Transkrypcja u prokariotów

W organizmach prokariotycznych można wyróżnić trzy etapy transkrypcji: inicjację, elongację i terminację. Syntezy wszystkich rodzajów RNA dokonuje jedna polimeraza RNA, zbudowana z kilku podjednostek. Polimeraza RNA E. coli ma pięć podjednostek: dwie α, jedną β, jedną β’ oraz jedną podjednostkę σ (ααββ’σ). Taką formę enzymu nazywamy holoenzymem. Podjednostka σ może oddysocjować od pozostałych podjednostek, co prowadzi do powstania formy określanej jako rdzeń enzymu. Podczas transkrypcji te dwie formy polimerazy RNA pełnią różne role.

Inicjacja - Transkrypcja nie może się rozpoczynać od przypadkowego miejsca na DNA – miejscem startu musi być początek genu. Sygnały do zainicjowania transkrypcji są zawarte w sekwencji zasad promotora, położonego bezpośrednio przed sekwencją genu ulegającemu transkrypcji. Promotor zawiera specyficzne sekwencje nukleotydów działające jako miejsca przyłączenia się polimerazy RNA. Dwa elementy sekwencji rozpoznawane przez polimerazę RNA u E. coli są określane jako sekwencja -10 oraz sekwencja -35. W różnych promotorach te sekwencje mogą się trochę różnić, ale wszystkie odpowiadają tzw. sekwencji zgodnej -10 i -35. Za rozpoznanie i wiązanie się polimerazy RNA z promotorem jest odpowiedzialna podjednostka σ, rozpoznająca kasetę -35. Przy braku tej podjednostki enzym wciąż jeszcze może się wiązać z DNA, ale wiazanie to ma przypadkowy charakter. Po związaniu się enzymu z promotorem powstaje najpierw zamknięty kompleks promotorowy (zamknięty kompleks inicjujący), w którym odcinek DNA stanowiący promotor pozostaje w postaci dwuniciowej helisy. Enzym wiąże się z DNA na odcinku około 60 pz, obejmującym kasety -10 i -35. Aby rozpoczęła się transkrypcja, dwuniciowa helisa ulega dysocjacji w rejonie kasety -10 bogatej w pary A-T, tworząc otwarty kompleks promotorowy. Podjednostka σ oddysocjowuje od otwartego kompleksu, pozostawiając rdzeń enzymu. Równocześnie dwa pierwsze rybonukleotydy wiążą się z DNA, tworzy się pierwsze wiązanie fosfodiestrowe i w ten sposób zostaje zainicjowana transkrypcja.

Elongacja - Podczas elongacji polimeraza RNA przesuwa się wzdłuż cząsteczki DNA i w miarę przemieszczania się – topi i rozplata dwuniciową helisę. Enzym dołącza nukleotydy do końca 3’ rosnącego łańcucha RNA w kolejności dyktowanej przez ułożenie zasad w matrycowej nici DNA. W większości przypadków najpierw transkrypcji ulega sekwencja liderowa o różnej długości w różnych genach, a dopiero po niej – sekwencja kodująca genu. Na drugim końcu sekwencji kodującej również znajduje się odcinek nie kodujący aminokwasów, określany jako niekodująca sekwencja 3’ końcowa i dopiero po niej transkrypcja się kończy. Podczas transkrypcji w danym czasie rozpleceniu ulega tylko niewielki odcinek dwuniciowej helisy. Rozplataniu ulega odcinek DNA o długości 12-17 par zasad. Na długości około 12 zasad rosnący RNA jest sparowany z nicią matrycową rozplecionego odcinka DNA. Rozplataniu ulega tylko krótki fragment DNA, ponieważ rozplatanie jednego rejonu wymusza większą częstość skrętów rejonu przyległego, a to powoduje tworzenie się napięć w cząsteczce DNA. Aby pokonać tę trudność, w miarę zachodzącej syntezy, RNA zostaje oddzielany od matrycy DNA, a DNA ponownie odtwarza strukturę dwuniciowej helisy.

