Metody eksperymentalne (lokalizacji genów)

• Większość, inaczej niż w metodach komputerowych, oparta na wykrywaniu i badaniach transkryptów (RNA).

• Analizy hybrydyzacyjne w tym m.in. tzw. hybryd. Zoo – gdzie pozytywny sygnał hybr. dla DNA z każdego gat. oznacza, że gen np. wybrany ludzki jest również obecny w pozostałych gat., ale hybrydyzujące fr. na DNA krowy i królika są mniejsze niż fragmenty na próbkach DNA ludzkiego i szympansa – tzn. sekwencje homologiczne wobec sondy obecne są we wszystkich 4 gat. ale występują w innym otoczeniu sekwencyjnym.

• 

Synteza genu na bazie mRNA

• Frakcja mRNA izolowana z komórek specjalizujących się w nadprodukcji jednego z białek (jak np. insulina). Do syntezy dsDNA (genu) wykorzystana odwrotna transkryptaza, RNazaH i polimeraza DNA

Synteza chemiczna genu. Białko jako produkt genu poddane hydrolizie, następnie określona sekwencja (kolejność) aminokwasów, które je tworzą, dalej wykorzystując zasady działania kodu genetycznego, syntetyzuje się i łączy z sobą kolejne trójki nukleotydow odpowiedzialnych za konkretny aminokwas, do tak utworzonej nici ssDNA polimeraza DNA „dobudowuje” nić komplementarną tworząć dsDNA (gen), tak więc na bazie wiedzy o strukturze białka tworzono gen, z którego ono powstało

Ustalenie funkcji genu - metody komputerowe

• Analizy baz danych, odpowiednie programy

• Poszukiwania homologii wobec genów już opisanych o zdefiniowanej funkcji. G. homologiczne wywodzą się od wspólnego przodka (nie muszą mieć identycznej sekwencji nt). Wśród nich:

• Ortologi – homologi obecne u różnych organizmów, które przed rozdzieleniem się gat. miały wspólnego przodka. Geny takie zwykle maja takie same funkcje. Np. gen mioglobiny ludzkiej i szympansa.

• Paralogi – obecne w tym samym org. (członkowie rodzin wielogenowych), np. g. mioglobiny i β-globiny człowieka.

• Homologia ≠ podobieństwo!! (geny są lub nie spokrewnione)

Analizy sekwencji AA

• Przedmiotem analiz są raczej sekwencje AA (a nie DNA). Niespokrewnione geny bardziej różnią się przy porównywaniu sekw. aminokw. Wynik analiz porównawczych jest obdarzony mniejszym błędem (białka złożone z 20 AA, a DNA tylko z 4 nt).

• Program przyrównuje badaną s. do tych zawartych w DB. Wartość wyliczonego współczynnika decyduje o homologii badanych s. (ocena stopnia identyczności dwóch sekwencji – liczba pozycji, w których w obu sekwencjach obecny jest dany AA ).

• BLAST - popularny program m.in. do identyfikacji spokrewnionych sekw. Identyczność sekw. – 76%; na poziomie AA – 26%.

Metody eksperymentalne

RNAi (siRNA, interferencja RNA) – sposób inaktywacji genu poprzez zniszczenie jego mRNA.

• Wprowadzenie do kom. długich dwuniciowych (dsRNA) o sekw. homologicznych wobec docelowego mRNA (proces indukowany np. wprowadzeniem do kom. wektorów retrowirusowych). Sekwencja ds. RNA zaprojektowana z zachowaniem zasady komplementarności wobec badanego genu o znanym składzie nt.

• Indukcja zjawiska siRNA

• Efekt – degradacja mRNA, brak produktu genu (zahamowanie syntezy białek)

• Analizy fenotypowe

Wymuszona nadekspresja genów – stworzenie organizmu, w którym badany gen wykazuje nadaktywność wobec zwykłego odpowiednika

• Osiągana przez wprowadzenie do kom. wektora z silnym promotorem (wydajna transkryp. i duża ilość białka) oraz badanym genem (używa się jego cDNA, który nie zawiera intronów jest wiec krótszy i łatwiejszy w manipulacjach).

• Stwierdzenie jak to zjawisko wpływa na fenotyp organizmu transgenicznego i stąd informacja o funkcji tego genu.

Kryteria wyboru obiektu badań

• zapotrzebowanie ze strony firm biotechnologicznych – rośliny o dużym znaczeniu gosp./ekonom. – rolnictwo (gatunki uprawne), medycyna, przemysł spożywczy, farmaceutyczny.

