Paulina Krzemińska 2.11.2011r.

Opis doświadczenia 2:
Aminokwasy – właściwości i reakcje.

W poniższych reakcjach wykorzystywałam roztwór białka jaja kurzego dostępny dla całej grupy, który został sporządzony poprzez oddzielenia białka od żółtka i dodanie do niego 100 ml dwuprocentowego roztworu NaCl.

Przeprowadzone reakcje:

1. Reakcja ninhydronowa:

Reakcja ta opiera się na szeregu reakcji utleniania α-aminokwasów oraz redukcji ninhydryny podczas której powstaje barwnik zwany purpurą Ruhemanna o barwie fioletowoniebieskiej oraz aldehyd o liczbie atomów węgla o 1 mniejszej, niż wyjściowy aminokwas.

Dodany odczynnik	Glicyna	Prolina	Białko	Badany aminokwas	H2O
Roztwór ninhydryny w etanolu + ogrzewanie / obserwacje	Zawartość probówki od razu po dodaniu odczynnika stała się fioletowa, po ogrzaniu roztwór miał granatowe zabarwienie	Zabarwienie lekko żółte, a po podgrzaniu pomarańczowe	Po dodaniu odczynnika powstały dwie warstwy, górna była mętna; po ogrzaniu górna warstwa była ciemnoniebieska, a dolna stała się mętna i miała kolor fioletowy	Po ok. minucie od dodania odczynnika probówka zabarwiła się delikatnie na fioletowo, natomiast po podgrzaniu na granatowo	Roztwór nie zmieniał się
Wnioski	W pierwszej, trzeciej i czwartej probówce wykryłam α-aminokwas.

1. Reakcja z kwasem azotowym (III) van Slyke’a:

Reakcja ta polega na przeprowadzeniu deaminacji naszych aminokwasów.

Dodany odczynnik	Glicyna	Białko	Badany aminokwas
NaNO2 + CH3COOH / obserwacje	Wydzieliły się pęcherzyki gazu	Po wstrząśnięciu probówką wytrącił się kłaczkowaty osad, a na powierzchni cieczy roztwór zaczął się pienić	Wydzieliły się pęcherzyki gazu
Wnioski	Wszystkie probówki zawierają grupę aminową.

1. Reakcja biuretowa Piotrowskiego:

Próba ta ma na celu wykrycie wiązania peptydowego, które daje niebiesko-fioletowe kompleksy z dwudodatnim jonem miedzi. Daje pozytywny wynik, gdy w cząsteczce występują przynajmniej 2 tego typu wiązania.

Dodany odczynnik	Glicyna	Arginina	Dipeptyd	Tripeptyd	Białko	Badany aminokwas	H2O
NaOH + CuSO4 / obserwacje	Lekko niebieski	Lekko niebieski	Po dodatku NaOH: zmętnienie; po dodatku CuSO4: niebieski kolor	Po dodatku NaOH: zmętnienie; po dodatku CuSO4: niebieski kolor	Fioletowy	Lekko niebieski	Lekko niebieski
Wnioski:	Moje doświadczenie potwierdziło wiele wiązań peptydowych tylko w przypadku białka. Powinno również potwierdzić w przypadku tri peptydu. Nieprawidłowe obserwacje mogą być spowodowane niezbyt czystymi odczynnikami

1. Reakcja cystynowa:

Ogrzewanie aminokwasu w silnie alkalicznym środowisku powoduje wydzielenie się jonów siarczkowych z cysteiny bądź cystyny, które następnie identyfikujemy wytrącając je z Pb²⁺i otrzymując czarny osad.

Dodany odczynnik	Glicyna	Cysteina	Cystyna	Metionina	Badany aminokwas	Białko	H2O
NaOH + ogrzewanie + Pb(CH3COO)2 / obserwacje	Żółto-brązowa	Czarny osad	Czarny osad	Żółto-brązowa	Żółto-brązowa	Czarny osad	Żółto-brązowa
Wnioski	Cysteina lub jej pochodne zostały wykryte w probówkach 2, 3 i 6.

1. Reakcja z nitroprusydkiem sodu na obecność grup sulfhydrylowych cysteiny:

Reakcja ta daje pozytywny wynik jedynie z cysteiną, z którą nitroprusydek sodu tworzy kompleks o czerwonym zabarwieniu, który jest bardzo nietrwały i jego kolor zaraz po zajściu reakcji zanika.

Dodany odczynnik	Glicyna	Cysteina	Cystyna	Metionina	Badany aminokwas	Białko	H2O
Nitroprusydek sodu + stały siarczan amonu + stężony NH3 / obserwacje	Żółta barwa	Roztwór zabarwił się na kolor malinowo-różowy	Żółta barwa	Żółta barwa	Żółta barwa	Żółta barwa	Żółta barwa
Wnioski	Cysteina znajduje się tylko w drugiej probówce

1. Wykrywanie metioniny metodą McCarthy – Sullivana:

Metionina w ustalonym pH daje z nitroprusydkiem sodu (Na₂Fe(CN)₅NO) czerwony związek.