Terminacja - Terminacja traskrypcji nie jest przypadkowa i zachodzi w określonych miejscach znajdujących się w pewnej odległości za sekwencją kodującą genu. U E. coli do terminacji dochodzi przy sekwencjach palindromowych. Sekwencje te wykazuja symetrie polegającą na tym, że ich pierwsza połowa jest dokładnie komplementarna do drugiej. W jednoniciowej cząsteczce RNA umożliwia to tworzenie się komplementarnych par zasad między dwoma następującymi po sobie odcinkami łańcucha, czyli tworzenie się struktury określanej jako spinka lub struktura typu nasada-pętla. Działa ona jako sygnał terminacji. W niektórych przypadkach za sekwencją tworzącą spinkę w DNA znajduje się ciąg reszt A, które tworzą słabe pary zasad z resztami U w transkrypcje. Przyjmuje się, że polimeraza RNA pauzuje tuż za strukturą spinki oraz że słabe pary A-U powodują odłączenie transkryptu od matrycy. W innych przypadkach nie występuje ciąg reszt A i działa inny mechanizm, polegający na wiązaniu się białka Rho (σ), które zrywa pary zasad między matrycą a transkryptem, gdy polimeraza pauzuje za strukturą spinki. Terminacja transkrypcji obejmuje oddzielenie się od matrycy transkryptu i polimerazy RNA, która następnie ponownie asocjuje z podjednostką σ i przechodzi do kolejnej rundy transkrypcji.

Transkrypcja u eukariontów - U eukariontów transkrypcja zachodzi w podobny sposób jak u prokariotów. Etap inicjacji jest jednak bardziej skomplikowany, terminacja nie polega na tworzeniu się spinki terminacyjnej, a transkrypcje katalizują trzy enzymy (polimerazy RNA I, II i III), z których każdy transkrybuje inny zestaw genów i funkcjonuje w nieco odmienny sposób.

Polimeraza RNA II - Enzym ten transkrybuje geny kodujące białka. Wiazanie się polimerazy RNA II z promotorem wymaga kilku różnych elementów sekwencji paromotorowych oraz udziału szeregu białek, nazywanych czynnikami transkrypcyjnymi. Promotor zwykle (ale nie zawsze) zawiera element sekwencji DNA określany jako kaseta TATA, stanowiący miejsce przyłączenia się polimerazy RNA II. Element ten ma sekwencję zgodną 5’TATA(A/T(A(A/T)3’ połozona w odległości około -25 pz od miejsca startu transkrypcji. Jego funkcja polega na ulokowaniu polimerazy RNA w położeniu właściwym do rozpoczęcia transkrypcji. Przyłączenie polimerazy do kasety TATA odbywa się z udziałem szeregu czynników transkrypcyjnych specyficznie współpracujących z tą polimerazą, oznaczonych jako TFIIA, TFIIB itd. Czynniki te wiążą się z DNA w pobliżu kasety TATA i tworzą rodzaj platformy, z którą łączy się polimeraza RNA II. Czynniki transkrypcyjne przyłączają się do promotora w określonym porządku. Jako pierwszy wiąże się czynnik TFIID, nastepnie czynnik TFIIA i dalej TFIIB. Następnie dołącza się polimeraza RNA II, a po niejTFIIF, E, H i J, razem tworza one funkcjonalny kompleks, zdolny do zainicjowania transkrypcji. Geny, które nie mają kasety TATA, w pobliżu miejsca startu transkrypcji mogą zawierać alternatywny element inicjujący. Transkrypcja takich genów jest zwykle mało wydajna, a do inicjacji transkrypcji dochodzi w kilku różnych miejscach. Często takie geny zawierają sekwencje bogate w pary GC znajdujące się w odległości 100-200 pz przed miejscem startu transkrypcji. Na transkrypcje genów wpływa także szereg innych elementów promotora, mających charakterystyczne, zgodne sekwencje. Sekwencje te działają jako miejsca wiązania innych czynników transkrypcyjnych regulujących transkrypcję przez stymulację lub represję inicjacji. Przykładem takich sekwencji może być kaseta CCAAAT znajdywana w niektórych genach przed kasetą TATA. Wiele genów zawiera też sekwencje wzmacniające (enhancerowe), które znacznie stymulują transkrypcję. Sekwencje te znajdują się poza miejscem promotorowym, często w dużej odległości od genu i działają w sposób niezależny od orientacji w stosunku do genu. Podobnie ulokowane w genomie są też sekwencje wyciszające (ang. silencers), które hamują transkrypcję.

