Sprawozdanie z laboratorium biochemii.

Ćwiczenie 3. Właściwości białek i kwasów nukleinowych. Reakcje charakterystyczne.

Zadanie 1. Wykrywanie aminokwasów w reakcji z ninhydryną.

Wykonanie: do czterech probówek zawierających kolejno po 1 ml:

-1 % hydrolizatu białka,

- 1% roztworu glicyny,

- 1% roztworu proliny,

- 1% roztworu żelatyny,

dodano 0,5 ml etanolowego roztworu ninhydryny, a następnie probówki zostały ogrzane w łaźni wodnej.

Obserwacje: roztwory z probówek zawierających roztwór hydrolizatu białka i glicyny po dodaniu ninhydryny i ogrzaniu zabarwiły się na niebiesko, roztwór z żelatyną na jasno fioletową barwę, natomiast z proliną na pomarańcz.

Wnioski: aminokwasy reagują z ninhydryną za pomocą wolnych grup aminowych, w przypadku białek grupy aminowe są połączone z grupą karboksylową za pomocą wiązania peptydowego, jak w przypadku proliny, więc nie obserwuje się zabarwienia na kolor fioletowy, tak jak w przypadku probówek zawierających roztwory z wolną grupą aminowa. Im w roztworze występuje większa ilość wolnych grup aminowych, tym barwa roztworu jest ciemniejsza.

Zadanie 2. Wykrywanie białek i aminokwasów aromatycznych metodą

ksantoproteinową.

Wykonanie: do probówek zawierających kolejno po 1 ml:

Do probówek odmierzyć kolejno po 1 ml:

- 1 % hydrolizatu białka,

- 2% roztworu albuminy,

- 1% roztworu tryptofanu

- 1% roztworu glicyny

Dodano taką samą ilość stężonego kwasu azotowego, po ogrzaniu w łaźni wodnej i ochłodzeniu dodano po 3,5 ml NaOH.

Obserwacje: roztwory zawierające następujące związki, po zakończeniu doświadczenia były zabarwione:

- 1 % hydrolizatu białka- intensywny żółty

- 2% roztworu albuminy – lekko żółty,

- 1% roztworu tryptofanu – czerwony,

- 1% roztworu glicyny – brak zabarwienia roztworu.

Wnioski: metoda ksantoproteinowa służy do wykrywania aminokwasów aromatycznych, w których do pierścienia benzenowego przyłącza się grupa nitrowa dając żółte do czerwonego zabarwienie roztworu. Roztwór zawierający glicynę podczas nitrowania nie zabarwił się, co świadczy o tym, że glicyna nie posiada pierścienia aromatycznego.

Zadanie 3. Wytrącanie białek jonami metali ciężkich.

Wykonanie: do jednej probówki zawierające albuminę dodano parę kropel octanu ołowiu, natomiast do drugiej probówki również zawierającej albuminę dodano parę kropel chlorku rtęciowego.

Obserwacje: w probówce zawierającej octan ołowiu zaobserwowano mętny osad, natomiast w probówce z chlorkiem rtęciowym jedynie niewielkie zmętnienie roztworu.

Wnioski: octan ołowiu zawiera resztę kwasową pochodzącego od słabego kwasu, natomiast chlorek rtęciowy od mocnego, dlatego wartość pH w probówce z octanem ołowiu jest większa od wartości pI, co prowadzi co reagowania białek z metalami ciężkimi tworząc trudno rozpuszczalne kompleksy. Zmętnienie świadczy o denaturyzacji białka spowodowane działaniem metalu ciężkiego.

Zadanie 4. Wytrącanie białek etanolem.

Wykonanie: w dwóch probówkach zmieszano etanol z kurzym białkiem, do pierwszej probówki natychmiast po wytrąceniu osadu dodano wody, natomiast do drugiej probówki woda została dodana po upływie 30 minut po wytrąceniu osadu.

Obserwacje: w pierwszej probówce po rozcieńczeniu wodą powstał klarowny roztwór, natomiast w drugiej powstał nierozpuszczalny w wodzie osad.

Wnioski: działanie alkoholem na białko powoduje dehydratacje otoczki białkowej, wypadanie białka z roztworu, a następnie denaturyzacje w jego obrębie, jeżeli działanie alkoholu na białko jest dostatecznie krótkie można odwrócić proces denaturyzacji białka.

Zadanie 5. Wysalanie białek

Wykonanie: (1) Do roztworu kurzego białka dodano nasycony siarczan amonowy, po wytrąceniu osadu dodano wody.(2) W elermajerce zmieszano taką samą ilość białka kurzego i nasyconego siarczanu amonowego, następnie przesączono, a do przesączu dodawano siarczan amonu aby uzyskać roztwór nasycony, ponownie przesączyć roztwór i sprawdzono na obecność białek (przy pomocy kwasu octowego).

Obserwacje: w pierwszej probówce po dodaniu roztworu siarczanu amonowego wytrąca się kłaczkowaty osad globulin, który po dodaniu wody ulega rozpuszczeniu. W drugiej części doświadczenia zaobserwowano zmętnienie roztworu po dodaniu kwasu octowego.

Wnioski: zaobserwowane zmętnienie świadczy o obecności białka, co oznacza że część białek pochodzących z białka kurzego wciąż została w roztworze. W pierwszej części doświadczenia po dodaniu wody uległ rozpuszczeniu, oznacza to że wysalanie białek jest procesem odwracalnym.

Zadanie 6. Próba Taubera z benzydyną na pentozy.

Wykonanie: Do roztworu benzydyny w lodowatym CH₃COOH dodano 2-3 krople pentozy, heksozy i kwasu nukleinowego. Następnie podgrzano w łaźni wodnej. Po wyjęciu probówki oziębiamy i dodano wody.

Obserwacje: w probówkach z pentozą i kwasem nukleinowym roztwory zabarwiły się na czerwono, natomiast w probówce z heksozą na żółto-brązowy kolor.

Wnioski: Próba Taubera pozwala wykryć pentozy wolne, a także związane w kwasach nukleinowych.