztwór jodu, tlenku siarki (IV) i pirydyny) i obliczeniu procentowej zawartości wody na podstawie objętości odczynnika Fischera zużytego w trakcie miareczkowania. Warunkiem uzyskania prawidłowego wyniku jest nieobecność w produkcie innych substancji mogących reagowad ze składnikami odczynnikami Fischera adsorbującymi jod.

H2O + I2 + SO2 + 3C5H5N + CH3OH 2C5H5NHI + C5H5NSO4HCH3

Tlenek siarki (IV) redukuje jod w roztworze metanolu i pirymidyny stechiometrycznie do ilości wody w próbce; obecność pirymidyny jest konieczna do zobojętnienia nadmiaru kwasu sirkowego (VI) tworzącego się w początkowym etapie reakcji.

W praktyce mogą być stosowane 2 techniki postępowania:

• bezpośrednie miareczkowanie roztworu lub wyciągu metanolowego do chwili pojawienia się żółtego zabarwienia pochodzącego od nadmiernej kropli jodu,

• traktowanie wyciągu nadmiarową ilością odczynnika K. Fischera i odmiareczkowanie roztworu tego odczynnika standardowym roztworem metanolowym wody , do chwili zniknięcia żółtego zabarwienia.

Metoda Karla Fischera należy do bardzo dokładnych i zalecana jest zwłaszcza do materiałów zawierających niewielkie ilości wody. Daje nieco zawyżone wyniki w stosunku do metody suszarkowej (w reakcję wchodzi również woda chemicznie związana).

• Metoda z węglikiem wapnia.- Polega na pomiarze ilości wydzielonego acetylenu w reakcji węgliku wapnia (CaC2) z wodą.

CaC2 + 2H2O Ca(OH)2 +C2H2

Powstający w reakcji acetylen zbiera się ilościowo. Pomiary dokonuje się najczęściej w biurecie gazometrycznej nad stężonym roztworem chlorku potasu (KCl).

4. Metody destylacji azeotropowej- polega na oddestylowaniu wody z badanej próbki w postaci mieszaniny azeotropowej i zmierzeniu objętości wydzielonej wody z azeotropu po jej skropleniu.

5. Metody densymetryczne- polegają na przygotowaniu roztworu podstawowego i oznaczeniu jego gęstości, która na podstawie tablic przelicza się na zawartość ekstraktu.

CUKRY- to węglowodany, które są związkami C i H₂O oraz można je przedstawić za pomocą wzoru: Cn(H₂O)n.

Cukry dzielimy na:

• Monosacharydy (cukry proste) – nie ulegają hydrolizie do prostszych związków

• Disacharydy – powstają poprzez połączenie dwóch monosacharydów wiązaniem glikozydowym. Wiązanie to tworzy się pomiędzy anomerycznym atomem węgla jednego monosacharydu, a grupą hydroksylową drugiego.

• Polisacharydy – zawierają wiele monosacharydów połączonych wiązaniami glikozydowymi. Jednostki monosacharydowe mogą być powiązane liniowo lub tworzyć łańcuch rozgałęziony.

Monosacharydy (aldozy i ketozy)- obok licznych grup wodorotlenkowych posiadają grupę aldehydową –CHO lub ketonową =C=O np.: glukoza i fruktoza. Występują w dwóch formach:

*łańcuchowej, która dominuje w środowisku silnie zasadowym

*pierścieniowej, która dominuje w środowisku zbliżonym do obojętnego

Mutarotacja- zmiana wartości liczbowej kąta skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego. Występuje w większości sacharydów, zachodzi stosunkowo powoli.

Metody oznaczania cukrów

• Metody densymetryczne – opierają się na zależności między gęstością cieczy i zawartością sacharydu.

• Metody refraktometryczne – opierają się na pomiarze współczynnika światłą.

• Metody polarymetryczne – wykorzystują zdolnośd skręcania płaszczyzny przez cząsteczki sacharydów.