Polimeraza RNA I - transkrybuje trzy spośród czterech genów kodujących rybosomowe RNA (18S, 28S, i 5,8S rRNA). Promotor rozpoznawany przez ten enzym ma dwa ważne elementy sekwencji konieczne do efektywnej transkrypcji: element rdzeniowy pokrywający się częściowo z miejscem startu transkrypcji oraz element kontrolny, ulokowany w odległości około 100 pz przed miejscem startu. Sekwencje te wiażą polimerazę RNA I oraz współdziałające z nią czynniki transkrypcyjne. Sekwencja rdzeniowa (ang. core sequence) warunkuje zajście transkrypcji, zaś sekwencja kontrolna uczestniczy w symulacji szybkości jej inicjacji. Sygnałem terminacji jest sekwencja zgodna o długości 18 pz, znajdująca się 600 pz poniżej końca genu.

Polimeraza RNA III - Enzym ten transkrybuje geny kodujące transportujący RNA i 5S rRNA. Sekwencje promotorowe rozpoznawane przez polimerazę RNA III są o tyle niezwykłe, że występują w obrębie sekwencji kodującej genów, poniżej miejsca startu transkrypcji. Są to tak zwane wewnętrzne regiony kontrolne (ICR – ang. internal control regions) i są zlokalizowane w obrębie do 100 nukleotydów poniżej miejsca startu transkrypcji. Gen 5S rRNA zawiera sekwencje określaną jako kaseta C, która działa jako miejsce wiązania czynników transkrypcyjnych i polimerazy RNA III. Ważna jest także, położona przed nią druga sekwencja, nazywana kasetą A. W genach tRNA ICR występuje w postaci dwóch silnie zachowawczych sekwencji, określanych jako kasety a i B, które razem stanowią miejsce wiązania czynników transkrypcyjnych i polimerazy RNA III. Terminacja transkrypcji katalizowanej przez polimerazę RNA III nastepuje w miejscu DNA rozpoznawanym przez enzym i zawierającym ciąg reszt A, zlokalizowanym w niewielkiej odległości za końcem genu.

Struktura tRNA - Cząsteczki tRNA zawierają od 74 do 95 nukleotydów. Między komplementarnymi częściami łańcucha polinukleotydowego tworzą się pary zasad, co prowadzi do powstania charakterystycznej dla cząsteczek tRNA drugorzędowej struktury liścia koniczyny. „Liść koniczyny” składa się z kilku struktur o charakterze spinki RNA. Są to: Ramię akceptorowe utworzone wskutek sparowania zasad końców 5’ i 3’ tRNA. Sekwencja CCA, występujaca na 3’ końcu nie jest jednak sparowana i stanowi miejsce przyłączenia aminokwasu. Ramię D albo DHU jest strukturą spinki zawierającą nasadę i pętlę, w której znajduje się dihydrouracyl, zasada nietypowa dla RNA. Ramię antykodonowe, odpowiedzialne za rozpoznanie i wiązanie się z kodonem w mRNA. Ramię dodatkowe albo zmienne, występujące tylko w niektórych tRNA. Może być małe i zawierać tylko 2-3 nukleotydów (tRNA klasy I) lub wieksze, w którym znajduje się 13-21 nukleotydów i do pięciu par zasad w nasadzie ramienia (tRNA klasy II) Ramię TφC nazywane też ramieniem rybotymidynowym, zawiera sekwencję TφC , w której φ jest modyfikowaną zasadą, zwaną pseudouracylem.

