z zakresu biologii molekularnej

6. Budowa i funkcje kwasów nukleinowych.

DNA ma postać podwójnie spiralnie skręconych łańcuchów polinukleotydowych.

Nukleotyd:

- cukier (5-węglowy - dezoksyryboza),

- reszty kwasu fosforowego,

- jedna z czterech zasad należących do puryn (Adenina i Guanina) lub pirymidyn (Cytozyna i Tymina).

Wiązania:

- wodorowe – pomiędzy komplementarnymi zasadami

- fosfodiestrowe - pomiędzy resztą cukrową i fosforową – łączy nukleotydy

- N-glikozydowe - pomiędzy atomem węgla i jedną z czterech zasad azotowych

Pary zasad łączą się w ściśle określony sposób: A-T, G-C

Funkcje DNA

DNA służy przekazywaniu informacji genetycznej komórkom i organizmom potomnym, kieruje syntezą białek w organizmie m. in. białek enzymatycznych, a dzięki temu kieruje wszystkimi procesami zachodzącymi w organizmie (metabolizm). Gen jest to fragment DNA zawierający informacje dotyczącą syntezy jednego białka.

RNA – jednoniciowe, składa się z nukleotydów.

Nukleotyd:

- cukier (5-węglowy - ryboza)

- reszty kwasu fosforowego

- jedna z czterech zasad należących do puryn (Adenina i Guanina) lub pirymidyn (Cytozyna i Uracyl)

Pary zasad łączą się w ściśle określony sposób: A-U, G-C

Rodzaje i funkcje RNA:

1. Kodujący:

- mRNA – informacyjny - matryca dla syntezy białek

2. Niekodujący (ncRNA):

- rRNA – rybosomalny - główny składnik rybosomów
- tRNA – transportujący - przenosi zaktywowany aminokwas na rybosom
- snRNA – mały jądrowy – udział w procesie wycinania intronów

7. Przepływ informacji od DNA do białka.

Przekazywanie informacji genetycznej obejmuje m.in. takie procesy, jak:

- replikacja DNA

- transkrypcja informacji genetycznej z DNA na mRNA

- translacja - tłumaczenie sekwencji nukleotydów mRNA na sekwencję aminokwasów
w powstającym łańcuchu białka

Przepływ informacji genetycznej odbywa się w kierunku:

DNA namnażane jest w procesie replikacji.

BIOSYNTEZA BIAŁKA

- katalizowany enzymatycznie proces łączenia aminokwasów białkowych w kolejności

zdeterminowanej przez sekwencję nukleotydów zawartą w informacyjnym kwasie rybonukleinowym (mRNA).

Etapy biosyntezy białka:

Transkrypcja

Podczas transkrypcji polimeraza RNA buduje cząsteczkę RNA łącząc zgodnie z zasadą komplementarności pojedyncze rybonukleotydy według kodu matrycowej nici DNA. Cząsteczki mRNA zawierają informację określającą sekwencje aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym. Transkrypcji podlega odcinek DNA od promotora do terminatora.

Translacja

Odczytywanie kodu genetycznego - synteza łańcucha polipeptydowego o sekwencji określonej przez mRNA. Translacja wymaga udziału cząsteczek adaptorowych (tRNA), rybosomów i ich rRNA i wielu związków drobno- i wielkocząsteczkowych. Translacja odbywa się w cytoplazmie lub na błonach siateczki śródplazmatycznej szorstkiej. Proces ten jest katalizowany przez rybosom obejmujący podjednostkami przesuwającą się nić mRNA.

8. Współczesne techniki badania kwasów nukleinowych. 

Hybrydyzacja

Polega na zastosowaniu sond molekularnych. Są to jednoniciowe fragmenty DNA – oligonukleotydy o znanej sekwencji, które charakteryzują się wysoką specyficznością i łączą się komplementarnie z materiałem badanym. Połączenie to określamy mianem hybrydu lub dupleksu. Aby uwidocznić efekty prowadzonych działań, sondy znakuje się. W tym celu stosuje się radioizotopy bądź nukleotydy wraz ze związanymi ligandami. Najpopularniejsza to Southern blot.

