Grzegorz Woźny 21.03.2011r.

Mateusz Makarewicz

Biologia

nr pary 4

74. Wyznaczanie stężenia substancji w roztworze metodą fluorescencyjną.

Reguła Kashy- Obserwowana fluorescencja lub fosforescencja niemal wyłącznie pochodzi od przejść z najniższego stanu wzbudzonego o danej multipletowości tzn. ze stanu S₁ lub T₁.

Wynika to z dużej szybkości bezpromienistej dezaktywacji (1012 s^-1) , znacznie większej niż

szybkość przejść promienistych rzędu 109 s^-1.

Przesunięcie Stokesowskie

W 1852 roku na podstawie takich obserwacji zostało sformułowane prawo, od nazwiska odkrywcy, nazwane prawem Stokesa, które mówi, że długość fali promieniowania fluorescencyjnego jest zawsze większa od długości fali promieniowania wzbudzającego fluorescencję.

Różnica energii pomiędzy pikiem absorpcji a pikiem emisji to przesunięcie Stokesa

Fotoluminescencja. Emisja światła przez zbiór cząsteczek, które znalazły się w energetycznym stanie wzbudzonym w wyniku absorpcji światła nazywa się fotoluminescencją. Jest to emisja spontaniczna. Średni czas życia (istnienia) cząsteczki w stanie wzbudzonym τ ≥ 10^-9s.

Weźmy pod uwagę wieloatomowe cząsteczki wybranego związku organicznego wykazującego fotoluminescencję. Niech związek będzie rozpuszczony w rozpuszczalniku nieluminezującym. Aby pobudzić substancję do świecenia należy oświetlić kuwetę z roztworem wiązką światła o długościach fal zakresu widma absorpcji charakterystycznego dla tego związku.

Oddziaływanie światła z cząsteczkami substancji należy rozpatrywać na podstawie teorii kwantowej. Zgodnie z tą teorią cząsteczki, po pochłonięciu odpowiedniego kwantu świetlnego hv, z zakresu widma widzialnego lub ultrafioletu, znajdują się w elektronowym stanie wzbudzonym na odpowiednim poziomie oscylacyjnym. Jest to stan energetycznie niestabilny S, w jakim znalazła się cząsteczka w wyniku optycznego wzbudzenia. Cząsteczka stara się więc oddać nadmiar energii, aby przejść do stanu stacjonarnego, odpowiadającego minimum energii w danych warunkach fizykochemicznych, czyli do stanu podstawowego S₀.

Z energetycznego stanu wzbudzonego S do stanu podstawowego S₀. Cząsteczki mogą przejść w różny sposób. Procesy absorpcji i emisji światła oraz deaktywacji energii optycznego wzbudzenia można zapisać następująco:

S₀+ hv_a → S absorpcja

gdzie:

v_a- częstotliwość światła absorbowanego,

h- stała Plancka

I S→ S₀+ Q rozpraszanie energii

II S+ W₀→ S₀+ W wygaszanie

W₀, W- stany energetyczne cząsteczki wygaszacza, odpowiednio w stanie wzbudzonym i podstawowym.

III S→S₀(P) fotoreakcje

Fotoluminescencja

IV S→S₀+ hv_f fluorescencja

S₁→T₁

V T₁→S₁ fluorescencja długożyciowa

S₁→S₀+ hv_fd

S₁→T₁

VI T₁→ S₀+ hv_fosf fosforescencja

Cząsteczka w elektronowym stanie wzbudzonym S może przekazać cząstekom otaczającym, np. cząsteczkom rozpuszczalnika, nadmiar energii jako ciepło (na sposób ciepła) w ilości Q i przejść do stanu podstawowego S₀. Nastąpi wtedy tzw. rozpraszanie energii (zależność I).

Jeżeli w bliskim otoczeniu cząsteczki S znajdzie się cząsteczka innej substancji w elektronowym stanie podstawowym W₀, która może przejść cały nadmiar energii cząsteczki w stanie S, to następuje przekazanie energii. Cząsteczka wygaszacza W₀ przechodzi do stanu wzbudzonego W. Proces ten nazywa się wygaszaniem fluorescencji (wygaszanie świecenia) lub rezonansowym przekazywaniem energii- zależność II.

Nadmiar energii w stanie wzbudzonym może być „wykorzystany” przez cząsteczkę na fotoreakcję, w której wyniku powstają fotoprodukty S₀(P)- zależność III.