Synteza i dojrzewanie - Informacyjny RNA, powstający w komórkach eukariotycznych na drodze transkrypcji genów kodujących białka katalizowanej przez polimerazę RNA II, podczas translacji stanowi bezpośrednią matrycę do syntezy białka. Sekwencje kodujące eukariotycznych genów, zawarte są w serii eksonów, są nieciągłe, porozdzielane sekwencjami niekodującymi – intronami. Transkrypcji ulegaja zarówno sekwencje eksonowe, jak i intronowe genu, co prowadzi do powstania cząsteczki prekursorowej, określanej jako pre-mRNA. Przekształcenie się pre-mRNA w matrycę do syntezy białka polega na szeregu etapów dojrzewania prowadzącej do ostatecznej formy cząsteczki mRNA. Niekodujące sekwencje intronowi zostają usunięte w procesie określanym jako splicing, co zapewnia ciągłość sekwencji kodujących i decyduje o tym, że mRNA jest dokładną matrycą do syntezy białka. Ponadto koniec 5’ mRNA zostaje zmieniony przez przyłączenie zmodyfikowanego nukleozydu (tworzy się struktura określana jako czapeczka – ang. cap), a koniec 3’ ulega modyfikacji polegającej na przyłączeniu ogona złożonego z nukleotydów adenylowych (do 250 reszt A) w procesie określanym jako poliadenylacja. RNA powstający z udziałem polimerazy RNA II występuje w jądrze jako populacja cząsteczek o różnej długości (co odzwierciedla różnice wielkości genów) i różnych stadiach dojrzewania, którą określa się jako heterogenny jądrowy RNA (hnRNA – ang. heterogeneus nuclear RNA). w Komórkach prokariotycznych mRNA nie ulega procesom dojrzewania, a jego translacja rozpoczyna się jeszcze przed zakończeniem się transkrypcji. Prokariotyczne geny normalnie nie zawierają intronów, splicing jest więc nie potrzebny.

Splicing - Proces ten zachodzi w jadrze i polega na usunięciu z pre-mRNA intronowych sekwencji niekodujących, dając mRNA, w których sekwencje kodujące, odpowiadające eksonom, stanowią jeden nieprzerwany ciąg. Po splicingu dojrzały mRNA jest eksportowany do cytoplazmy, gdzie funkcjonuje jako matryca do syntezy białka. Splicing katalizuje grupa małych jądrowych rybonukleoprotein (snRNP – ang. small nuclear ribonucleoproteons). Składają się one z małych jadrowych RNA (snRNA) bogatych w U (U RNA), skompleksowanych z białkami. Istnieje wiele różnych cząsteczek snRNP, ale najliczniej występują U1, U2, U3, U4, U5, i U6, które katalizują reakcje splicingu.

Blokowanie końca 5’ - Końce 5’ eukariotycznych mRNA podlegają zmianie określanej jako synteza czapeczki, polegającej na przyłączeniu zmodyfikowanego nukleozydu – 7-metyloguanozyny. Czapeczka jest przyłączana do pre-mRNA przez enzym guanylotransferazę, który łaczy GTP z pierwszym nukleotydem mRNA poprzez nietypowe wiązanie 5’→5’ trifosforanowe. Następnie enzym określany jako metylotransferaza, łączy grupę -CH3 z azotem 7 pierścienia guaniny oraz zwykle także z grupami 2’ hydroksylowymi reszt rybozy następnych dwóch nukleotydów. Blokowanie końca 5’ przez czapeczkę chroni mRNA przed ich degradacją przez endonukleazy w cytoplazmie oraz stanowi sygnał umożliwiający rozpoznanie przez rybosom początku cząsteczki mRNA.

