Zakład Biofizyki Obliczeniowej i Bioinformatyki
Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii
Uniwersytet Jagielloński

Geny markerowe i reporterowe

Filip Bartnicki

Celem inżynierii genetycznej jest zmiana materiału genetycznego określonych komórek prowadząca do nabycia przez nie nowych wcześniej nie posiadanych cech. Podczas eksperymentu transformacji/transfekcji bierze udział olbrzymia liczba komórek, niestety tylko ułamek procenta z nich ulegnie modyfikacji na skutek pobrania DNA. Aby szybko i łatwo określić które komórki pobrały DNA , bez konieczności sprawdzania każdej z nich stosuje się tzw. geny markerowe. Są one dołączane do wybranych fragmentów DNA a następnie tak zbudowany konstrukt umieszczany jest w komórce docelowej. Produkty tych genów mogą być w sposób szybki i łatwy wykryte co pozwala na bezproblemową identyfikację transformantów. Geny reporterowe mogą spełniać podobną funkcję, lecz mają one jeszcze jedno niezwykle ważne zadanie: pozwalają na pomiar aktywności takich elementów genetycznych jak np. sekwencje promotorowe.

Definicja genu markerowego i reporterowego

Często zdarza się, iż pojęcia gen markerowy i gen reporterowy są używane naprzemiennie. Jednak istnieje między nimi różnica wynikająca z ich zastosowania. Geny określamy markerowymi, gdy mają posłużyć do rozróżnienia między komórkami transformowanymi, a nie transformowanymi ( np. gen kodujący β-galaktozydazę „blue-white screening”). Natomiast geny określamy reporterowymi, gdy ich aktywność służy badaniu innego genu np. badanie aktywności promotora przez poziom ekspresji genu kodującego beta galaktozydazę, ale mogą być też użyte do rozróżniania kolonii.

Geny markerowe

1 Markery selekcyjne

Marker selekcyjny będzie chronił komórkę przed działaniem szkodliwego czynnika, który normalnie zabiłby lub zablokował jej wzrost. Stąd też po zastosowaniu substancji selekcyjnej na hodowlę, wzrost podejmą tylko te komórki, które posiadają gen markerowy, a tym samym pożądany fragment DNA. Najczęściej stosowanymi związkami selekcyjnymi są antybiotyki (zwłaszcza w przypadku bakterii i roślin). Tego typu zabiegi są również stosowane do oceny czy organizmy potomne nie utraciły interesującego badacza genu. Aby się o tym przekonać wystarczy spryskać je roztworem antybiotyku. Przeżyją tylko te z zachowanym genem.

Rysunek 1. Selekcja roślin potomnych o porządanych cechach: [http://biotka.mol.uj.edu.pl/biotechnology/download/BT141_04.pdf źródło]

Przykłady markerów selekcyjnych:

• Neomycyny fosfotransferaza II (NPT II)

3’-fosfotransferaza II aminoglikozydów jest najszerzej stosowanym w transformacji roślin markerem selekcyjnym. Enzym kodowany przez gen nptII inaktywuje przez fosforylację dużą ilość antybiotyków aminoglikozydowych, takich jak: kanamycyna, neomycyna, paromycyna. Najczęściej stosowana jest kanamycyna. Na pożywce zawierającej odpowiednie antybiotyki wyrosną tylko rośliny zawierające gen nptII.

• Fosfotransferaza hygromycyny (działa podobnie jak NPT II , celem jest hygromycyna)

• Acetylotransferaza gentamycyny (działa podobnie jak poprzednie, ale inaktywacja zachodzi na drodze acetylacji antybiotyku.)

• Fosfotransferaza streptomycyny (SPT)

Streptomycyna w przypadku roślin nie powoduje śmierci komórek, tylko ich blaknięcie, podczas gdy komórki odporne pozostają zielone ( gen kodujący SPT używany jest także jako gen reporterowy)

• Odporność na bleomycynę

Komórki roślin nie posiadają naturalnej odporności na ten glikopeptydowy antybiotyk. Powoduje on powstawanie przerw w jedno i dwuniciowym DNA. W celu zapewnienia oporności stosuje się geny kodujace BBP (bleomycin binding protein).

2 Marker różnicujący

Marker różnicujący będzie powodował zmianę w wyglądzie komórek transformowanych np. zmiana zabarwienia kolonii, emisja światła.

Przykłady :

• β-galaktozydaza

Enzym ten jest hydrolazą, katalizuje hydrolizę β-galaktozydów w monosacharydy. Pochodzi z bakterii Escherichia coli, kodowany przez gen lacZ. Jest najczęściej stosowanym markerem różnicującym w genetyce molekularnej. W wektorze używanym do transformacji znajduje się N-końcowy fragment genu lacZ. Natomiast w organizmie biorcy fragment C-końcowy. W wyniku współdziałania obu elementów powstaje w pełni aktywny enzym. W eksperymencie transformacji interesujący badacza fragment DNA jest umieszczany w obrębie sekwencji N-końcowej genu lacZ co automatycznie powoduje jego uszkodzenie. Aby wykryć w komórkach obecność enzymu umieszcza się je na pożywce zawierającej X-gal ( 5-bromo-4-chloro-3-indolylo-β-D-galaktozyd), w przypadku obecności beta galaktozydazy będzie można zaobserwować pojawienie się niebieskiego produktu ( 4-chloro-3-bromo-indygo)powstałego w wyniku cięcia X-gal, oznaczać to będzie, iż biorca przyjął plazmid, ale pusty (bez wstawki). Jeśli natomiast niebieski produkt nie powstanie to można wnioskować, iż eksperyment zakończył się sukcesem ( bakteria pobrała plazmid ze wstawką). Omawiany test nosi nazwę α-komplementacji.

