Sprawozdanie z laboratorium biologii
Temat: Własności białek, cukrów i tłuszczy.
Zadanie 1. Rozdział chromatograficzny aminokwasów hydrolizatu włosów ludzkich
Wstęp teoretyczny:
Chromatografia jest techniką analityczną i preparatywną wykorzystującą rozdzielanie mieszanin substancji na poszczególne składniki, bądź ich grupy (frakcje), dzięki różnicom w zachowaniu się tych składników w układzie dwóch faz, w których jedna nie zmienia swego położenia (faza nieruchoma, stacjonarna), druga zaś porusza się względem pierwszej w określonym kierunku (faza ruchoma, roztwór rozwijający). W zależności od dominującego mechanizmu procesu rozdziału wyróżniamy chromatografię jonowymienną, adsorpcyjną, podziałową, żelową.
Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) jest odmianą chromatografii podziałowej. Fazę nieruchomą stanowi woda zatrzymana w cienkiej warstwie sorbenta typu krzemionki lub tlenku glinu, naniesionej na płytkę szklaną. Fazą ruchomą jest rozpuszczalnik wędrujący przez tę warstewkę na zasadzie sił kapilarnych. Substancje rozdzielane, naniesione na płytkę, po której następnie posuwa się rozpuszczalnik, rozdzielają się na zasadzie podziału między fazę nieruchomą na sorbencie a fazę rozpuszczalnika. Gdy ich współczynniki podziału są różne, następuje rozdzielenie. Wielkością charakteryzującą substancję w określonym układzie chromatografii bibułowej lub chromatografii cienkowarstwowej jest wielkość Rf (współczynnik retencji) zdefiniowana, jako stosunek drogi, którą od punktu startowego na bibule lub płytce przebyła dana substancja „a” do drogi, którą w tym samym czasie przebył rozpuszczalnik „b”:
Rf=a/b
Przebieg doświadczenia:
Na płytce do chromatografii TLC pokrytej silikażelem oznaczono linie startu i miejsca naniesienie roztworów aminokwasów. W pewnych odstępach umieszczano kolejno aminokwasy: walina, cysteina, fenyloalanina, lizyna, tyrozyna, kwas glutaminowy, arginina, glicyna, histydyna, cystyna oraz hydrolizat włosów ludzkich za pomocą kapilar. Płytkę włożono do komory chromatograficznej i zanurzono w eluencie. Po upływie 2 godzin front eluentu zbliżył się do brzegu płytki. Następnie zaznaczono linię mety i osuszono płytkę w wysokiej temperaturze ok. 110°C. Spryskano roztworem ninhydryny i ponownie wysuszono. Wysuszone plamki zostały obrysowane ołówkiem w celu wyznaczenia ich odległości od linii startu.
Wykorzystując wzór współczynnika retencji można zidentyfikować skład aminokwasowy włosów ludzki.
Obserwacje:
Na wysuszonej płytce chromatograficznej odległości (a) poszczególnych aminokwasów wyniosły:
b= 7, 3 cm
Walina 2, 1 cm, Rf=0,287671
Cysteina 3, 5 cm, Rf=0,479452
Fenyloalanina 0, 7 cm, Rf=0,09589
Lizyna 3, 3 cm, Rf=1,571429
Tyrozyna 1, 4 cm, Rf=0,191781
Kwas glutaminowy 0, 8 cm, Rf=0,109589
Arginina 1, 1 cm, Rf=0,150685
Glicyna 0, 7 cm, Rf=0,09589
Cystyna 2, 1 cm, Rf=0,287671
Poszczególne odległości hydrolizatu włosów na płytce wyniosły kolejno: 0,7cm, 1,4cm, 2,5cm, 3,5cm.
Wnioski:
Aminokwasy występujące w hydrolizacie włosów ludzkich to fenyloalanina, tyrozyna, glicyna.
Zadanie 3. Odczyn barwny wiązanie peptydowego – próba biuretowa
Wstęp teoretyczny:
Test biuretowy polega na dodaniu do analizowanej mieszaniny roztworu fosforanu miedzi(II) lub siarczanu(VI)miedzi(II) oraz NaOH lub KOH. Przy obecności odpowiednich protein roztwór zmienia barwę z jasnoniebieskiej, wynikającej z obecności hydratowatowanych jonów Cu2+, na intensywnie fioletowy kolor na skutek powstawania złożonych związków kompleksowych, w których jon Cu2+ jest kompleksowany przez minimum dwie grupy peptydowe.