PCR - łańcuchowa reakcja polimerazy

Służy do powielania fragmentu DNA. Mieszanina reakcyjna zawiera: DNA matrycowe, dwa startery, dNTP będące substratami reakcji, termostabilną polimerazę, kationy Mg⁺ oraz bufor. Znajomość sekwencji okalających interesujący nas fragment jest niezbędna do zaprojektowania starterów. Przyłączą się one do komplementarnych sekwencji naszej matrycy DNA i wyznaczą odcinek, który ma ulec powieleniu.

Metoda PCR to cykliczne powtarzane trzech etapów, przebiegających w różnych warunkach temperaturowych.

Etapy:

- denaturacja – rozdział podwójnej helisy na dwie nici (90-95˚C)

- annealing – przyłączanie starterów (47-65˚C)

- elongacja – wydłużenie nici z udziałem polimerazy (72˚C)

Techniki elektroforetyczne i przesiewowe

Produkt PCR może być analizowany bezpośrednio, poprzez sprawdzanie długości namnożonego fragmentu poprzez migrację w żelu lub wykorzystywany w technikach przesiewowych.

Standardową metodą służącą do identyfikacji i rozdzielania fragmentów DNA jest elektroforeza w żelu agarozowym. Jest to elektroforeza pozioma, w której do barwienia cząsteczki stosuje się bromek etydyny. Elektroforezę pionową przeprowadza się w żelu poliakrylamidowym.

Inne: Elektroforeza na żelach z gradientem czynnika denaturującego, analiza polimorfizmu konformacji jednoniciowych fragmentów DNA – SSCP.

Najlepszą spośród technik przesiewowych jest wysokosprawna chromatografia cieczowa
z czynnikiem denaturującym (DHPLC). Zasada działania oparta jest na rozdziale fragmentów kwasu nukleinowego i różnicach w ich migracji zależnej od ich wielkości (jednoniciowych
i dwuniciowych fragmentów).

Sekwencjonowanie

 Służy do ustalenia kolejności nukleotydów w cząsteczce DNA. Najczęściej wykorzystywaną jest metoda sekwencjonowania „dideoksy” Sangera. W skład mieszaniny reakcyjnej wchodzi primer umożliwiający tworzenie nowej nici. Obok primera mieszanina zawiera deoksynukleotydy (dNTP) wydłużające powstającą nić oraz znakowane barwnikami fluorescencyjnymi dideoksynukleotydy (ddNTP) hamujące dalsze przyłączanie się nukleotydów. Efekt ten wywołany jest odmienną strukturą chemiczną tych cząsteczek. Przyłączanie jednej z DTP lub ddNTP do syntetyzowanego łańcucha odbywa się losowo, tak, że otrzymujemy fragmenty o różnej długości - różnią się długością jednego nukleotydu.
W dalszym etapie procesu fragmenty rozdziela się elektroforezą o wysokiej rozdzielczości na żelu poliakrylamidowym, uwidaczniając dokładną sekwencje poddanego badaniu odcinka DNA. Każdy z dideosynukleotydów różniących się zawartą w nich zasadą azotową (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP), jest wyznakowany innym barwnikiem fluorescencyjnym. Po wzbudzeniu cząstek promieniem lasera, barwnik emituje światło o znamiennej długości fali.

Mikromacierze

Metoda ta jest specyficznym rodzajem hybrydyzacji pozwalającym na jednoczesną ocenę ekspresji tysięcy genów. Mutacje i warianty polimorficzne porównuje się z wzorcowym materiałem DNA na płytkach poddanych hybrydyzacji z fluorescencyjnie wyznakowanym badanym materiałem genetycznym. 

Modyfikacje PCR

PCR – ASA, czyli allelowo – specyficzna amplifikacja pozwala na rozróżnienie alleli prawidłowych od zmutowanych w badanym genie. Do przeprowadzenia tej reakcji konieczna jest znajomość badanej mutacji. Korzysta się z pary primerów, jednego komplementarnego do allelu prawidłowego, drugiego łączącego się z allelem zmutowanym. Powstające produkty różnią się długością. Wyniki z elektroforezy uwidaczniają nam jaki allel znajduje się w genie. U heterozygoty będą widoczne oba produkty.

PCR w czasie rzeczywistym (real-time PCR) jest ilościową metodą oznaczania zawartości matrycowego DNA zawartego w próbie. Podczas trwania reakcji mierzona jest ilość produktu amplifikacji w każdym z cyklów.