• Metody absorpcyjne – opierają się na pomiarze absorpcji związków barwnych powstających w wyniku reakcji chemicznej sacharydów.

• Metody chemiczne (miareczkowe) – wykorzystuje się właściwości redukcyjne sacharydów.

• Metody enzymatyczne

• Metody chromatograficzne (TLC, HPLC,GC)

1. Metody chemiczne (miedziowe) stosuje się do oznaczania:

• cukrów prostych i ich mieszanin,

• disacharydów redukujących i ich mieszanin,

• disacharydów nieredukujących po uprzedniej hydrolizie.

Metody te polegają najczęściej na redukcji soli miedzi (II) w środowisku alkalicznym przez cukry redukujące.

Uzyskane wyniki analizy interpretuje się następująco:

a) w przypadku indywidualnego węglowodanu np. laktozy w mleku, wynik oznaczenia jest równoznaczny z oznaczeniem jego zawartości w danym produkcie,

b) w przypadku mieszaniny cukrów prostych wynik oznaczenia jest wyrażany jako suma cukrów redukujących,

c) w przypadku mieszaniny cukrów redukujących i sacharozy wynik oznaczenia jest wyrażany jako suma cukrów redukujących występujących w analizie i zawartości cukrów redukujących powstałych z hydrolizy sacharozy do monosacharydów.

2. Metoda Fehlinga - polega na miareczkowym oznaczeniu ilości cukru redukującego w roztworze potrzebnej do całkowitej redukcji jonów miedzi Cu2+ zawartej w roztworze odczynników Fehlinga I i II o znanym mianie. (Koniec miareczkowania rozpoznaje się po zaniku barwy niebieskiej). Jest to metoda subiektywna.

Skład płynów Fehlinga:

I: 69,28 CuSO4 x 5 H2O/l

II: 346g winianu sodowo-potasowego i 100g NaOH/l

3. Metoda Lane-Eynona- Jest modyfikacją metody Fehlinga; różnica polega na dodaniu pod koniec miareczkowania błękitu metylenowego (wskaźnika) którego barwa zanika w momencie gdy w roztworze jony miedzi (II) przereagowały do Cu2O. Metoda ta jest powszechnie stosowana w przemyśle cukierniczym.

Oznaczenie polega na bezpośrednim miareczkowaniu wrzącej mieszaniny jednakowych objętości płynów Fehlinga I i Fehlinga II odpowiednio rozcieoczonym roztworem badanych cukrów (o stężeniu 0,1-0,4%), po uprzednim odbiałczeniu i klarowaniu próby za pomocą płynów:

• Carreza I (15% roztwór heksacyjanożelazianu (II) potasu)

• Carreza II (30% roztór siarczanu (VI) cynkU)

oraz przeprowadzonej hydrolizie, w obecności błękitu metylenowego jako wskaźnika odbarwiającego się po całkowitym zredukowaniu miedzi przez cukier obecny w roztworze. Pomiędzy stężeniem roztworu cukru i jego zużyciem nie ma zależności liniowej, gdyż zużyciu większej objętości roztworu odpowiada dłuższy czas miareczkowania oraz niższa alkalicznośd środowiska, i odwrotnie. Czynniki te wywierają wpływ na powstawanie tzw. reduktonów, co ma miejsce w podwyższonej temperaturze i środowisku alkalicznym. Obecnośd soli Seignetta, tj. winianu sodu i potasu, zapobiega wytrącaniu się wodorotlenku miedzi, co umożliwia prawidłowe przeprowadzenie redukcji miedzi.

4. Metoda Luffa-Schorla- Polega na miareczkowym oznaczeniu miedzi niezredukowanej w obecności tlenku miedziowego. W próbie zawierającej cukier redukujący na skutek zredukowania Cu2+ do Cu2O; ilość wydzielonego jodu jest mniejsza niż w próbie odniesienia. Różnica objętości zużytego tiosiarczanu potrzebna do odmiareczkowania wydzielonego jodu jest proporcjonalna do zawartości cukru.