Przebieg doświadczenia:
W czterech próbówkach umieszczono kolejno ok. 2 ml: wody destylowanej, 0,5% roztworu glicyny, 0,5% roztworu peptonu, 0,5% roztworu albuminy. Do każdej probówki dodano ok. 2 ml roztwory wodorotlenku sodu i wymieszano. Następnie dodano ok. 15 kropli 0,1% roztworu siarczanu miedzi (II), aż do pojawienia się zabarwienia.
Obserwacje:
W próbówce pierwszej i drugiej roztwór przyjął jasnoniebieską barwę. W probówce trzeciej i czwartej roztwór zabarwił się na kolor jasnofioletowy.
Wnioski:
Próba biuretowa dała pozytywny wynik w probówce trzeciej i czwartej. Pepton i albumina są białkami i posiadają w swojej budowie wiązania peptydowe.
Zadanie 4.Wykrywanie wolnych grup aminowych za pomocą ninhydryny.
Wstęp teoretyczny:
Ninhydryna jest organicznym związkiem chemicznym powszechnie używany, jako wskaźnik chemiczny do wykrywania aminokwasów i amin pierwszorzędowych. W reakcji z amoniakiem i pierwszorzędową grupą aminową aminokwasów, peptonów, polipeptydów, amin oraz innych związków zawierających grupę NH2 tworzy barwne związki - żółte, różowe, niebieskie. Barwa produktu zależy od struktury substratu aminowego i może być wskazówką analityczną.
Przebieg doświadczenia:
Do sześciu probówek dodano kolejno ok. 2 ml: wody destylowanej, 0,5% roztworu glicyny, 0,5% roztworu peptonu, 0,5% roztworu kazeiny, 0,5% roztworu żelatyny, 0,5% roztworu albuminy. Następnie do każdej probówki dodano ok. 0,5 ml 0,1% roztworu ninhydryny. Wszystkie probówki włożono do wcześniej przygotowanej łaźni wodnej (95°C) i wyjęto po upływie 5 minut.
Obserwacje:
W probówce pierwszej roztwór pozostał bezbarwny. W probówce drugiej roztwór przyjął granatowe zabarwienia, w trzeciej fioletowe, w czwartej jasnofioletowe, w piątej pozostał bezbarwny, natomiast w szóstej wytrącił się biały osad a roztwór nad osadem miał granatowy kolor.
Wnioski:
Barwne roztwory powstałe w probówce drugiej, trzeciej, czwartej i szóstej dały pozytywny wynik reakcji z ninhydryną stosowaną, jako wskaźnik. Glicyna, pepton, kazeina i albumina posiadają w swojej budowie wolną grupę aminową NH2.
Zadanie 5. Rozpuszczalność polisacharydów.
Wstęp teoretyczny:
Polisacharydy (wielocukry) to węglowodany złożone zawierające więcej niż 10 cząsteczek monosacharydów. Są bardzo słabo rozpuszczalne w wodzie oraz w innych rozpuszczalnikach organicznych, są bez zapachu i smaku, dają typowe koloidalne roztwory, optycznie czynne, są niekrystaliczne.
Przebieg doświadczenia:
Do trzech probówek wsypano kolejno niewielką ilość: agaru, celulozy, skrobi. Następnie dodano ok. 2 ml wody destylowanej. Po zanotowaniu obserwacji probówki włożono do łaźni wodnej (95°C) na 5 minut.
Obserwacje:
We wszystkich trzech probówkach po dodaniu wody na dnie pozostał biały osad. Po ogrzaniu probówek w pierwszej z nich powstał żel, a drugiej i trzeciej na dnie wciąż widoczny był biały osad.
Wnioski:
We wszystkich 2 probówkach osad w wodzie nie rozpuścił się. Widocznie zmiany zaszły w probówce pierwszej dopiero po ogrzaniu. Agar, celuloza i skrobia wykazują właściwości polisacharydów.
Zadanie 6. Własności redukcyjne cukrów.
Wstęp teoretyczny:
Cukry redukujące so to cukry posiadające właściwości redukujące. Należą do nich wszystkie węglowodany, które dają pozytywny wynik w reakcji z odczynnikami Trommera, Tollensa, Benedicta i Fehlinga. Reakcja z tymi odczynnikami polega na ich redukcji wolnymi grupami karbonylowymi.
Próba Fehlinga służy do wykrywania cukrów redukujących i aldehydów. Do badanego roztworu dodaje się równe ilości roztworu siarczanu miedzi i alkalicznego roztworu winianu sodu. Całość gotuje się, a ewentualna obecność ceglastoczerwonego osadu tlenku miedzi świadczy o obecności aldehydu lub cukru redukującego. Formaldehyd jest tak silnym reduktorem, że powoduje wytrącenie metalicznej miedzi. Próba Fehlinga jest właściwie zmodyfikowaną próbą Trommera, różnica polega na tym, że w tej próbie wodorotlenek miedzi(II) jest w postaci kompleksu z winianem, przez co jest lepiej rozpuszczalny i reaktywniejszy.