Techniki blotting’u

   Pozwalają na badanie ekspresji genów poprzez określanie poziomu mRNA - Northern blot, lub wykrywanie powstałych na bazie mRNA białek – Western  blot.

9. Struktura genu eukariotycznego.

Zwykle gen jest poprzedzony fragmentem DNA zwanym promotorem, który jest rozpoznawany przez maszynerię komórkową. Przyłącza się ona do tego fragmentu
i rozpoczyna transkrypcję, czyli przepisywanie DNA na mRNA. Od charakterystyki promotora zależy regulacja takiego genu, czyli w uproszczeniu - to, ile białka na podstawie tego genu powstaje w danej chwili w komórce. Sama sekwencja genu jest podzielona na fragmenty dwóch typów : exony i introny. Zarówno exony jak i introny są początkowo przepisywane na RNA, jest to tzw. pre-mRNA. Następnie z tego łańcucha usuwane są fragmenty intronów i w dojrzałym mRNA zostaje tylko sekwencja pochodząca z exonów. Proces ten określa się jako Splicing.

Enhancery są to sekwencje w DNA wspomagające i regulujące transkrypcję informacji genetycznej. Sekwencja TATA (ang. TATA box) - rozpoznawana przez TBP (białko wiążące TATA) będące składnikiem ogólnego czynnika transkrypcyjnego.

10. Budowa i funkcje białek.

Zbudowane z reszt aminokwasów połączonych ze sobą wiązaniami peptydowymi -CONH-.

Zsyntetyzowany w komórce łańcuch białkowy przypomina unoszącą się swobodnie
w roztworze "nitkę", która może przyjąć dowolny kształt, tworząc mniej lub bardziej sztywną strukturę przestrzenną, zwaną strukturą lub konformacja białka "natywną". Tylko cząsteczki, które uległy zwinięciu do takiej struktury, mogą pełnić właściwą danemu białku rolę biochemiczną.

Ze względu na skalę przestrzenną pełną strukturę białka można opisać na czterech poziomach:

1. Struktura pierwszorzędowa białka (sekwencja aminokwasów, struktura pierwotna białka) – kolejność aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym

2. Struktura drugorzędowa białka – przestrzenne ułożenie fragmentów łańcuchów polipeptydowych. Do struktur drugorzędowych zaliczana jest:

   • helisa alfa

   • harmonijka beta

   • beta zakręt (pętle omega)

3. Struktura trzeciorzędowa białka – wzajemne położenie elementów struktury drugorzędowej.

4. Struktura czwartorzędowa białka – wzajemne położenie łańcuchów polipeptydowych oraz ewentualnie struktur niebiałkowych (grupa prostetyczna):

   • cukrów w glikoproteidach

   • lipidów w lipoproteidach

   • kwasów nukleinowych w nukleoproteidach

   • barwników w chromoproteidach.

Białka mają następujące funkcje:

• kataliza enzymatyczna

• transport – hemoglobina, transferyna

• magazynowanie – ferrytyna

• kontrola przenikalności błon – regulacja stężenia metabolitów w komórce

• ruch uporządkowany – skurcz mięśnia, ruch – np. aktyna, miozyna

• wytwarzanie i przekazywanie impulsów nerwowych

• bufory

• kontrola wzrostu i różnicowania

• immunologiczna – np. immunoglobuliny

• budulcowa, strukturalna – np. &-keratyna, elastyna, kolagen

• przyleganie komórek (np. kadheryny)

• regulatorowa (regulacja hormonalna i regulacja przebiegu procesów genetycznych) – reguluje przebieg procesów biochemicznych – np. hormon wzrostu, insulina, czynniki transkrypcyjne i inne.

11. Kaspazy a apoptoza.

Kaspazy są enzymami, z grupy proteaz kontrolujących apoptozę. W największym stopniu odpowiadają za zniszczenie komórki skazanej na samobójstwo: przecinając odpowiednie białka, pośrednio doprowadzają do poszatkowania materiału genetycznego na drobne kawałki, zmiany kształtu komórki i jej podzielenia się na pęcherzyki apoptotyczne, które są natychmiast pożerane przez inne, żywe komórki - neutrofile, monocyty, komórki sąsiadujące. Pęcherzyki apoptotyczne posiadają w pełni funkcjonalne organella (apoptoza
w przeciwieństwie do nekrozy nie daje odczynu zapalnego). Kaskada kaspaz może rozpoczynać się przy błonie komórkowej (np. wskutek aktywacji białka Fas) albo w pobliżu mitochondrium, kiedy do cytoplazmy przedostaną się cząsteczki cytochromu c.