Płyn Luffa Schoorla to odczynnik zawierający:

• Siarczan miedzi (II)

• Węglan potasu

Charakteryzuje się on wysoką selektywnością redukcji miedzi przez cukry oraz jednakowo szybko utlenia aldozy i ketozy.

POLARYMETRY- wykorzystuje się do nich światło monochromatyczne (lampy sodowe). Światło podlega polaryzacji w pryzmacie Nicola. Zasadą jego działania jest użycie dwóch nikoli lub polaroidów:

• Polaryzator- polaryzującego wiązkę cieplną

• Analizatora- ustalanie płaszczyzny polaryzacji po przejściu światła.

Metody polarymetryczne - wykorzystują zdolność skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego przez cząsteczki sacharydów, w których obecne są asymetryczne atomy węgla.

Atomami asymetrycznymi mogą być atomy pierwiastków czterowartościowych np. węgiel krzem, jeżeli wszystkie ich wartościowości są wysycone różnymi podstawnikami.

Skręcalność- miara aktywności optycznej- kąt skręcania płaszczyzny polaryzacji α_D, który otrzymuje się gdy promień światła spolaryzowanego przebiega drogę w środowisku skręcającym przy stężeniu 100g substratu w 100ml roztworu. Wyróżnia się prawoskretną (+) i lewoskrętną (-).

Wielkość kąta skręcania zależy od:

*rodzaju substancji i jej skręcalności c

*grubości warstwy t

*temperatury T

*długości fali użytego światła l

a= k * c * t

Zwykle pomiary dokonuje się w temperaturze 293K za pomocą linii D światła sodowego- w tych warunkach współczynnik „k” nosi nazwę skręcalności właściwej.

Wzór Biota- opisuje zależność liczbową między stężeniem roztworu cukru (p), kątem skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego (α) , a grubością roztworu (l) :

$$\mathbf{p =}\frac{\mathbf{100*\ \alpha}}{\mathbf{l*\lbrack}\mathbf{\alpha}_{\mathbf{D}}^{\mathbf{20}}\mathbf{\rbrack}}$$

Przygotowanie próbki do oznaczania cukrów Oprócz cukrów zdolność redukcji jonów miedzowych wykazują aldehydy, ketony, aminokwasy, białka, alkohole i kwas askorbinowy.

W celu oddzielenia substancji nie węglowodanowych redukujących jony Cu2+ stosuje się tzw. środki klarujące w postaci octanu ołowiawego lub sukcesywne dodawanie dwóch płynów Carreza tj. płyn I- 15% roztwór żelazocyjanku potasu oraz płyn II – 30% roztwór siarczanu cynku. Pod wpływem środków klarujących następuje strącenie osadów zwłaszcza aminokwasów i białek. Alkohole, głownie etanol, usuwa się z badanego roztworu poprzez odparowanie lub destylację.

Oznaczenie sacharozy w produktach cukrowniczych

• Polaryzacja bezpośrednia – metodę tę stosuje się do produktów i półproduktów cukrowniczych zawierających duży udział suchej substancji (charakteryzujących się wysoką czystością produktu).

• Polaryzacja inwersyjna – metodę tą stosuje się w celu wyeliminowania wpływu niecukrów na polarymetryczne oznaczenie sacharozy.

Skala cukrowa

26g sacharozy w kolbie o pojemności 100ml i spolaryzowana w rurce 200 mm daje polaryzację +100oS.

Ten sam roztwór (26g sacharozy/100 ml) po inwersji wykazuje polaryzację -33,5oS. Łączna zmiana wynosi 133,5oS.