Jeżeli powyższe przypadki deaktywacji energii optycznego wzbudzenia są mało prawdopodobne, to cząsteczka może wyemitować nadmiar energii w postaci kwantu hv_f (v_f- częstotliwość światła emitowanego). Jest to jeden z przypadków fotoluminescencji. Ten rodzaj fotoluminescencji nazywa się fluorescencją (zależność IV). Substancjami fluoryzującymi są często barwniki organiczne w roztworach ciekłych.

W odpowiednich warunkach cząsteczka może przejść ze stanu wzbudzonego S₁ do stanu metastabilnego (trójkowego, długożyciowego) T₁, charakteryzującego się wyraźnie dłuższym czasem życia niż stan S₁. Kosztem energii termicznej cząsteczek otaczających, może nastąpić powrót cząsteczki ze stanu T₁ do stanu S₁ i dopiero wtedy nastąpi przejście do stanu podstawowego S_0, połączone z emisją promieniowania zwaną fluorescencją długożyciową lub opóźnioną (zależność V). Powrót ze stanu długożyciowego T₁ do stanu S₁ może być utrudniony na przykład przez obniżenie temperatury lub „usztywnienie” środowiska. Wtedy następuje emisyjne przejście ze stanu T₁ do stanu S₀ i mamy do czynienia ze świeceniem zwanym fosforescencją (zależność VI).

Ze względu na mechanizm świecenia możemy więc fotoluminescencję cząsteczek podzielić na trzy rodzaje: fluorescencję, która zachodzi tylko przy udziale stanu singletowego S oraz fluorescencję długożyciową i fosforescencję, w których bierze udział stan metatrwały T. Zjawiska te można przedstawić graficznie za pomocą uproszczonego schematu dozwolonych stanów energetycznych wg Jabłońskiego, na którym pominięto dozwolone stany oscylacyjne i rotacyjne cząsteczek, a uwzględniono tylko stany elektronowe S_0, S i T:

Rys.1- Schemat dozwolonych stanów energetycznych wg Jabłońskiego.

Fluorescencja. W celu wyjaśnienia mechanizmu fluorescencji i poznania właściwości spektralnych światła emitowanego, należy rozpatrywać rozszerzony obraz stanów energetycznych zbioru cząsteczek. Mogą to być np. cząsteczki barwnika rozpuszczonego w wodzie. Aby nastąpiła fluorescencja, układ musi być wzbudzony światłem o częstotliwości z zakresu widma absorpcji barwnika. Cząsteczki absorbują różne kwanty energii, czyli znajdą się w różnych oscylacyjnych i rotacyjnych stanach energetycznych danego, elektronowego stanu wzbudzonego. Średni czas przebywania cząsteczki w elektronowym stanie wzbudzonym, czyli czas życia cząsteczki w elektronowym stanie wzbudzonym, jest rzędu 10^-9s. W tym przedziale czasowym cząsteczki przekazują otoczeniu, w sposób bezemisyjny, nadmiar energii oscylacyjnej i rotacyjnej w stanie wzbudzonym S₁ oraz, zazwyczaj przechodzą z wyższych elektronowych stanów wzbudzonych do stanu S₁. W wyniku tego, przed aktem emisji, wszystkie cząsteczki zdolne do fluorescencji znajdą się na zerowym poziomie oscylacyjnym pierwszego elektronowego stanu wzbudzonego S₁ (reguła Kashy). Podczas aktu emisji cząsteczki przechodzą do różnych stanów oscylacyjnych i rotacyjnych elektronowego stanu podstawowego S₀ (rys. 2). Zgodnie z zasadami mechaniki kwantowej zachodzi emisja różnych kwantów świetlnych z równym prawdopodobieństwem, czyli natężenie emitowanego światła o różnych długościach fal jest różne. Zależność natężenia fluorescencji F od częstotliwości v lub długości fali emitowanej λ(λ=$\frac{c}{v}$) nazywa się widmem fluorescencji F= f(λ).

Rys. 2

Widmo fluorescencji występuje w postaci pasma, które ma kształt podobny do krzywej Gaussa, przy czym od strony małych częstotliwości (dużych długości fal) zaznacza się wyraźne rozszerzenie pasma fluorescencji. Jak widać z rysunku Rys. 2, emitowane kwanty są zazwyczaj mniejsze od kwantów absorbowanych. Widmo fluorescencji jest więc przesunięte w stronę fal dłuższych w stosunku do najbardziej długofalowego pasma absorpcji (rys. 2). Tę prawidłowość zapisał Stokes w następującej postaci:

λ_f> λ_a

gdzie:

λ_f- długość fali odpowiadająca maksimum pasma fluorescencji

λ_a- długość fali odpowiadająca maksimum pasma absorpcji.

