Nomenklatura i klasyfikacja enzymów

-kartka

Budowa i charakterystyka białek

Metody badania struktury

- krystalografia rentgenowska

-NMR ( jądrowy rezonans magnetyczny)

-metody de novo ( przewidywanie struktury na podstawie sekwencji aminokwasów)

-modelowanie porównawcze (przewidywanie struktury białka na podstawie struktury innego podobnego białka)

Mechanizmy reakcji enzymatycznych

-model Fischera (klucza i zamka)

-model Browna( tworzenie kompleksu ES)

-równanie M-M

-stabilizacja stanu przejściowego (Pauling): poprzez oddziaływania ładunków dodatnich i ujemnych

-model Koshlanda (indukowanego dopasowania)

-regulacja allosteryczna

-model matematyczny kinetyki enzymatycznej Henriego

Oddziaływanie białko ligand

Ogólna charakterystyka enzymów:

-katalizatory reakcji zachodzących w organizmie

-wielkocząsteczkowe

-charakter białkowy ( wyjątek rybozymy)

-podatne na denaturację na skutek nieodpowiedniego pH lub temperatury, tracą aktywność

-aktywność uzależniona od warunków otoczenia np. temp., pH

-wytwarzane przez żywe komórki, ale mogą działać poza nimi

-charakteryzują sie dużą specyficznością ( względem: substratu, reakcji lub obydwu)

-potrzebują łagodnych warunków reakcji

-katalizują reakcje w obu kierunkach(w zależności od warunków)

-ich aktywność może być regulowana (modyfikacja : kowalencyjna, potranslacyjna (np. ubikwitynacja, fosforylacja, glikozylacja), rozszczepianie)

-siłą katalityczna(wydajność katalizatora)

Struktura enzymu

-apoenzym: cześć białkowa enzymu

-kofaktor (koenzym: słabo nie kowalencyjnie związany, grupa prostetyczna: silnie kowalencyjnie związana): grupa prostetyczna związana w odwracalny sposób z apoenzymem, apoenzym + koenzym = holoenzym (enzym aktywny)

-centrum allosteryczna- miejsce przyłączenia efektora (np. inhibitora)

-centrum aktywne: miejsce przyłączenia substratu, dostarcza grup katalitycznych, wiąże też grupę prostetyczna

-enzymy to najczęściej wielkocząsteczkowe białka, posiadają co najmniej strukturą 3 rzędową

Specyficzność enzymów

Specyficzność substratowa: katalizują reakcje 1 substratu lub grupy substratów ( ze względu na budowę centrum aktywnego)

-specyficzność substratowa absolutna: może katalizować reakcje tylko z 1 substratem

-specyficzność substratowa grupowa: może katalizować reakcje określonej grupy podobnych do siebie substratów

-specyficzność substratowa podwójna:

a. działa na 2 substraty ale przeprowadza 1 reakcje

b. działa na 1 substrat ale przeprowadza 2 reakcje

-specyficzność przestrzenna: (teoria indukowanego dopasowania), dopasowanie substratu do centrum aktywnego

-chemo specyficzność: kataliza 1 konkretnej grupy chemicznej nawet w obecności innych

-regio specyficzność: powstaje w nadmiarze 1 z izomerów strukturalnych

-stereo specyficzność: tworzy tylko 1 enancjomer na danym atomie węgla

Kinetyka enzymatyczna

Typy hamowania reakcji enzymatycznych:

-blokowanie miejsca przyłączania substratu

-blokowanie miejsca przyłączania koenzymu

-blokowanie dodatkowego kofaktora

-blokowanie koenzymu

-blokowanie przez związanie substratu

-przyłączenie w okolicy centrum katalitycznego jakiegoś modyfikatora

Inhibicja

Inhibicja współzawodnicząca (inhibitory kompetycyjne)

Inhibitor przyłącza sie do miejsca aktywnego enzymu zamiast substratu, inhibitor i substrat mają podobna budowę, inhibitor łączy się z enzymem czasowo, kiedy opuści centrum aktywne enzym może dalej działać, tą inhibicję można przezwyciężyć poprzez zwiększenie stężenia substratu ( inhibitor i substrat współzawodniczą o miejsce aktywne), zwiększenie Km, takie samo Vmax

Inhibicja niewspółzawodnicząca (inhibitory niekompetycyjne)