• organizmy modelowe (E.coli, A.thaliana), dotychczasowa wiedza na ich temat (np. komórki drożdży ważnym modelem w badaniach komórek Eukaryota – w tym np. mechanizmy regulacji funkcjonowania genów, interakcji między nimi)

• aktualny stan zaawansowania metod molekularnych i informatycznych (bioinformatyka) i wynikająca z niego aktualna wiedza o gat. użytkowych będących obiektem zainteresowania rozmiary genomu i stopień jego poznania

Metody transformacji roślin

• Wprowadzenie obcego DNA do genomu biorcy utrudnia ściana kom.

• Brak uniwersalnych metod transformacji - specyficzne dla gatunku, rodzaju komórek. Konkretne warunki opracowywane dla wybranych gatunków/tkanek nie muszą byś skuteczne w innych.

• Szczególna trudność - transformowanie roślin jednoliściennych (m.in. zboża).

• Komórki, obiekt transformacji, przeprowadzane wstępnie w stan tzw. kompetencji (zmiana struktury ściany kom.).

• Nie zawsze celem transformacji musi być ostateczna regeneracja całej rośliny. Niekiedy kom. roślinne, zależnie od charakteru nowej cechy, mogą być utrzymywanie w stanu zawiesiny komórkowej.

Rodzaje transformacji

• Autonomiczna – gen dawcy wprowadzany do komórek biorcy i replikowany niezależnie od jego genomu (procedury efektywne w transformacji drobnoustrojów). Możliwa dzięki użyciu odpowiednich wektorów (miejsca ori, ARS)

• Integracyjna – gen dawcy trwale integruje się z genomem gospodarza i podlega replikacji jak pozostałe jego geny (podstawa procedur w transformacji organizmów wyższych), techniki wektorowe i bezwektorowe (rekombinacja niehomologiczna).

Kryteria doboru metody transform.

Wymagania stawiane przed wybraną metodą:

• wydajny sposób transferu DNA (inny dla jedno- i dwuliściennych),

• zdolność transformowanych komórek do regeneracji,

• odpowiednia metoda selekcji transformantów.

Dodatkowe cechy optymalnej metody transformacji:

• Powtarzalna, wysoka wydajność transformacji,

• Krótki czas hodowli,

• Duża częstość występowania zdrowych, płodnych roślin,

• Relatywna prostota techniczna wykonania,

• Uniwersalność – szeroki wachlarz gatunków

• Ogólne koszty zabiegów

Metoda wektorowa

• Korzysta z wektorów, naturalnych, sztucznych. Umożliwiają bezpieczny transfer genów do kom. nowego gospodarza.

• Naturalne wektory obecne m.in. w komórkach A. tumefaciens. Dzięki nim bakterie te posiadają naturalną zdolność wprowadzania swojego DNA do kom. roślin. W wektorze tym zakodowana jest informacja o białkach niezbędnych do zaatakowania rośliny.

• Plazmid Ti wnika do kom., a jeden z jego elementów (T-DNA), integruje się z genomem gospodarza – agroinfekcja (agrotransformacja).

• W obszar T-DNA można wstawić geny innego gatunku.

• Ograniczenie - rośliny jednoliścienne (zboża) w minimalnym stopniu ulegają agroinfekcji.

Agroinfekcja

• Podstawa tzw. wektorowych metod uzyskiwania roślin transgenicznych to zjawisko genetycznej transformacji komórek roślinnych przez bakterie rodzaju Rhizobiaceae – Agrobacterium tumefaciens lub A.rhizogenes (ten sam co bakterie brodawkowe - symbioza z korzeniami roślin motylkowych)

• To gram-ujemne bakterie glebowe. Efekt to pojawienie się rakowatych narośli w miejscach infekcji (A.t) lub indukcja dużej liczby włośnikowatych korzeni (A.r).

• Bakterie pod wpływem chemotaksji przyłączają się do komórek roślinnych, a następnie przenoszą część swojego naturalnego plazmidu Ti lub Ri do niektórych komórek.

Modyfikacja przy użyciu A. tumefaciens

• Baketrie mają naturalną zdolność wprowadzania swojego DNA do kom. roślin. Część wprowadzonych genów powoduje powstanie tumorów (narośli) na łodygach – A. tumefaciens

• Geny te można usunąć a w ich miejsce wstawić dowolny gen, który zostanie wprowadzony do rośliny. Zamiast narośli roślina uzyska odporność np. na herbicydy - środki ochrony roślin.

• Przy użyciu A. tumecaciens modyfikowane głównie rośliny dwuliścienne (np. soja, rzepak, bawełna, tytoń). Do modyfikacji roślin jednoliściennych (zbóż) stosowane metody bezpośredniego wprowadzenia DNA (bez udziału wektora).