WITAMINA C

WPROWADZENIE
-Witamina C jest szeroko rozpowszechniona w świecie roślin i zwierząt
-stabilna zarówno w produktach spożywczych jak i w przetworach
-wrażliwa na utlenianie, zwłaszcza w obecności katalizatorów (szczególnie Cu2+ i Fe3+)
-wrażliwa na aktywność enzymów utleniających (oksydazy askorbinowej, peroksydazy, polifenolooksydazy)
-najbardziej stabilna w środowisku kwaśnym (dodanie do próby 2-3% kwasu szczawiowego w celu stabilizacji lub 3% kwasu metafosforowego (HPO3) lub 8% kwasu octowego czy 2% kwasu solnego)
-nietrwała w środowisku zasadowym i obojętnym
-w roztworach wrażliwa na ogrzewanie
-wrażliwa na naświetlanie promieniami UV

Witamina C obejmuje dwa związki

1. kwas L-askorbinowy

2. kwas L-dehydroaskorbinowy
   -utleniona forma kwasu L-askorbinowego

Kwas L-askorbinowy
-jest związkiem krystalicznym
-dobrze rozpuszczalnym w wodzie
-jego roztwory mają kwaśny smak
-wykazuje właściwości redukujące
- w warunkach beztlenowych odporny na wysoką temperaturę

Kwas L-dehydroaskorbinowy
-mniej trwalszy od kwasu L-askorinowego
-jego nietrwałość jest przyczyną strat witaminy C podczas ogrzewania

Oznaczanie witaminy C

1. Metody fizykochemiczne:
   -chromatografia cieczowa
   -metoda spektofotometryczna
   -fluorometryczna

2. Metody chemiczne
   -metoda miareczkowa Tillmansa z modyfikacją Pijanowskiego

Chromatografia cieczowa
-witamina C jest najbardziej stabilna w środowisku kwaśnym, dlatego do jej ekstrakcji z próbek stałych oraz rozcieńczenia używa się rozcieńczonych roztworów kwasów: 2% kwasu szczawiowego, 3% kwasu meta fosforowego V, 8% kwasu octowego czy 2% kwasu solnego
-zasada metody polega na oznaczeniu łącznej zawartości kwasów: L-askorbinowego i dehydroaskobrinowego
-kwas dehydroaskorbinowy jest redukowany do kwasu L-askorbinowego za pomocą ditiotreitolu (DTT)
-witamina C oznaczaja jest techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej z zastosowaniem kolumny RP-C18 i detektora UV (λ=254nm)

Metoda spektrofotometryczna
-rozdrobnioną próbkę zawiesza się w rozcieńczonym kwasie meta fosforowym (V) a następnie ekstrahuje chloroformem
-w celu przeprowadzenia kwasu askorbinowego w kwas dehydroaskorbinowy faza wodna jest poddawana działaniu roztworu 2,6-dihydrofenoloindofenolu, a następnie roztworem 2,4-dinitrofenylohydrazyny
-utworzony hydrazon jest ekstrahowany mieszaniną octanu etylu, lodowatego kwasu octowego i acetonu (96:2:2)
-ekstrakt oczyszcza się metoda chromatografii adsorpcyjnej na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym
-jako fazę ruchomą stosuje się mieszaninę dichlorometanu i lodowatego kwasu octowego w stosunku objętościowym 97:3
-eluat odparowuje się do sucha i pozostałość rozpuszcza się w rozcieńczonym kwasie siarkowym
-absorbancję roztworu mieszy się spektofotometrzycznie prz długości fali λ=509nm.
-pomiary przeprowadza się w odniesieniu do rozcieńczonego kwasu siarkowego

Metoda fluorymetryczna
-Metoda polega na utlenieniu kwasu L-askorbinowego do L-dehydroaskorbinowego i przeprowadzeniu reakcji z o-fenylenodiaminą, w wyniku której powstaje fluoryzujący kompleks
-Jego stężenie określa się na podstawie pomiaru fluorymetrycznego przy długości fali światła wzbudzającego 365 nm i w obecności filtru wtórnego o przepuszczalności światła 430 nm
-Natężenie fluorescencji jest wprost proporcjonalne do stężenia witaminy C w badanym roztworze

Metoda fuorymetryczna eliminuje negatywny wpływ
•Barwników antocyjanowych
•Reduktonów w żywności

Oznaczenie przebiega w trzech etapach:

1. Ekstrakcja witaminy z próbki produktu i jej stabilizacja przy użyciu mieszaniny kwasów metafosforowego i octowego. Mieszanina ta zapobiega utlenianiu witaminy przez jony miedzi i żelaza oraz inaktywuje enzymy poprzez denaturację białka

1. Utlenienie kwasu L-askorbinowego do formy dehydro przez zastosowanie wytrzasamoa z węglem aktywowanym

2. Pomiar fluorescencji kompleksu kwasu dehydroaskorbinowego z o-fenylenodiaminą

Metoda miareczkowa Tillmansa z modyfikacją Pijanowskiego
kwas +2,6-dichlorofenoloindofenol kwas + leukobarwnik
L-askorbinowy L-dehydroaskorbinowy

- Metoda Tillmansa polega na redukcji 2,6-dwuchlorofenoloindofenolu o barwie niebieskiej przez kwas askorbinowy w środowisku kwaśnym do bezbarwnego związku

- W punkcie równoważnikowym nadmiar wprowadzonego indofenolu wywołuje pojawienie się różowego zabarwienia roztworu

- Modyfikacja Pijanowskiego dotyczy wstępnego zredukowania siarkowodorem (H2SO4 + Na2S) kwasu dehydroaskorbinowego do kwasu askorbinowego i usunięciu nadmiaru siarkowodoru za pomocą chlorku rtęci (HgCl2)

Oznaczenie przebiega w trzech etapach:

1. Przygotowanie próby i jej stabilizacja przy użyciu 3% kwasu szczawiowego

1. Redukcja kwasu L-dehydroaskorbinowego do kwasu L-askorbinowego przy użyciu siarkowodoru (H2S)

2. Miareczkowanie mianowanym roztworem 2,6-dwuchlorofenoloindofenolu kwasu L-askorbinowego do momentu pojawienia się różowego zabarwienia

Niedogodności metody:

1. Redukcja indofenolu może zachodzić również pod wpływem innych reduktonów, o mniejszym powinowactwie do indofenolu, np.

   •SO2 -dodawany do produktów w celu ich utrwalenia – pulpy, przeciery, moszcze
   •Jonów Fe2+; kwas octowy eliminuje wpływ dwuwartościowego żelaza na wynik miareczkowania
   •Reduktonów cukrowych (triozoreduktonów) powstających podczas ogrzewania, szczególnie w środowisku alkalicznym
   •Reduktonów białkowych zawierających grupy sulfhydrylowe (-SH)
   •Barwników antocyjanowych podlegających utlenieniu odczynnikiem Tillmansa

1. Uchwycenie punktu równoważnikowego przy analizowaniu produktów zawierających znaczne ilości barwników wodorozpuszczalnych o barwie zbliżonej do odczynnika Tillmansa (np. antocyjanów o barwie amarantowej) jest utrudnione i wymaga zastosowania rozpuszczalników organicznych (np. ksylenu, benzenu, chloroformu), w których rozpuszcza się nadmiar indofenolu

2. Metody tej nie należy stosować do produktów zawierających znaczne ilości substancji zasadowych