Inicjacja transkrypcji - Jako inicjację określa się zdarzenia zachodzące w obrębie promotora, a także daleko położonych rejonów zwanych enhancerami (wzmacniaczami), które umożliwiają polimerazie II RNA podjęcie działania. W przeciwieństwie do prokariontów u polimeraza II RNA wymaga do zapoczątkowania reakcji obecności pewnych białek, które określa się mianem czynników transkrypcyjnych tzw. TF-ów (ang. transcription factors). Białka te w określonym porządku wiążą się do DNA w obrębie promotora, enhancerów bądź silencerów. To właśnie ich obecność lub brak w danej komórce decyduje w znacznej mierze o rozpoczęciu lub też nie transkrypcji konkretnego genu. Oprócz białek na transkrypcję mogą również wpływać hormony. Należy tu jednak zaznaczyć, że jakkolwiek TF-y są istotne w regulacji ekspresji informacji genetycznej, tak najważniejsza jest struktura chromatyny. Wiadomo, że aby zaszła transkrypcja danego genu musi mieć do niego dostęp "aparat enzymatyczny". Jeśli gen jest łatwo dostępny i komórka dysponuje odpowiednimi TF-ami, transkrypcja zachodzi. Jeżeli natomiast gen jest "ukryty" przed polimerazą nic nie pomoże obecność optymalnego zestawu czynników transkrypcyjnych. To, czy dany gen jest łatwo czy trudno dostępny zależy od tego jaka jest struktura chromatyny w rejonie, w którym występuje. Im silniejsza jest jej kondensacja tym mniejsza możliwość przyłączenia enzymu. Okazuje się, że w różnych tkankach różne rejony DNA są mocno skondensowane (sheterochromatynizowane). Tak więc, jeżeli wiadomo, że konkretny gen w danej tkance nie ulega transkrypcji z dużym prawdopodobieństwem można stwierdzić, że obszar w którym się lokuje jest niedostępny dla aparatu transkrypcyjnego.

Promotory - Obszar promotorowy genu znajduje się na jego 5' końcu i zawiera kilka istotnych rejonów rozpoznawanych przez polimerazę II RNA ( najbliżej miejsca startu transkrypcji ) oraz czynniki transkrypcyjne. Spośród wspomnianych rejonów najistotniejszym i najbardziej powszechnym jest kaseta TATA ( tzw. TATA-box ). Jest to 7-nukleotydowa sekwencja położona w odległości ok. 25 pz od miejsca startu transkrypcji, która w pełni prezentuje się następująco: 5'- TATAAAA -3'. Obecność kasety TATA, choć niezbędna w przypadku prawie wszystkich genów; nie jest wystarczająca, aby z promotora ruszyła transkrypcja. Do pełnej aktywności promotora niezbędne są inne sekwencje występujące w rejonie od -110 do -40. Kaseta TATA stanowi tzw. część rdzeniową promotora.
(Schemat promotora genu eukariotycznego, uwzględniający rejony najbardziej powszechne )

Enhancery to sekwencje wzmacniające aktywność promotorów. Położone mogą być nawet w znacznej odległości od genu i zachowują zdolność regulacyjną także po eksperymentalnej zmianie orientacji o 180 st. względem genu. Do enhancerów wiążą się czynniki transkrypcyjne określane jako aktywatory, które oddziaływują z polimerazą II RNA i TF-ami promotorowymi.

Silencery - sekwencje służące wyciszeniu aktywności promotora; podobnie jak enhancery mogą być w różnym stopniu oddalone od genu w obu kierunkach, a także występować w jego wnętrzu.

Związki sterujące transkrypcją -

A. Czynniki transkrypcyjne wiążące się z promotorem - Eukariotyczna polimeraza II RNA sama w sobie nie jest zdolna do przyłączenia się do DNA, a co za tym idzie do rozpoczęcia transkrypcji. Zanim enzym zostanie związany w rejonie startu transkrypcji, do promotora przyłączają się kolejno białka zaliczane do grupy TFII. Kolejność przyłączania się TF-ów i polimerazy do promotora jest ściśle określona.

