BIOCHEMIA SPRAWOZDANIE

WYKRYWANIE AKYWNOŚCI OKSYREDUKTAZ

Oksydoreduktazy katalizują wiele istotnych reakcji komórkowych zwłaszcza dotyczących utleniania biologicznego, które polega na łączeniu się wodoru z tlenem. W komórkach utlenia się jednak nie wodór cząsteczkowy, ale związany przeważnie z koenzymami nikotynamidoadeninowymi, które go pobierają wprost od substratów biologicznych utleniań (glukozy, kwasów tłuszczowych, aminokwasów itp.). Biologiczne utlenianie wodoru polega na przeniesieniu elektronów nie wprost z wodoru na tlen, ale przez wiele biologicznych układów oksydoredukcyjnych. Przyjmując za kryterium mechanizm działania, enzymy klasy oksydoreduktaz można ująć w cztery grupy:
- oksydazy,
- oksygenazy,
- dehydrogenazy,
- hydroperoksydazy.

Oksydazy aktywują atomy tlenu do przyjęcia elektronów oderwanych od utlenianego substratu i katalizują połączenie powstałych jonów tlenkowych z protonami na cząsteczkę H₂O lub H₂O₂. Enzymy te przenoszą wodór bezpośrednio na tlen atmosferyczny. Substratem są często mono- i polifenole. Duże znaczenie praktyczne ma oksydoreduktaza o-difenol:tlen (EC.1.10.3.1.) zwana potocznie oksydazą fenolową. Typową reakcją katalizowaną przez ten enzym jest utlenianie pirokatechiny. Działaniu enzymu ulega również fenol jednowodorotlenowy, przy czym najpierw tworzy się pirokatechina. Oksydaza fenolowa jest metaloproteiną i zawiera miedź, która przyjmuje elektrony od dwufenoli i przekazuje na tlen cząsteczkowy. 

Oksydaza ksantynowa katalizuje utlenianie ksantyny tlenem powietrza. W wyniku reakcji powstaje kwas moczowy i nadtlenek wodoru. Enzym ten katalizuje też utlenianie aldehydów do kwasów organicznych. Reakcja zachodzi także w obecności innych niż tlen akceptorów wodoru. Jeżeli jako akceptora wodoru użyje się błękitu metylenowego, to barwa niebieska zanika, gdyż błękit metylenowy redukuje się do bieli błekitu.
Oksygenazy katalizują proces wbudowywania O2 w czasteczkę. Wyróżnia się oksygenazy właściwe i hydroksylujące.
Dehydrogenazy katalizują odrywanie atomów wodoru od utlenianego substratu i przenoszą je na inne enzymy czy związki pośrednie, a nie maja zdolności przenoszenia elektronów bezpośrednio na tlen. Różnią się one rodzajem koenzymów, które są właściwymi chwytnikami atomów wodoru.
Hydroperoksydazy obejmują dwie podgrupy enzymów, tj. peroksydazy (przeważają w tkankach roślinnych) i katalazy (w tkankach zwierzęcych). 
Reprezentują one białka zawierające żelazoporfirynę. Reakcje katalizowane przez hydroksydazy przedstawia schemat:

Peroksydaza jest enzymem bardzo rozpowszechnionym w roślinach. Jej działanie związane jest z obecnością nadtlenku wodoru. Nadtlenek wodoru nie jest rozkładany z wydzieleniem tlenu, lecz wykorzystywany przez enzym w reakcjach utleniania substratów (np. fenoli): 

H₂O₂ + fenole 2H₂O + chinony

Peroksydaza jest mało wrażliwa na wysoką temperaturę i jeszcze w 100OC częściowo zachowuje swoją aktywność. Oksydazy o wiele szybciej niż peroksydazy tracą swoją aktywność w podwyższonej temperaturze.
Katalazy obecne we wszystkich organizmach tlenowych, katalizują rozpad H₂O₂ według równania:
2H₂O₂ 2H₂O + O₂
Katalazy charakteryzują się dużą aktywnością. Inhibitorami katalazy są między innymi jony CN^- i S-2.

Wykonanie ćwiczenia:

1. Przygotowanie wyciągów enzymatycznych:

1. Otrzymywanie wyciągu z ziemniaka.

Śreniej wielkości ziemniaka myjemy i obieramy, po czym rozcieramy go na miazgę tarką. Miazgę zalewamy 200 cm3 wody destylowanej, przez kilka minut mieszając, aby wyekstrahować enzymy. W ten sposób otrzymujemy wyciąg ziemniaka zawierający enzymy i wypłukaną skrobię. Po opadnięciu miazgi i skrobi na dno roztwór z nad osadu zdenaktowujemy i używamy do ćwiczeń.