Rysunek 2. Test α-komplementacji: [http://www.edvotek.com/images/211.jpg źródło]

• Białko zielonej fluorescencji (GFP)

Białko po raz pierwszy wyizolowane z meduzy Aequorea victoria, kodowane przez gen gfp. Własności bioluminescencyjne związane są z występowaniem we wnętrzu białka chromoforu zbudowanego z sześciu reszt aminokwasowych : N - Phe64 - Ser - Tyr - Gly - Val - Gln69 - C z czego kluczową rolę odgrywają ulegające autokatalitycznej cyklizacji reszty Ser65-Tyr66-Gly67. In vivo fluorescencja zachodzi na drodze dostarczenia energii przez fotoproteinę aktywowaną jonami wapnia, ale w warunkach laboratoryjnych w celu indukcji świecenia stosuje się światło UV. Obecnie w handlu dostępne są gotowe plazmidy z genem gfp jako markerem wystarczy, więc w takim wektorze umieścić żądaną wstawkę i dokonać transformacji bakterii. W celu identyfikacji transformantów stosuje się światło UV, kolonie zmodyfikowane będą świecić na jasnozielony kolor. Na drodze mutagenezy punktowej uzyskano wiele odmian barwnych białka. Omawiany gen może być także markerem w organizmach roślin i zwierząt.

Rysunek 3. Różnorodność barw mutantów GFP: [http://migg.files.wordpress.com/2007/10/gfpbeach.jpg źródło]

Geny reporterowe

W przeciwieństwie do markerów selekcyjnych, geny reporterowe nie powodują odporności komórek transformowanych przeciwko szkodliwym związkom chemicznym niszczącym komórki nieodporne. Mogą jednak działać na podobnej zasadzie co markery różnicujące, częstymi są także przypadki w których pewne geny ( np. gfp , lacZ) można by zaliczyć do obu grup. Gen reporterowy jest łączony z sekwencją która ma być badana np. potencjalne miejsca promotorowe, otwarte ramki odczytu . Koduje on białko, które może być wykryte bezpośrednio( np. emisja światła), lub jego aktywność jest rozpoznawana w wyniku reakcji enzymatycznej prowadzącej do powstania łatwo wykrywalnego produktu ( np. zmiana koloru) Należy pamiętać o tym, że dany gen może zostać zastosowany w badaniach, jedynie gdy określona komórka/kolonia nie posiada genów kodujacych białko homologiczne do tego użytego jako reporter.

W wyniku wzrostu aktywności badanej sekwencji ( np. uaktywnienie promotora) następuje ekspresja genu reporterowego kodującego odpowiednie białko, a aktywność białka mierzy się za pomocą technik:

1. Autoradiograficznych

2. Spektrofotometrycznych

3. Chemi- i bioluminescencyjnych

Im wyższa aktywność - tym większa produkcja białka a w związku tym silniejszy sygnał.

Cechy dobrego genu reporterowego:

1. Produkt powinien być łatwo wykrywalny

2. Powinna istnieć metoda ilościowego oznaczenia aktywności białka kodowanego przez ten gen

3. Aktywność powinna być wykrywana in situ w czasie rzeczywistym

4. Próby wykrywania aktywności nie powinny być związane ze zniszczeniem próbki

Przykłady genów reporterowych:

• GFP

Białko to może zostać użyte jako reporter, w celu badania aktywności określonych promotorów. Ze względu na bogatą paletę barw, stabilność i znikomą toksyczność jest najczęściej stosowanym genem reporterowym.

Rysunek 4. Aktywność promotorów genów raka wyznakowanych GFP - tydzień 1: [http://www.metamouse.com/GFP%20models.html źródło]

Rysunek 5. Aktywność promotorów genów raka wyznakowanych GFP - tydzień 3: [http://www.metamouse.com/GFP%20models.html źródło]