Nazwa czynnika	Funkcje
TFIID - TBP	Przyłączanie się do TATA box ( rozluźnianie helisy DNA ) Umożliwianie TFIIB przyłączania się do DNA Regulacyjne ( aktywacja, represja )
TFIIB	Umożliwianie łączenia się kompleksu polimerazy i TFIIF z DNA
TFIIF	Kierowanie polimerazy II RNA do promotora
TFIIE	Stymulacja aktywności TFIIH
TFIIH	Rozplatanie helisy DNA (aktywność helikazy ) Dostarczanie energii niezbędnej do zajścia reakcji ( hydroliza ATP ) Fosforylacja polimerazy ( modyfikacja aktywująca enzym )

Czynniki budujące wraz z polimerazą II RNA kompleks inicjacyjny - Do promotora (oprócz wymienionych TF-ów ) przyłączają się również białka takie jak, wspomniane wcześniej ssacze Sp1, NF1 oraz szereg innych.

B. Czynniki wiążące się z sekwencjami spoza promotora - Dla transkrypcji, której efektem byłaby intensywna synteza RNA niezbędna jest obecność związków wzmagających transkrypcję podstawową. Są to aktywatory transkrypcji łączące się z DNA w rejonach enhancerowych.

Podsumowując:

2. Transkrypcja może zachodzić na różnych poziomach:

• podstawowym ( niskim ),

• zaktywowanym ( intensywnym ) w zależności od składu czynników transkrypcyjnych w danej tkance.

3. Regulacja transkrypcji zależna jest do czynników:

• wewnętrznych (struktura chromatyny w rejonie występowania określonego genu, obecność kompletu TF-ów);

• zewnętrznych - odpowiedź sprowokowana bodźcami ze środowiska np. hormonalna.

Synteza łańcucha pre-mRNA zaczyna się zwykle od związania przez enzym nukleotydu guaninowego lub adeninowego, do których przyłączane są kolejne ,, cegiełki''.

Bardzo charakterystycznym dla eukariontów zjawiskiem jest tworzenie w pierwotnym transkrypcie struktury czapeczki ( ang. cap ) wpływającej na podniesienie stabilności pre-mRNA. Proces ten zachodzi równolegle z transkrypcją i jest jednym z etapów obróbki pre-mRNA (inne rodzaje obróbki zachodzą po zsyntetyzowaniu całej nici). Transkrypt uposażony w czapeczkę jest mniej wrażliwy na działanie nukleaz i fosfataz tj. enzymów odpowiedzialnych za degradację kwasu nukleinowego. Rozpoznanie cap jest także istotne w inicjacji translacji. Mechanizm tworzenia czapeczki obejmuje 3 zasadnicze etapy:

- modyfikację trifosforanu 5' końca przez uwolnienie jednej z reszt fosforanowych na drodze hydrolizy;

- przyłączenie GTP wiązaniem 5'-5'- trifosforanowym;

- metylacja guaniny w pozycji N7 tj. przyłączenie reszty metylowej (-CH3 )

-metylacja reszt cukrowcowych (C2) kolejnych nukleotydów może wygenerować kolejne czapeczki.

Poliadenylacja - Znakomita większość produktów reakcji katalizowanej przez polimerazę II RNA zawiera na swoim 3' końcu tzw. ogon poli A, tj. ciąg liczący od 100 do 250 połączonych ze sobą nukleotydów adeninowych. Nie znaczy to jednak, że w większości genów znajduje się obszar bogaty w pary AT. Fragment poli A nie jest efektem transkrypcji a posttranskrypcyjnej modyfikacji, w której udział bierze enzym zwany polimerazą poli A. Polimeraza poli A dodaje na 3' końcu pierwotnego transkryptu kolejne nukleotydy adeninowe dopiero po zadziałaniu specyficznej nukleazy tj. enzymu tnącego kwas nukleinowy w obrębie jego cząsteczki. Okazuje się bowiem, że ogon poli A nie jest dołączany do ostatniego nukleotydu wbudowanego na drodze transkrypcji, a do tego, który stał się ostatnim po rozcięciu nici pre-mRNA. Miejsce atakowane przez nukleazę nie jest dowolne, wyznacza je sekwencja: AAUAAA położona w różnej odległości od przeznaczonego miejsca działania enzymu. Istnieją geny zawierające więcej niż jeden sygnał poliadenylacji (tj.wspomnianą sekwencję). Oznacza to, że na ich matrycy powstanie kilka pierwotnych transkryptów różniących się długością , a co za tym idzie kilka różnych mRNA. Przykładem alternatywnej poliadenylacji może być modyfikacja pierwotnego transkryptu szczurzego genu kodującego kalcytoninę. Gen ten zawiera dwa miejsca poliadenylacji, z których pierwsze preferowane jest w komórkach tarczycy a drugie w mózgu. Ogon poli A podobnie jak struktura czapeczki chroni cząsteczkę pierwotnego transkryptu przed działaniem nukleaz. Może mieć również znaczenie w translacji, okazuje się bowiem, że transkrypt pozbawiony ogona poli A jest mniej wydajną matrycą przy syntezie białka.