Próba Benedicta służy do wykrywania cukrów redukujących i czasem aldehydów. Odczynnik Benedicta to mieszanina siarczanu miedzi i przesączonej mieszaniny uwodnionego cytrynianu sodu z uwodnionym węglanem sodu. Odczynnik Benedicta dodaje się do roztworu i doprowadza do wrzenia. Duże stężenie cukrów redukujących lub aldehydu powoduje powstanie czerwonego osadu tlenku miedzi, mniejsze żółtego osadu. Jest to znaczne udoskonalenie próby Trommera.
Przebieg doświadczenia:
Próba Fehlinga:
W siedmiu probówkach zmieszano 1 ml roztworu Fehlinga I i 1 ml roztworu Fehlinga II. Do tak przygotowanych probówek dodano kolejno 1 ml: wody destylowanej, roztworu glukozy, roztworu fruktozy, skrobi, roztworu sacharozy, roztworu maltozy, roztworu laktozy i wymieszano. Wszystkie probówki włożono na 5 minut do łaźni wodnej (95°C).
Próba Benedicta:
Do siedmiu probówek dodano ok. 5 ml roztworu Benedicta. DO probówek dodano kolejno 1 ml: wody destylowanej, roztworu glukozy, roztworu fruktozy, skrobi, roztworu sacharozy, roztworu maltozy, roztworu laktozy i wymieszano. Wszystkie probówki włożono do łaźni wodnej (95°C) na 5 minut.
Obserwacje:
W próbie Fehlinga:
W pierwszej probówce roztwór przyjął barwę zielona, w drugiej wytrącił się czerwony osad i ceglasty roztwór unoszący się nad osadem, w trzeciej pomarańczowy roztwór, w czwartej wytrąciła się błękitna zawiesina, w piątej ceglasty osad i jasnoniebieski roztwór nad osadem, w siódmej pomarańczowy osad i szary roztwór nad osadem.
W próbie Benediecta:
W pierwszej probówce roztwór zabarwił się na niebiesko, w drugiej wytrącił się czerwony osad, w trzeciej ceglasty osad, w czwartej zielononiebieski osad, w piątej roztwór zabarwił się na niebiesko, w szóstej wytrącił się czerwony osad, w siódmej czerwony osad i brązowy roztwór nad osadem.
Wnioski:
w probówkach z glukozą, fruktozą, maltozą i laktozą podczas próby Fehlinga i Benediecta powstał czerwony/ceglasty osad na dnie probówki. Doświadcza to, że są to cukry redukujące dające pozytywny wynik obu tych prób.
Zadanie 7. Zawartość skrobi i cukrów redukujących w komórkach spichrzowych roślin.
Wstęp teoretyczny:
Obecność skrobi można wykryć używając w doświadczeniu płynu Lugola lub roztworu jodku potasu. W obecności skrobi badany produkt przyjmie granatowe lub ciemno fioletowe zabarwnienie.
Przebieg doświadczenia:
Do czterech probówek włożono kolejno niewielkie ilości: ryżu, celulozy, skrobi, sucharka. Do każdej z nich dodano ok. 2 ml wody destylowanej. Probówki ogrzano w łaźni wodnej (95°C) przez 5 minut. Następnie po ostudzeniu dodano do probówek 5 kropli płynu Lugola. Do kolejnych czterech probówek dodano taka samą ilość ryżu, celulozy, skrobi i sucharka oraz wody destylowanej. Do każdej z nich dodano ok. 5 ml roztworu Benedicta i ogrzano przez 5 minut w łaźni wodnej (95°C).
Obserwacje:
Płyn Lugola:
W probówce pierwszej, trezciej i czwartej roztwór przyjął grananową barwę. Barwa ryżu i sucharka nie zmieniła się. W probówce ze skrobią i celulozą wydzielił się biały osad w postaci żelu.
Próba Benediecta:
W próbówce pierwszej ziarenka stały się brązowe, w drugiej wytrącił się pomarańczowy osad, w trzeciej na dnie powstał biały żel i niebieski roztwór nad nim, w czwartej sucharek przyjął pomarańczowe zabarwienie.
Wnioski:
Pozytywny wynik próby Lugola zaświadcza o zawartości skrobi w ryżu i sucharku. Próba Benediecta udowadnia, że ryż i sucharek nie zawierają cukrów redukujących, a skrobia i celuloza nie są ckrami redukującymi.