Widmo fosforescencji, jak wynika z rysunku 1, jest przesunięte w stronę fal dłuższych względem widma fluorescencji. Położenie widm fluorescencji i fosforescencji względem długofalowej części widma absorpcji w skali długości fal dla witaminy B₂ przedstawiono na rysunku 3. Jest to typowy przykład widm emisji dla wielu barwników organicznych w roztworach.

Rys. 3

Przedstawiony na rysunku 2 mechanizm fluorescencji wyraźnie wskazuje, że widmo fluorescencji jest charakterystyczne dla danej substancji w danych warunkach fizykochemicznych, stąd wniosek, że badania widma fluorescencji może być wykorzystane w analityce chemicznej do identyfikacji substancji, czyli w analizie jakościowej.

W spektralnej analizie jakościowej wykorzystuje się zależność zależenia fluorescencji (F) od stężenia substancji fluoryzującej w

Wartość natężenia fluorescencji zależy od ilości światła (P) oraz od kwantowej wydajności fluorescencji (η).

F= k ηP

gdzie:

k- stała układu pomiarowego

Wydajność kwantowa fluorescencji η jest to stosunek liczby kwantów emitowanych do liczby kwantów absorbowanych przez substancję fluoryzującą w danych warunkach fizykochemicznych.

Zgodnie z prawem absorpcji, ilość światła zaabsorbowanego P przez daną substancję w roztworze można wyrazić wzorem:

P= I₀^-I

gdzie:

I=I₀e^-μcl

stąd:

P= I₀(1-e^-μcl)

gdzie:

I₀- natężenie światła padającego na badaną próbkę

I- natężenie światła przechodzącego

μ- współczynnik absorpcji

c- stężenie substancji absorbującej

l- grubość warstwy

W praktyce spektroskopowej wykładnik potęgowy we wzorze P= I₀(1-e^-μcl) dla małych stężeń jest zazwyczaj mały. Po rozwinięciu e^x, gdzie: x= -μcl na szereg potęgowy mamy:

e^x= 1+ $\begin{matrix} \frac{x}{1!} + \frac{x^{2}}{2!} + \frac{x^{3}}{3!} + \text{...} \\ \\ \end{matrix}$

Wyraz trzeci i dalsze wyrazy w szeregu można pominąć jako bardzo małe, stąd:

e^-μcl = 1- μcl

Po wprowadzeniu molowego współczynnika absorpcji ε= μ lge, z zależności P= I₀(1-e^-μcl) i e^-μcl = 1- μcl otrzymuje się:

P= 2,3 I₀ εcl

Wyrażenie F= k ηP na natężenie światła fluorescencji F dla małych stężeń substancji fluoryzującej przyjmie więc postać:

F= 2,3 kηI₀εcl

Stąd wniosek, że w danych warunkach fizykochemicznych dla danej substancji, natężenie fluorescencji F jest wprost proporcjonalne do stężenia c substancji fluoryzującej w roztworze:

F c

Zależność ta jest wykorzystywana w analityce chemicznej do ilościowego oznaczania substancji. Jeżeli badana substancja wykazuje fluorescencję w roztworze, a rozpuszczalnik oraz ewentualne domieszki nie fluoryzują, to fluorescencyjna metoda wyznaczania stężenia substancji w roztworze polega na porównaniu natężenia fluorescencji badanego roztworu z natężeniem fluorescencji roztworu tej samej substancji o znanym stężeniu. W tym celu należy zbadać zależność natężenia fluorescencji F od stężenia c badanej substancji w roztworach wzorcowych. Stosuje się roztwory wzorcowe o kilku różnych stężeniach w zakresie małych stężeń. Zakres ten można wyznaczyć doświadczalnie dla każdej substancji w danym rozpuszczalniku. Zasadą przygotowania roztworów wzorcowych jest, by badana substancja w roztworach wzorcowych znajdowała się w takich samych warunkach fizykochemicznych jak w roztworze badanym. Jeżeli warunek ten jest spełniony, to wykres funkcji F= f(c), czyli tzw. krzywa wzorcowa, będzie linią prostą. Po przygotowaniu krzywej wzorcowej należy zmierzyć natężenie fluorescencji roztworu badanego w tych samych warunkach wzbudzenia i z krzywej wzorcowej odczytać stężenie badanej substancji w roztworze.

Podczas badania fluorescencji barwników wzbudzamy je zazwyczaj w zakresie najbardziej długofalowego pasma absorpcji, które leży w przedziale widzialnym widma. Jak wynika ze wzoru

F= 2,3 kηI₀εcl, natężenie fluorescencji dla danej próbki zależy od natężenia światła wzbudzającego I₀ oraz molowego współczynnika absorpcji ε.