Wycinanie intronów - Zanim powstanie ostateczny, dojrzały mRNA mogący ulec translacji, pre-mRNA musi zostać pozbawiony intronów. Proces wycinania tych niekodujących "wtrętów" zwany jest splicingiem i wykorzystuje jeden wspólny dla eliminacji wszystkich intronów aparat enzymatyczny. Oznacza to, że introny muszą mieć jakieś wspólne elementy rozpoznawane przez wspomniany aparat splicingowy. Z porównywania sekwencji różnych intronów wynika, że łączą je następujące podobieństwa:

• na 5' końcu zawierają zawsze kolejno: resztę guaninową i uracylową (5'- GU)

• na ich 3' końcu występuje reszta guaninowa poprzedzona resztą adeninową (AG - 3')

• wewnątrz zawierają tzw. miejsce rozgałęzienia, w którym kluczową dla splicingu rolę odgrywa nukleotyd adeninowy.

Mechanizm splicingu

Wycinanie intronów, jak każdy proces przeprowadzany przez organizm żywy, jest skomplikowane. Wyróżnić w nim można kilka etapów:

1. Rozcięcie cząsteczki pre-mRNA w miejscu splicingowym 5' (tj. na 5' końcu intronu).W wyniku tej reakcji następuje uwolnienie 5' końca fosforanowego egzonu 1.

2. Atak grupy 2'-OH nukleotydu adeninowego ( z miejsca rozgałęzienia ) na 5' grupę fosforanową nukleotydu guaninowego intronu. Jak wiadomo wiązania między kolejnymi nukleotydami to wiązania fosfodiestrowe tworzone między tzw. 5' grupą fosforanową a grupą hydroksylową ( -OH ) rybozy. Zwykle do wiązania tego angażowana jest grupa 3'-OH, niemniej jednak inne reszty hydroksylowe m.in. 2' posiadają zdolność do interakcji z resztą fosforanową. I tak nukleotyd adeninowy (z miejsca rozgałęzienia) mając grupę 3'-OH wykorzystaną w "normalnym" wiązaniu fosfodiestrowym do interakcji z resztą fosforanową 5' intronu angażuje grupę 2'-OH. Tworzy się tu wiązanie 2'-5' fosfodiestrowe.

3. Atak uwolnionej grupy 3'-OH egzonu 1 na 5' grupę fosforanową egzonu 2 z uwolnieniem intronu mającego postać lassa.

Spliceosom - Opisane powyżej reakcje nie zachodzą samoistnie. Są one katalizowane przez kompleks przyłączających się kolejno cząstek tworzących spliceosom. W skład aparatu splicingowego wchodzi pięć rodzajów snRNP ( snRNA + białka ): U1, U2, U4, U5 i U6, z których każdy pełni odrębną, istotną funkcję: U1- łączy się z miejscem splicingowym 5'i 3' na zasadzie komplementarności, zawiera on bowiem w swej rybonukleinowej komponencie sekwencję komplementarną do styków egzon-intron; U2- wiąże miejsce rozgałęzienia; U6- katalizuje splicing, występuje w kompleksie z U4 i U5. Produktem splicingu jest dojrzały mRNA niosący same istotne informacje dotyczące budowy białka (poza fragmentami skrajnymi, których głównym zadaniem jest stabilizacja transkryptu). Okazuje się jednak, że na matrycy jednego genu może powstać kilka różnych mRNA, co poza alternatywną poliadenylacją powodowane jest tzw. alternatywnym splicingiem. Polega on na łączeniu ze sobą różnych egzonów tzn. niekoniecznie wszystkich występujących w pre-mRNA.