Zatem można z prostej proporcji obliczyć zawartość sacharozy w badanej próbce:

100% ------------------------ 133,5 ^o S (bo tyle wynosi P-I dla czystej sacharozy)

S% ------------------------ P-I (suma bezwzględnych wartości polaryzacji)

$$\mathbf{S = \ }\frac{\mathbf{100\ (P - I)}}{\mathbf{133,5}}\mathbf{\ \lbrack\%\rbrack}$$

Oznaczenie skrobi metodą polarymetryczną- polega na uzyskaniu tzw. pseudoroztworu skrobi w środowisku stężonego kwasu solnego lub 50% roztworu chlorku wapnia o pH=2,5. Po przesączeniu pseudoroztworu na sączku, klarowny płyn przenosi się do rurki polarymetrycznej i mierzy kąt zmiany płaszczyzny polaryzacji.

Na podstawie pomiaru polarymetrycznego w oparciu o wzór Biota oblicza się zawartośd skrobi (X) w % z równania:

$$\mathbf{X =}\frac{\mathbf{\alpha*100}}{\mathbf{a*l*203}}$$

Gdzie:

a – odważka próbki w g

l– długość rurki polarymetrycznej [dm]

203o- skręcalność właściwa skrobi

BIAŁKA- zbudowane są z sekwencji 20 aminokwasów i co więcej tworzą liniowe polimery tych aminokwasów. Jako biopolimery posiadają szeroki zakres funkcji biologicznych. W naturalnych formach występują tylko jako L-aminokwasy i mogą być również zbudowane z wielu łańcuchów polipeptydowych. Są jednym z podstawowych składników odżywczych w produktach spożywczych, które są przedstawicielami związków azotowych. Stanowią podstawowy element budulcowy tkanek, wchodzą w skład enzymów i hormonów. Zawierają prawie stałą ilość azotu (15-18%).

Znaczenie współczynnik 6,25

Białka zawierają prawie stałą ilośd azotu, która wynosi (15-18%), przeciętnie natomiast 16%, co stanowi 6,25 wszystkich pierwiastków (100:16 = 6,25).

Metody oznaczania białek

Ilościowe oznaczenie zawartości białka można przeprowadzid:

• Metodami bezpośrednimi – polegającymi na wytrąceniu białka z roztworu i wagowym oznaczeniu wytrąconego osadu lub oznaczeniu refraktometrycznemu, nefelometrycznym lub kolorymetrycznym białek będących w roztworze. Należą do nich:

• Metoda biuretowa

• Metoda Lowry’ego

• Metoda Bradforda

• Spektrofotometria w zakresie nadfioletu

• Promieniowanie w zakresie podczerwieni

• Metody immunoenzymatyczne

• Metodami pośrednimi – opierającymi się na ilościowym oznaczeniu azotu i przeliczeniu go na białko. Zalicza się do nich metodę Kjeldahla.

Oznaczenie białka metodą Kjeldahla (należy do metod pośrednich) – polega na przeprowadzeniu mineralizacji produktu ze stężonym kwasem siarkowym VI „na mokro”, zalkalizowaniu roztworu, a następnie oddestylowaniu i ilościowym oznaczeniu powstałego amoniaku.

Spalanie – kolba Kjeldahla

Etap I – rozkład kwasu siarkowego z uwolnieniem tlenu

2H2SO4 2SO2 + O2 + 2H2O

Etap II – utlenienie substancji organicznych, w tym również związków azotowych z uwolnieniem dwutlenku wody i amoniaku

R-CH-COOH xCO2 + y H2O + z NH3

NH2

Etap III – utlenianie się dwutlenku węgla i wody ora przechodzenie amoniaku w siarczan (VI) amonu.

2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4

Aparat Parnasa - Wagnera

Etap IV – alkalizacja środowiska i wydzielanie się amoniaku

H2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2H2O

(NH4)2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + Na2SO4 + 2H2O + 2NH3

Etap V – destylacja amoniaku i jego zobojętnianie w roztworze kwasu solnego.