Inhibitor łączy sie na stałe z enzymem ( może sie połączyć i z enzymem i kompleksem ES) ( w innym miejscu niż centrum aktywne, w centrum allosterycznym), ale go nie denaturuje ( jeśli w jakiś sposób by sie odłączył enzym może dalej działać), nie można tej inhibicji przezwyciężyć przez zwiększanie stężenia substratu bo inhibitor i tak zadziała (substrat i inhibitor nie współzawodniczą), inhibitor ma inna budowę niż substrat, obniżenie Vmax, Km takie samo

Inhibicja mieszana ( 1 faza nie kompetycyjna, np. hamowanie przez jony kadmu)

Inhibicja akompetycyjna obniżenie Vmax i Km pozornego, inhibitor przyłącza się do kompleksu ES

Zmiana szybkości reakcji może zachodzić dzięki :

-sprzężeniu zwrotnemu dodatniemu(produkt reakcji przyspiesza reakcje) lub ujemnemu (produkt reakcji spowalnia reakcje)

-dzięki modyfikatorom inhibitorom lub aktywatorom

Inaktywacja przez inaktywatory (łączą sie na stałe z enzymem i denaturują go)

inaktywatory ALA i MBE

ALA- związki reaktywne, znakujące wykazują powinowactwo do enzymów, same sie przyłączają i koniec

MBE- nie reaktywne, aktywowane przez enzymy podczas katalizy, przyłączają sie do enzymu, enzym je przekształca i wtedy sie przyłączają na stałe

ALA i MBE maja budowę podobną do substratów enzymów które inaktywują

Regulacja aktywności enzymów:

Mechanizmy regulowania procesów:

-regulacja genetyczna:

-regulacja środowiskowa

Charakter czynników regulujących:

Kinetyczny(fizykochemiczny):

-temperatura

-pH

-stężenie substratu

-stężenie enzymu

-stężenie soli

-obecność modyfikatorów ( inhibitory lub aktywator)

-lepkość roztworu, dyfuzja

Strukturalny

-regulacja genetyczna

-szybkość odprowadzania produktów

-regulacja transportu przez błony

-powiązanie enzymów z określonymi strukturami

Pośredni

-czynniki allosteryczne

-sprzężenie zwrotne

-modyfikacje

Mutacje enzymów

Źródła enzymów

-z roślin, z zwierząt, z mikroorganizmów

-rośliny: kiełkujące ziarna zbóż(amylazy), rośliny tropikalne ( papaja-papaina, figi-ficyna), łodyga ananasa, chrzan, cukinia, jaś biały (ureaza), otrzymuje sie mało enzymów z dużej ilości roślin

-organy zwierzęce: żołądek cieląt ( podpuszczka, pepsyna),wątroba ( katalaza), trzustka(trypsyna, chymotrypsyna, lipaza), uzyskuje się więcej enzymów ok. 10x więcej niż z roślin

-mikroorganizmy: pleśnie(katalaza),bakterie Bacillus (alfa i beta amylaza, acylaza penicylinowa), drożdże Sacharomuces(beta galaktozydaza, inwertaza), promieniowce(enzymy cytolityczne), więcej niż z roślin i zwierząt ( 10x więcej niż z zwierząt, 100x niż z roślin)

-mikroorganizmy są najlepsze bo:

-są tanie

-łatwe w hodowli

-dają lepsze enzymy(lepsza aktywność, bardziej przewidywalne, bez szkodliwych domieszek)

-łatwo się z nich uzyskuje enzymy

Metody wydzielania enzymów z materiału biologicznego

łagodne

-Liza komórki(szok osmotyczny): komórki wchłaniają wodę z roztworu pęcznieją i wybuchają

-trawienie enzymatyczne:

-ręczna homogenizacja: ucieranie w moździerzu

-siekanie

umiarkowane

-homogenizator Blade'a: wirują sobie ostrza i siekają wszystko

-mielenie z ścieraniem piaskiem: mielenie z dodatkiem piasku

energiczne

-ultrasonifikacja: za pomocą ultradźwięków

-homogenizator Mantona

-prasa Frencha: wysokie ciśnienie

-precypitacja frakcyjna: strącanie frakcji jako osadu

inne

bomba azotowa: szybka dekompresja

działanie detergentami

Metody oczyszczania enzymów

-sączenie molekularne: jest sito molekularne np. poliakrylamid, i nanosi sie od góry roztwór który chce sie oczyścić, potem eluent, i w zależności od wielkości i kształtu cząsteczki przelatują szybciej albo wolniej ( większe szybciej, mniejsze wolniej, bo maja dłuższa drogę do przebycia), stosowane do małych objętości próby

-chromatografia powinowactwa: polega na wzajemnym powinowactwie cząstek np. enzzym + substrat, przeciwciało + antygen, enzym + inhibitor, hormon + receptor, kwasy nukleinowe + białka