Aby uzyskać wzbudzenie najbardziej efektywne, należy badany roztwór oświetlić światłem o długości fali zbliżonej do maksimum pasma absorpcji, tak by iloczyn I₀* ε osiągnął wartość maksymalną. Zakres wzbudzenia, który spełnia ten warunek, można określić z zależności natężenia fluorescencji od długości fali wzbudzającej λ_wzb. Zależność F( λ_wzb) wyznacza się doświadczalnie. Jest to widmo wzbudzenia.

Metoda pomiaru fluorescencji. Do badania fluorescencji służy układ przedstawiony na rysunku 4. Fluorescencję wzbudzamy światłem ze źródła (Z), przechodzącym przez monochromator (M). Światło o danej długości fali pada na kuwetę (K) napełnioną roztworem barwnika fluoryzującego. Światło emitowane po przejściu przez filtr (R) odbieramy w kierunku prostopadłym do wiązki wzbudzającej za pomocą fotopowielacza (FP) z zasilaczem (ZW). Fotopowielacz odbiera całkowite światło fluorescencji wysyłane w danym kierunku i przetwarza sygnał świetlny na sygnał elektryczny, który odczytuje się na mikroamperomierzu (A). Natężenie prądu fotoelektrycznego (i) fotopowielacza jest proporcjonalne do natężenia fluorescencji F:

i=BF

gdzie:

B- współczynnik proporcjonalności, który ma stałą wartość w danych warunkach doświadczalnych.

W ten sposób pomiary zmian fotoprądu (i) dla roztworów o różnych stężeniach lub dla różnych długości fal wzbudzających pozwalają wyznaczyć w jednostkach względnych zmiany natężenia fluorescencji (F).

W doświadczeniu wykorzystano metodę fluorescencyjną do wyznaczania stężenia witaminy B₂ (ryboflawiny) w roztworze wodnym oraz oznakowania zawartości tej witaminy w serwatce. Serwatkę poddano wstępnej obróbce chemicznej, aby substancją odpowiedzialną za fluorescencję w badanym przedziale spektralnym była witamina B_2.

Wykonanie pomiaru:

1. Sprawdzić prawidłowość połączenia układu pomiarowego w obecności prowadzącego ćwiczenia. Na zasilaczu wysokiego napięcia ZW ustawić pokrętło polaryzacji na zero. Mikroamperomierz ustawić na odpowiedni zakres.

2. Włączyć układ do sieci 220 V. Na zasilaczu ustawić wartość napięcia właściwego dla użytego fotopowielacza. Włączyć napięcie zasilające fotopowielacz przez naciśnięcie włącznika „sieć”.

3. Przygotować 6 roztworów wzorcowych przez rozcieńczenie wodnego roztworu ruboflawiny o c₀= 5*10^-5 M.

4. Roztwór ryboflawiny o największym stężeniu wlać do probówki do ¼ jej objętości i wstawić do przystawki pomiarowej.

5. Ustawić pokrętło monochromatora (M) na długość fali λ= 420nm. Odczytać wskazania mikroamperomierza – prąd (i)

6. Zmieniać długość fali wzbudzającej o 5 nm w granicach 420 ≤ λ≤ 470. kolejno odczytywać i. Wyniki zestawić w pierwszej zamieszczonej pod tekstem tabelce. Wykreślić zależność natężenia fotoprądu (i) od długości fali wzbudzającej- widmo wzbudzenia. Zaznaczyć długość fali, której odpowiada największe natężenie fotoprądu (i).

7. Ustawić pokrętło monochromatora na długość fali wyznaczonej w punkcie 6.

8. Do przystawki pomiarowej wstawić probówkę z roztworem wzorem o stężeniu c_1. Odczytać prąd (i).

9. Dla pozostałych roztworów wzorcowych wykonać pomiary jak w pkt 8. Wyniki zestawić w drugiej zamieszczonej pod tekstem tabelce.

10. Wykonać pomiar natężenia fotoprądu dla roztworu witaminy B₂ o nieznanym stężeniu c_x.

11. Zmierzyć natężenie fotoprądu dla serwatki. Odpowiednio przyrządzone próbki serwatki otrzymuje się od prowadzącego ćwiczenia.

12. Wykreślić krzywą cechowania. Z otrzymanego wykresu odczytać stężenie c_x oraz stężenie witaminy B₂ w serwatce.

λwzb (nm)	410	420	430	435	440	445	450	455	460	470	480	490	500
Natężenie fotoprądu (i)

L.p.	c (M/l)	i (μA)	cx
1 2 3 4 5 6 7 8