HCl + NH4OH NH4Cl + H2O

H3BO3 + NH4OH NH4H2 BO3

Miareczkowanie:

HCl + NaOH NaCl + H2O

Zawartośd białek w % oblicza się ze wzoru:

$$\mathbf{X =}\frac{\mathbf{6,25*14,01*}\left( \mathbf{a - b} \right)\mathbf{*f*n}}{\mathbf{100*c}}$$

Gdzie:

a – objętość w cm3 0,1M NaOH do zmiareczkowania 50 cm3 ok. 0,1M HCl – próba odniesienia

b – objętość w cm3 0,1M NaOH do zmiareczkowania nadmiaru kwasu w badanej próbie

n – stosunek objetości kolby miarowej do objętości poddanej destylacji c – naważka *g+

Skład odczynnika Tashiro:

• 0,002% roztwór czerwieni metylowej w 96% etanolu

• 3 cz. 0.1% wodnego roztworu błękitu metylenowego;

Metodą Kjeldehla oprócz białka mogą oznaczane też jony amonowe, grupy amidowe, ale nie mogą być oznaczane azotany, azotyny , pierścień aromatyczny.

Oznaczenie azotu białkowego i niebiałkowego

Azot występujący w badanym produkcie można podzielid na dwie frakcje:

• Azot białkowy

• Azot niebiałkowy

Metody stosowane do oznaczania tych frakcji azotu opierają się na wytrąceniu białek z badanego roztworu i określeniu ilości azotu w osadzie i przesączu. Azot oznaczony w osadzie odpowiada azotowi białkowemu. Azot oznaczony w przesączu odpowiada azotowi niebiałkowemu.

Do wytrącania białek stosuje się jony miedzi (II), ołowiu (II), cynku, żelaza (III), kwas trichlorooctowy, metafosorowy V, taninę oraz alkohol etylowy (zazwyczaj 70%).

Oznaczanie różnych rodzajów białka

• Białko surowe – otrzymujemy z wyliczenia azotu ogólnego

• Białko czyste – otrzymujemy z wyliczenia azotu białkowego

• Białko strawne (przyswajalne) – oblicza się z różnicy białka czystego i nieprzyswajalnego

• Białko nieprzyswajalne – oznacza się po trawieniu pepsyną i kwasem solnym.

Metoda biuretowa- Służy do oznaczania białek i peptydów zawierających co najmniej 2 wiązania peptydowe, które tworzą w środowisku alkalicznym barwne kompleksy z jonami miedzi. Zawartośd białka oznacza się przez pomiar zabarwienia roztworu przy długości fali λ=540 nm. Intensywność barwy w reakcji biuretowej jest proporcjonalna do liczny wiązao peptydowych.

Nazwa reakcji pochodzi od biuretu – związku powstającego w wyniku kondensacji dwóch cząsteczek mocznika, zawierającego w swej cząsteczce wiązania amidowe.

Stosowanie tej metody jest ograniczone obecnością soli amonowych, które również daje reakcje barwną z jonami miedzi; reakcji przeszkadza również siarczan (VI) magnezu, ponieważ wytrącający się w środowisku nierozpuszczalny wodorotlenek magnezu maskuje właściwy odczyn.

Metoda Lowry’ego- Jest to metoda kolorymetryczna oraz przebiega w 2 etapach:

1. Przyłączenie jonów miedzi do wiązao peptydowych (reakcja biuretowa).

2. Redukcja odczynnika Folina-Ciocalteu’a do barwnych tlenków przez tyrozynę, tryptofan, cysteinę i prawdopodobnie przez histydynę zawartych w oznaczanym białku. W wyniku reakcji powstaje barwny niebieski kompleks. Pomiar absorbancji wykonuje się przy długości fali750 nm.

Metody oznaczania białka oparte na wbudowaniu barwnika

• Barwniki organiczne jak np. oranż G, czero amidowa 10 B, mogą byd ilościowo wbudowane do białek. Barwniki i białko w pewnych warunkach, zwykle poniżej punktu izoelektrycznego reagują ilościowo tworząc nierozpuszczalne kompleksy, które można oddzielid przez wirowani.

• Natężenie barwy roztworu zależy od ilości barwnika niezwiązanego z białkiem (barwnik dodawany jest w nadmiarze) czyli jest odwrotnie proporcjonalne do ilości białka w analizowanej próbce.