Rodzaje RNA

a) mRNA - jest pojedynczą cząsteczką RNA (ssRNA), która jest nośnikiem informacji genetycznej, zawartej w postaci sekwencji zasad azotowych w cząsteczce. Na jej podstawie polimeryzowane są aminokwasy wg określonej kolejności - dzięki temu procesowi powstaje białko. Bezpośredni produkt transkrypcji - prekursorowy RNA ("pierwotny transkrypt") podlega późniejszym obróbkom potranskrypcyjnym.

b) tRNA - zwany transferowym RNA, związany z enzymem - syntetazą aminoacylo-tRNA, służy do odczytywania kodu genetycznego i transportu odpowiednich aminokwasów do - rybosomu, w trakcie translacji. Cząsteczki tRNA zbudowane są z ok. 75 nukleotydów, podobnie jak mRNA wytwarzane są one w wyniku obróbki cząsteczki pierwotnego transkryptu. W skład cząsteczki wchodzą również zmodyfikowane zasady azotowe (np.: dihydrourydyna, pseudourydyna). W każdej komórce znajduje się przynajmniej 20 rodzajów cząsteczek tRNA i przynajmniej jedna odpowiada swoistemu aminokwasowi. Cząsteczki tRNA posiadają cztery dwuniciowe obszary pozwalające wytworzyć drugorzędową strukturę podobną do liścia koniczyny. W cząsteczce tRNA można wyróżnić 4 główne ramiona. Ramię akceptorowe składa się z szypuły utworzonej ze sparowanych zasad, które kończy się sekwencją CCA (5'-3'). Grupa 3'-hydroksylowa reszty adenylowej wiąże się z grupą karboksylową odpowiednich dla danej cząsteczki tRNA aminokwasów wiązaniem estrowym. Pozostałe ramiona posiadają szypuły ze sparowanych zasad i na końcu pętle zawierające zasady niesparowane. Pętla ramienia antykodonowego posiada sekwencję antykodonową, decydującą o specyficzności cząsteczki tRNA w procesie translacji. Sekwencja antykodonowa rozpoznaje komplementarny tryplet nukleotydów tworzących kodon, na cząsteczce mRNA - w taki sposób następuje odczyt informacji genetycznej. Ramiona DHU i Ty C zostały nazwane od sekwencji, w których występują nietypowe nukleotydy wchodzących w skład ich końcowych pętli. Istnieje jeszcze dodatkowe ramię, które w zależności od klasy tRNA posiada różną liczbę par zasad (Klasa 1 tRNA - ok. 75% wszystkich 3-5 pz, natomiast Klasa 2 - 13-21 pz). Stałą strukturę drugorzędową utrzymują komplementarne zasady we wszystkich ramionach tRNA.

c) rRNA - to grupa kwasów rybonukleinowych wchodzących w skład rybosomu. Podobnie jak poprzednie klasy RNA, rRNA powstaje z pierwotnego transkryptu na drodze obróbki potranskrypcyjnej. Powstaje w jąderkach.

d) snRNA (ang. small nuclear RNA ) Wraz ze specyficznymi białkami tworzą kompleksy snRNP, Katalizują w spliceosomie wycięcie intronów z prekursorów mRNA

e) scRNA (ang. small cytoplasmic RNA ) Wraz ze specyficznymi białkami tworzą kompleksy scRNP, Kierują nowo syntetyzowane białka na zewnątrz komórki lub do przedziałów wewnątrzkomórkowych. Biorą udział w procesach obróbki pierwotnego transkryptu takich jak splicing editing, czy poliadenylacja 3'końca.