Dodany odczynnik	Metionina	Cysteina	Białko	Badany aminokwas	H2O
NaOH + Gly + Na2Fe(CN)5NO + ogrzewanie + HCl (po ochłodzeniu) / obserwacje	Czerwone zabarwienie	Białe dymy, roztwór bez zmian	Pojawiły się białe dymy i biały osad, natomiast roztwór był zielono-brązowy	Czerwone zabarwienie	Brak obserwacji
Wnioski	W probówce 1 i 4 jest metionina

1. Reakcja ksantoproteinowa:

W tej reakcji możemy wykryć aromatyczne aminokwasy, które pod wpływem nitrowania dadzą pochodne o żółtej barwie.

Dodany odczynnik	Glicyna	Tyrozyna	Tryptofan	Białko	Badany aminokwas	H2O
HNO3 + ogrzewanie +NaOH (po ochłodzeniu)/ obserwacje	Roztwór bezbarwny	Jasnożółty, po ochłodzeniu i dodaniu zasady - pomarańczowy	Żółty, później ciemno pomarańczowy	Powstał osad oraz intensywnie żółty roztwór, po zalkalizowaniu zaczął się pienić i roztwór stał się ciemno pomarańczowy	Podczas całej reakcji lekko żółty	Brak zmian
Wnioski	Aminokwasy aromatyczne znajdują się w probówce 2, 3 i 4.

1. Reakcja Pauly’ego na obecność histydyny i tyrozyny:

Reakcja, która tutaj zachodzi ma na celu wykrycie pierścienia aromatycznego poprzez sprzęganie się związku diazowego z pierścieniem histydyny bądź tyrozyny. Produktem reakcji jest barwnik azowy o kolorze pomarańczowym.

Dodany odczynnik	Glicyna	Histydyna	Tyrozyna	Białko	Badany aminokwas	H2O
Kwaśny roztwór kwasu sulfanilowego + NaNO2 + chłodzenie + Na2CO3 / obserwacje	Żółty roztwór	Ciemny, czerwono - pomarańczowy	Herbaciany, prawie czarny	Czerwony	Lekko pomarańczowy	Jasno żółty
Wnioski	Histydyna lub tyrozyna znajduje się w probówce 2, 3 oraz 4

1. Reakcja Voiseneta na obecność tryptofanu:

Tryptofan tworzy fioletowy kondensat z aldehydem mrówkowym.

Dodany odczynnik	Glicyna	Tryptofan	Badany aminokwas	Białko	H2O
HCHO + HCl (pozostawić na ok. 5 min) + NaNO2 / obserwacje	Bezbarwny	Początkowo żółty kolor roztworu, po dodaniu NaNO2 roztwór stał się fioletowy	Bezbarwny	Powstał biały osad, po dodaniu NaNO2 roztwór stał się fioletowy	Bezbarwny
Wnioski	Tryptofan znajduje się w probówce 2 i 4.

1. Reakcja Sakaguchi’ego na obecność argininy:

Reakcja polega na utlenieniu argininy przez NaBrO w środowisku zasadowym, a następnie wytworzeniu barwnego produktu z α-naftolem. Po niedługim czasie kolorowy produkt może się odbarwić, ponieważ silny utleniacz będzie dalej utleniał produkty reakcji.

Dodany odczynnik	Glicyna	Arginina	Badany aminokwas	Białko	H2O
NaOH + naftol + NaBrO / obserwacje	Bezbarwny	Lekko różowa	Bezbarwny	Lekko czerwony	Żółty
Wnioski	Arginina znajduje się w probówkach 2 i 4.

Aminokwas, który otrzymałam to METIONINA:

Schemat rozróżnienia aminokwasu od białka i dipeptydu:

Gdy mamy 3 probówki i w każdej z nich osobny związek do analizy jakościowej (białko, dipeptyd i aminokwas), to analizę rozpoczniemy od reakcji biuretowej Piotrowskiego. Dzięki niej będziemy mogli zidentyfikować probówkę z białkiem, ponieważ aby dała pozytywny wynik potrzebujemy przynajmniej dwóch wiązań podwójnych.

Zakładając, że mamy do czynienia z konkretnym aminokwasem (np. metioniną będącą związkiem, który miałam wykryć), możemy posłużyć się charakterystyczną dla niej reakcją, która nie da pozytywnego wyniku dla dipeptydu, ale da pozytywny wynik dla białka.

Na podstawie tych dwóch reakcji możemy wywnioskować co znajduje się w poszczególnej probówce:

Numer probówki	Reakcja biuretowa	Reakcja McCarthy-Sullivana	Przewidywany związek
1.	+	+	Białko
2.	-	-	Dipeptyd
3.	-	+	Metionina