• β-galaktozydaza

• Lucyferaza

Gen kodujący lucyferazę jest odpowiedzialny za bioluminescencję organizmów takich jak np: bakterii gatunku Vibrio harveyi (geny luxA i luxB), robaczka świętojańskiego Photinus pyralis ( gen Pp Luc) czy jamochłona morskiego Renilla reniformis (gen Rr Luc). Lucyferaza bakteryjna katalizuje przekształcenie FMNH₂ , 0₂ i RCHO ( długołańcuchowy aldehyd; minimum 8 atomów węgla) w produkty którymi są FMN , RCOOH , H₂O i światło o długości fali 478-505nm. Lucyferaza robaczka świętojańskiego katalizuje przekształcenie ATP , lucyferyny i O₂ w produkty: AMP , PP_i , CO₂ , H₂O oksylucyferynę i światło o długości fali 562nm. Wydajność lucyferazy świetlików jest znacznie wyższa niż bakteryjna, ponadto występuje w formie monomeru co jest dodatkowym atutem skłaniającym genetyka do wyboru właśnie genu Pp Luc , dlatego też w dalszej części tekstu skupiono się tylko na nim. Substrat (lucyferynę) można aplikować na kilka sposobów. Komórki można umieścić na kilka minut w roztworze substratu. Do tkanek i całych roślin substrat może być podawany przez korzenie (wystarczy umieścić go w pożywce hodowlanej) jest to jednak sposób czasochłonny, dlatego też najwygodniejszą i najczęściej stosowaną metodą jest spryskiwanie roślin roztworem substratu z dodatkiem łagodnego detergentu. W takiej sytuacji świecenie można zaobserwować już po kilkudziesięciu minutach. Wszystkie wyżej wymienione geny lucyferazy można wykorzystać do badania ekspresji genów zarówno w pojedynczych komórkach (roślinnych i zwierzęcych) jak i całych organizmach nie stosując metod prowadzących do zniszczenia obiektu badań. Istotną zaletą jest także możliwość dokładnego pomiaru ilości wyemitowanych fotonów za pomocą luminometru.

Rysunek 6. Aktywność lucyferazy w siewkach: [http://www.life.uiuc.edu/bohnert/projects/lucif.jpg źródło]

• Β-glukuronidaza ( GUS )

Gen bakteryjny uidA zwany popularnie „genem GUS” koduje hydrolazę która rozszczepia szeroką gamę glukuronidów. Substraty dla GUS są dostępne dla metod : spektrometrycznych , fluorymetryczny a także histochemicznych. Metody spektrometryczne wykorzystują p-nitrofenylo-β-D-glukuronid. Bardziej czułe metody fluorymetryczne wykorzystują 4-metyloumbelliferyloglukuronid (4-MUGluc) który rozkładany jest do niebieskiego produktu 4-metyloumbelliferonu. Obie metody mogą być wykorzystane w celu oznaczania ilościowego tylko dla ekstraktów komórkowych. Natomiast w metodach histochemicznych jako substrat stosuje się 5-bromo-4chloro-3-indolylo-β-D-glukuronid (X-Gluc). Bezbarwny, rozpuszczalny w wodzie substrat przekształcany jest przez enzym w nierozpuszczalny produkt o barwie niebieskiej. Opisywany gen jest bardzo często stosowany w badaniach ekspresji genów roślinnych - ze względu na łatwy pomiar ilościowy, wysoką specyficzność (zmniejszenie wartości błędu pomiarowego) oraz wysoką czułość. Ciekawostką jest możliwość wykorzystania omawianego genu u roślin, mimo obecności genu homologicznego w ich komórkach. Jest to możliwe dzięki różnicy w optimach pH dla obu enzymów (roślinny pracuje w niższych a bakteryjny w wyższych stężeniach jonów wodorowych). GUS może być także wykorzystywany do badania alg, grzybów i większości bakterii.

Rysunek 7. Roślina niebieska wykazuje aktywność GUS: [http://www2.biologie.fu-berlin.de/lampart/gp03/gus1.jpeg źródło]

• Acetylotransferaza chloramfenikolu (CAT)

Acetylotransferaza chloramfenikolu kodowana jest przez gen cat jest jednym z najszerzej i najczęściej stosowanym genem reporterowym we wszelkich komórkach eukariotycznych. Enzym prokariotyczny, który katalizuje przeniesienie grup acetylowych z Acetylo-CoA na chloramfenikol w ten sposób go inaktywując. Pomiar aktywności może być przeprowadzony jako ilość inaktywowanego chloramfenikolu w odpowiednim przedziale czasowym. Zaletami tego reportera są : wysoka stabilność enzymu, wysoka czułość metody oraz co być może najważniejsze brak konkurencji ze strony enzymów endogennych.

• Neomycyny fosfotransferaza II (NPT II)

Aktywność kodowanego enzymu w tkankach może być oznaczona metodą enzymatyczną w której kanamycyna i ATP (ze znakowanym radioaktywnie fosforem) są używane jako substraty. Fosforylowane aminoglikozydy są wykrywane przy pomocy chromatografii cienkowarstwowej.

Bibliografia

1. http://zguw.ibb.waw.pl/resources/Blok3_skrypt.pdf

2. http://biotka.mol.uj.edu.pl/biotechnology/download/BT141_04.pdf

3. „Plant selectable markers and reporter genes” Alicja Ziemienowicz, Plant Protection and Biotechnology Labolatory, Department of Biotechnology, University of Gdańsk.Poland

4. http://en.wikipedia.org/wiki/Reporter_gene

5. http://en.wikipedia.org/wiki/GUS_reporter_system

Kategorie: Genetyka|Biologia Molekularna

Articles: Bartnicki07 (last edited 2011-02-15 23:04:58 by localhost)