W zdrowej komórce na powierzchni błony zewnętrznej mitochondrium znajduje się białko Bcl-2, które z kolei jest połączone z innym białkiem Apaf-1. Wewnętrzne uszkodzenia komórki powodują, że Bcl-2 odłącza się od Apaf-1. Następnie cytochrom c wydostaje się do cytoplazmy gdzie łączy się z białkiem Apaf-1 oraz z prokaspazą 9. W efekcie powstaje kompleks:

• cytochrom c,

• Apaf-1,

• prokaspaza 9,

• ATP,

który nazywamy apoptosomem. W obrębie apoptosomu zachodzi autokatalityczna aktywacja kaspazy 9. Cytozol ulega agregacji. Kaspazy jako proteazy rozszczepiają białka
i równocześnie aktywują inne kaspazy. Następuje trawienie strukturalnych białek i degradacja DNA. Komórka ulega fagocytozie.

12. Molekularne aspekty cyklu komórkowego (pojęcie protoonkogenu i genu supresorowego).

Protoonkogen – gen obecny w prawidłowej komórce, potencjalnie (lecz nie aktualnie) zdolny do wyzwolenia procesu transformacji nowotworowej. Uwarunkowana mutacją zmiana jego ekspresji sprawia, że przekształca się w onkogen, tj. gen bezpośrednio aktywujący transformację nowotworową komórki. Stanowią ok. 1% wszystkich genów.

W komórce występują liczne i zróżnicowane protoonkogeny, ich główne funkcje to:

• zawierają informacje dla czynników wzrostowych i ich receptorów błonowych

• kodują wewnątrzkomórkowe przekaźniki informacji związanej z procesami wzrostu
  i proliferacji

• kodują czynniki transkrypcyjne pobudzające proliferację i upośledzające procesy różnicowania komórki

• kodują białka regulatorowe cyklu komórkowego (cykliny i kinazy cyklinozależne), enzymy (głównie kinazy), a także czynniki kontrolujące proces apoptozy.

Białka kodowane przez protoonkogeny są w prawidłowych komórkach istotne dla złożonych procesów regulacyjnych, które wyznaczają prawidłowy przebieg różnicowania i proliferacji.

Zmiana prowadząca do przemiany protoonkogenów w onkogeny jest przede wszystkim skutkiem mutacji. Podobne następstwa może mieć translokacja chromosomalna (np. chromosom Philadelphia obecny u 90% chorych na przewlekłą białaczkę szpikową) lub amplifikacja genu (tj. jego wielokrotne skopiowanie).

Gen supresorowy (antyonkogen) – gen działający hamująco na procesy proliferacji komórkowej (geny bramkowe) bądź stabilizująco na procesy utrzymujące stabilność genetyczną komórki (geny opiekuńcze).

Czasem geny tej grupy są określane jako recesywne onkogeny, gdyż ich rola w procesie karcynogenezy ujawni się dopiero po inaktywacji obu alleli danego antyokogenu.

Do genów supresorowych zalicza się TP53, RB1, BRCA1, BRCA2, APC i wiele innych.

Dla komórki działanie genów supresorowych ma znaczenie przy przechodzeniu komórki przez poszczególne fazy cyklu komórkowego. Jest to proces wzajemnie powiązany funkcjami białek supresorowych i onkoprotein. Geny bramkowe są bezpośrednio zaangażowane
w proces cyklu komórkowego. Ich produkty działają hamująco na odpowiednich etapach cyklu komórkowego. Geny opiekuńcze, odpowiadają za stabilność genetyczną komórki. Czyli są genami, których produkty prowadzą aktywność antymutagenną komórki. Inaczej mówiąc, mają za zadanie naprawiać wszystkie uszkodzenia i zmiany zachodzące na poziomie DNA.

Jedna z ważniejszych funkcji antyonkogenu polega na zapobieganiu rozwojowi choroby nowotworowej. Tego rodzaju antyonkogeny są nazywane supresorami nowotworowymi. Klasycznymi supresorami nowotworowymi są RB1 (białko retinoblastomy) oraz P53.