Izolacja DNA z krwi	3C/12/04

Procedurę opracowały: mgr inż. Joanna Kielar & mgr Nina Ciosek

Procedurę zatwierdziła: mgr Paula Mazurek

Procedura obowiązuje w laboratorium diagnostyki molekularnej 3 City Laboratorium Medyczne Sp. z o.o.

ul. Podwale Przedmiejskie 20/5

80-226 Gdańsk

Miejscowość, data: Kierownik 3 City Laboratorium Sp. Z o.o. w Gdańsku: ..…………………………… …………………………………………………………………………………

1. CEL PROCEDURY:

Celem procedury jest szybka i wydajna izolacja genomowego DNA o wysokiej czystości z krwi, nadającego się do analiz molekularnych.

1. ZAKRES ZASTOSOWANIA:

Procedura ma zastosowanie w przypadku izolacji DNA z krwi świeżej lub mrożonej pobranej od pacjenta. Dotyczy personelu wykonującego analizy w laboratorium diagnostyki molekularnej.

1. PODSTAWOWE POJECIA I TERMINY:

   1. DNA (kwas deoksyrybonukleinowy) – materiał genetyczny

   2. Kolumienka - minikolumna, zawierająca odpowiednie złoże, wydajnie

i selektywnie wiążące kwasy nukleinowe w celu ich izolacji.

1. Złoże krzemionkowe - wykazujące właściwości silnego powinowactwa DNA.

2. Wirówka - urządzenie do rozdzielania zawiesin komórkowych.

3. Eppendorf – probówki wirownicze

4. Pipety automatyczne & odpowiednie końcówki do pipet – jest to specjalny rodzaj pipet miarowych służąca do przenoszenia i odmierzania cieczy przy użyciu jednorazowych końcówek.

5. Worteks - proste urządzenie laboratoryjne używane do szybkiego i efektywnego mieszania małych objętości substancji ciekłych lub do tworzenia zawiesin.

6. Supernatant - górna, płynna warstwa(faza), wyodrębniona przez wirowanie.

7. Bufor elucyjny – bufor pozwalający na wyeluowanie oczyszczonego DNA ze złoża krzemionkowego.

8. Bufor lizujący – bufor do trawienia enzymatycznego używany w początkowym etapie izolacji materiału genetycznego (DNA lub RNA) ze struktur komórkowych.

9. Proteinaza K – silna proteaza uczestnicząca w procesie lizy.

1. OSOBA/Y ODPOWIEDZIALNE ZA REALIZACJĘ PROCEDURY:

Osobą odpowiedzialną za realizację procedury jest biolog molekularny Katarzyna Kułaczkowska. W przypadku nieobecności w/w pracownika pełnomocnikiem jest pracownik naukowo- techniczny Anna Stankiewicz.

1. PRZEBIEG POSTĘPOWANIA:

   1. Odebranie transportu próbek krwi pacjentów.

   2. Wprowadzenie do systemu poszczególnych próbek i przyporządkowanie indywidualnych etykiet kodów kreskowych.

   3. Stworzenie odpowiednich warunków przechowywania próbek, aż do momentu rozpoczęcia procedury izolacji.

   4. Rozpoczęcie izolacji DNA w komorze laminarnej.

   5. Izolacja DNA z krwi według instrukcji (załącznik nr 1)- instrukcja załączona do zestawu firmy A&A Biotechnology „ Bood Mini”.

   6. Analiza stężenia i czystości DNA za pomoca urządzenia „NanoDrop” (pomiar spektrofotometryczny), w celu oceny przydatności wyizolowanego DNA do dalszych analiz.

   7. Końcowym etapem będzie wypełnienie formularza wyników.

2. PUNKTY SZCZEGOLNEJ TROSKI

   1. Szczególna uwagę należy zwrócić na uwagi zamieszczone w instrukcji do zestawu (załącznik nr 1).

   2. Dodatkowo szczególniej troski wymaga proteinaza K, która musi być przechowywana w temperaturze 7-9^oC.

   3. Ważne jest również skrupulatne dodawania odpowiednich odczynników oraz mieszanie ich przed bezpośrednim zastosowaniem.

   4. W razie podejrzenia popełnieni błędu należy rozpocząć procedure izolacji od nowa (punkt 5.4).

3. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI

   1. Krew jest materiałem niebezpiecznym ze względu na potencjalną zawartość mikroorganizmów patogennych lub substancji zagrażających zdrowiu, bądź życiu człowieka. Przy pracy z próbkami krwi należy stosować się do wymogów dotyczących biologicznych materiałów niebezpiecznych.

   2. Zaleca się przeprowadzać całą procedurę izolacji w komorze klasy II bezpieczeństwa biologicznego, używać ochronnej odzieży laboratoryjnej oraz rękawiczek jednorazowych.

   3. Zalecane jest używanie jałowych końcówek do pipet z filtrami.

   4. Należy unikać dotykania ścianek minikolumn pipetą, aby nie przenosić śladów DNA pomiędzy kolejnymi minikolumnami.

   5. W przypadku rozlania cieczy zawierającej krew, zanieczyszczoną powierzchnię zmyć najpierw wodą z detergentem, a następnie 1% roztworem podchlorynu sodu.

4. DOKUMENTY ZWIĄZANE

   1. Instrukcja izolacji Dna z Kwie (A&A Biotechnology – MiniBlood).

   2. Przepisy BHP laboratorium diagnostyki molekularnej.

   3. Umowa z NFZ i prywatnymi placówkami.

   4. Umowa ze spółka utylizacji odpadów biologicznych.

   5. Pozwolenie na prace z materiałem biologicznym.

   6. Procedura postępowania po ekspozycji zawodowej na potencjalnie zakażoną krew.

5. ZAPISY

Dokumentacja przyjmowanych próbek, jak i przeprowadzonych izolacji DNA oraz wyniki są gromadzone w archwiwum laboratorium diagnostyki molekularnej, zarówno w wersji elektronicznej jak i wersji papierowej.

1. ZAŁĄCZNIKI

   1. Wzór formularza do wielokrotnego stosowania w celu wprowadzenia wyników.

2. ZACHOWANIE PERSONELU W SYTUACJACH ZAGROŻENIA ŻYCIA

11.1. Powiadomienie służb ratunkowych ( numer 112), udzielenie pierwszej pomocy podczas oczekiwania na karetke.

11.2. W przypadku pożaru poinformowanie straży pożarnej oraz natychmiastowa ewakuacja.

11.3. W przypadku ekspozycji pracownika laboratorium na krew postępować zgodnie z załącznikiem nr 2.

FORMULARZ

- IZOLACJA DNA Z KRWI

3 City Laboratorium Medyczne Sp. z o.o.

Data pobrania krwi:

Dane pacjenta:

Imię:

Nazwisko:

PESEL:

Data urodzenia:

Płeć:

Adres:

Telefon:

Charakterystyka próbki:

Przeznaczenie próbki:

Stężenie wyizolowanego DNA:

Czystość:

Zlecający:

Data wykonania izolacji DNA:

Procedurę zrealizował/a:

Miejsce na pieczątkę

i podpis kierownika laboratorium.