1. Jakościowe wykrywanie aktywności enzymów:

1. Wykrywanie aktywności oksydazy polifenolowej.

Umytego i obranego ziemniaka kroimy w plastry. 6 surowych plastrów ikładamy na bibule, 2 plastry gotujemy, po ugotowaniu kładziemy na bibule. Na plastry nanosimy odpowiednio 1% rztoru pirogallu, 1% roztwór fenolu oraz odpowiednio roztwory NaCl i CuSO_4.

Obserwujemy zmianę zabarwienia po

• 30 minutach:

1)surowy- barwa przybrała kolor żółto-brązowy,
2) surowy z NaCl- barwa przybrała kolor żółty,
3)surowy z CuSO4- barwa przybrała barwę brązową,
4)gotowany- barwa ziemniaka nie zmieniła się,

5) surowy- barwa przybrała kolor różowo-brązowy,

6) surowy z NaCl- barwa pozostała bez zmian,

7) surowy z CuSO4- barwa pozostała bez zmian,

8)gotowany- barwa pozostała bez zmian.

• 1 godzinie:

5) surowy- barwa brązowo-różowa zrobiła się intensywniejsza,
6)surowy z NaCl- barwa żółta zrobiła się intensywniejsza,
7)surowy z CuSO4- kolor przybrał barwę ciemno brązową,

8)ugotowany- barwa pozostała bez zmian,

9)surowy – barwa przybrała kolor intensywnej czerwieni i brązu,

10)surowy z NaCl- barwa przybrała kolorystykę lekko brązową,

11) surowy z CuSO4- barwa nie zmieniła się,

12) gotowany- barwa pozostała bez zmian.

WNIOSKI: Oksydaza polifenolowa jest enzymem, który uczestniczy w utlenianiu powietrzem substancji zawierających ugrupowania polifenolowe. Ich utlenianie odpowiedzialne jest za ciemnienie świeżo obranych warzyw i owoców. W pierwszej fazie utleniania powstają słabo zabarwione chinony, które z niezmienionym fenolem dają intensywnie barwne kompleksy z przeniesieniem ładunku.

1. Wykrywanie aktywności peroksydazy:

Do dwóch probówek wlewamy po 3 cm3 odpowiednio

- 1 – surowego wyciągu z ziemniaka,

- 2 – zagotowanego wyciągu z ziemniaka.

Do probówek kolejnie dodajemy po 3 cm3 pirogallolu, mieszamy i dodajemy po 3 cm3 3% H2O.

WNIOSKI: W probówce nr -1- kolor wyciagu z ziemniaka surowego zrobił się bardziej intensywniejszy, zaś w probówce – 2 – roztwór zrobił się intensywniejszy i wytrącił się drobny meszkowaty osad, który prawdopodobnie był pozostałością z wyciągu. Peroksydazy katalizują przeniesienie odłączonych atomów wodoru oderwanych z określonych, zwykle aromatycznych substratów na H202.

1. Wykrywanie aktywności katalazy:

Do dwóch probówek zawierających odpowiednio 3 cm3 :

- 1 – surowgo wyciągu z ziemniaka,

- 2 – zagotowanego wyciągu z ziemniaka.

Do probówek dodajemy 3 cm3 3% H2O2 i obserwujemy przebieg reakcji.

WNIOSEK: W probówce – 1 zaobserwowaliśmy wydzielanie się śladowej ilości pęcherzyków gazu- tleny cząsteczkowego. Świadczy to o obecności katalazy w naszym surowcu. W probówce – 2 – nie wydzielił się tlen. Katalaza rozkłada nadtlenek wodoru be udziału dodatkowego substratu.

1. Wykrywanie różnic w stopniu utlenienia pirogallolu przez enzymy ziemniaka.

Przygotowujemy dwie probówki zawierające po 5 cm3 wyciągu z ziemniaka i po 2 cm3 alkoholowego roztworu pirogallolu. Do jednej z probówek wlać dodatkowo 3 cm3 H2O2. Obserwujemy zmianę zabarwienia.

WNIOSEK: Na powierzchni roztworu w probówce powstaje ciemny pierścień.

1. Badanie wrażliwości oksydaz i peroksydaz na temperaturę.

Do dwóch probówek odmierzamy po 5 cm3 wyciągu ziemniaczanego. Probówki ogrzewamy w łaźni wodnej o temperaturze 70 C przez okres 10 minut. Po tym czasie do pierwszej probówki dodajemy 1 cm3 1% pirogallolu, do drugiej po 1 cm3 1% pirogallolu i 3% H2O2. To samo do doświadczenie wykonujemy analogicznie dla temperatury 100 C. Peroksydazy nie ulegają inaktywacji w temperaturze 70 C, lecz dopiero po ogrzaniu do temperatury wrzenia. Natomiast oksydazy tracą swą aktywność po ogrzaniu do temperatury 70 C.

WNIOSEK: Na powierzchni probówek powstają pierścienie. Oksydazy są mało odporne na działanie wysokiej temperatury. Peroksydazy są mało wrażliwe na działanie wysokiej temperatury, wykorzystują nadtlenek wodoru w reakcji utleniania pirokatechiny.