-chromatografia (HIC) oddziaływań hydrofobowych: hydrofobowe części białka przyłączają sie do hydrofobowych ligandów wypełnienia i nie zostają wypłukane, a hydrofilowe cząstki zostają wypłukane, potem można wypłukać przyłączone cząstki za pomocą buforu o malejącym gradiencie soli

-chromatografia jonowymienna: polega na różnicy w ładunkach powierzchniowych różnych cząstek, które łączą sie z wypełnieniem kolumny, im większy ładunek powierzchniowy tym silniej sie zwiąże z wypełnieniem, jeśli ma taki sam ładunek jak wypełnienie to nie zwiąże sie w ogóle i bardzo łatwo sie wypłucze, potem można stopniowo wypłukiwać następne w zależności od tego jak silnie są związane z wypełnieniem

Przechowywanie białka

-w temp 4 ^oC : 1 miesiąc, musi być sterylnie, można rozmrażać

-w - 20^oC ( z glicerolem albo glikolem etylowym): 1 rok, musi być sterylnie, można rozmrażać

-w od -20^oC do -80^oC: kilka lat, nie musi być sterylnie, można rozmrozić tylko raz

-liofilizowanie: kilka lat, nie musi być sterylnie, można rozmrozić jeden raz

robi sie to po to żeby enzymy nie zmieniły struktury i zachowały aktywność

Abzymy

-przeciwciała o charakterze enzymatycznym

-dzielą się na :

protoabzymy ( abzymy proteolityczne), DNA-abzymy ( hydrolizujące DNA)

-źródła abzymów: otrzymywane sztucznie, z surowicy krwi chorych zwierząt, z mleka osobników zdrowych

-zastosowanie: synteza organiczna, synteza leków, terapia antyalergiczna, narzędzie w biotechnologii( markery, specyficzne oddziaływania z DNA), czynniki terapeutyczne w terapii anty nowotworowej

Izozymy:

-występują w różnych typach komórek

- różne formy enzymu katalizujące tę sama reakcje, różnią się :

-sekwencją aminokwasów, właściwościami kinetycznymi i regulacyjnymi, ruchliwością elektroforetyczna, kodowane przez różne geny( taka furtka bezpieczeństwa jak by sie coś spierdoliło z 1 enzymem :)

-funkcje: specyficzne funkcje w wyspecjalizowanych komórkach, przystosowanie do różnych warunków zycia

-przykłady: dehydrogenazy, oksydazy, aminotransferazy, fosfatazy, enzymy proteolityczne

Rybozymy

-aktywne katalityczne cząstki RNA

-występują w wszystkich organizmach

-odpowiadają za syntezę białek

-posiadają strukturę 1(4 zasady nukleotydowe),2(wiązania wodorowe) i 3 (jony Mg²⁺,Na⁺)rzędu

-rodzaje: hammerhead(występują w wirusach tna specyficznie nic RNA), RNAza P RNA jest centrum aktywnym

-zastosowanie: w terapii genowej i genoterapii chorób wirusowych

Synzymy

-enzymy semi-syntetyczne(chemicznie modyfikowane enzymy naturalne), np. flawopapaina, metmioglobina

Artizymy

-enzymy syntezowane całkowicie w laboratorium, naśladują mechanizm działania centrum aktywnego enzymów naturalnych np. metaloenzymy

Enzymy w biologii molekularnej

abzymy (narzędzie w biotechnologii, markery, specyficzne oddziaływania z DNA), enzymy restrykcyjne ( dokładny opis instrukcja z BKiGO )

Zastosowanie enzymów w różnych dziedzinach życia

-termolizyna-aspartan (słodzik)

-gorzelnictwo-fermentacja alkoholowa ( dehydrogenaza alkoholowa)

-przemysł mleczarki-beta-galaktozydaza(różne produkty mleczne)

Immobilizacja enzymów

-polepsza właściwości enzymów: stabilność, wrażliwość na zmiany pH, wrażliwość na temperaturę, pozwala na efektywniejsze wykorzystanie enzymów (produkt wypływa a enzym zostaje na miejscu)

-sposoby immobilizacji(rysunek)

Transformacja indukowana

Transformacja znalazła zastosowanie m.in. w inżynierii genetycznej, terapii genowej oraz biotechnologicznej produkcji enzymów i hormonów. ( transformuje sie bakterie żeby produkowały jakiś enzym, a samej transformacji też dokonuje sie za pomocą enzymów restrykcyjnych)