METODY IMMUNOLOGICZNE Z ZASTOSOWANIEM ZNACZNIKÓW

Metody biochemiczne wykorzystywane w immunodiagnostyce do wykrycia obecności antygenów lub przeciwciał w badanym próbce:

fluorymetryczne

radioimmunologiczne

immunoenzymatyczne

chemiluminiscencyjne – pojawienie się światła fluorescencyjnego pod wpływem reakcji chemicznych

Metody radioimmunologiczne (RIA)

• Polega na wykrywaniu relacji antygenswoiste przeciwciało

• Wysoka specyficzność reakcji immunologicznej połączona z wysoką czułością detekcji radioizotopu (pomiar promieniowania izotopów promieniotwórczych związanych z jedną ze składowych reakcji

• Pomiar stężenia antygenów (np. hormony) przy użyciu przeciwciał znakowanych radioizotopem (¹²⁵I lub tryt- bo ma krótki czas rozpadu, dlatego najczęściej)

• Charakteryzują się wysoką czułością i mają szerokie zastosowanie praktyczne do ilościowych oznaczeń antygenu lub przeciwciała

(oznaczanie stężenia w płynach ustrojowych hormonów, obecność białek towarzyszących nowotworom antygen karcyno-embrionalny CEA, α-fetoproteiny AFP, oznaczanie ilości swoistych przeciwciał klasy IgE, stężenia witamin i leków oraz wykrywania autoprzeciwciał

• Można je prowadzić w dwóch wariantach:

1. Oba składniki reakcji w fazie płynnej

2. Jeden ze składników reakcji związany z fazą stałą, którą jest ściana probówki lub mikropłytki

Odczytać: czynnik scyntylacyjny

TEST RAST

in vitro

• RAST (radioallergosorbent test)

• ilościowa ocena poziomu IgE swoistych dla danego alergenu

• alternatywa do SPT (Skin Prick Test)

• oznaczenie stężenia specyficznych IgE skierowanych przeciwko znanemu/podejrzewanemu alergenowi (Stężenie IgE w surowicy zdrowych jest niskie → poniżej 0.005% wszystkich immunoglobulin)

• należy do grupy metod radioimmunologicznych → przeciwciała anty-IgE znakowane radioizotopem ¹²⁵I

Wykonanie:

1. opłaszczanie oczyszczonego antygenu (alergenu) na nośniku (KULKI LATEKSU, krążki bibuły, celuloza, powierzchnia mikropłytek)

2. Inkubacja z surowicą badaną (w kolejnych rozcieńczeniach)

3. Kilkakrotne opłukanie

4. Inkubacja z przeciwciałami (anty-IgE II-rzędowe) znakowanymi radioizotopem ¹²⁵I

swoiste IgE w surowicy (śladowe)= odczyt promieniowania γ (rozpoznanie końca Fc)

Interpretacja wyniku (brak IgE?) CAŁKOWITY BRAK IgE u osoby całkowicie niealergicznej

• związanie wszystkich IgE przez komórki tuczne

• kompleksy immunologiczne IgE-anty-IgE

• wykrycie IgE swoistych dla alergenu nie jest równoznaczne z objawami klinicznymi alergii (nie rozwija się alergia pełnoobjawowa nie jest to równoznaczne

• kontrola dodatnia → surowica o znanym stężeniu IgE o danej swoistości

Zastosowanie:

• wczesna diagnostyka atopii u noworodków (wrodzona, genetycznie uwarunkowana nadprodukcja IgE, które bez sensu=zbyt pochopnie odpowiadają na niegroźne alergeny)

• płucna postać aspergillozy

• diagnostyka zaburzeń odporności (np. syndrom hiper-IgE)

• diagnostyka parazytologiczna (nie wykryjemy przeciwko alergenom, tylko przeciwko pasożytom)

TEST RIST

(bardzo czuły test)

• RIST (radioimmunabsorbent test)

• ilościowa ocena poziomu całkowitego IgE w surowicy (wszystkie, jak lecą)

• należy do grupy metod radioimmunologicznych → przeciwciała anty-IgE znakowane ¹²⁵I

Wykonanie:

1. opłaszczenie nośnika przeciwciałami anty-IgE przyklejone końcami Fc (królicze przeciwciała anty-IgE)

2. Inkubacja z surowicą badaną (w kolejnych rozcieńczeniach)

3. Inkubacja z przeciwciałami (anty-IgE) znakowanymi radioizotopem ¹²⁵I

swoiste IgE w surowicy = odczyt promieniowania γ

Interpretacja wyniku

• kontrola dodatnia → surowica o znanym stężeniu IgE

Stężenie IgE zależy od:

• wieku (niższe u noworodków, wyższe u dorosłych, a dalej z wiekiem znowu spadek)

• płci (wyższe u mężczyzn)

• stylu życia (np. palenie)

• różnorodnych czynników środowiskowych

odczyt scyntylacyjny

METODY IMMUNOENZYMATYCZNE (EIA)

znacznikiem jednego z reagentów (antygenu lub przeciwciała) jest enzym PEROKSYDAZA CHRZANOWA HRP

pomiar absorbancji barwnego produktu reakcji → intensywność koloru jest wprost proporcjonalna do stężenia poszukiwanego antygenu

• substrat – H₂O₂ + chromogen

• stopowanie reakcji

wyższa czułość niż w technikach fluorometrycznych

jeden enzym katalizuje powstanie wielu cząsteczek produktu

ENZYMY muszą spełniać warunki:

• rozpuszczalne

• stabilne

• łatwo łączą się z białkiem

• wiązanie z białkiem jest trwałe

• nie powinny występować w płynach biologicznych (ewentualnie tylko w ilościach śladowych

substrat musi być łatwo dostępny dla enzymu

produkt musi być barwny

TEST ELISA

• jeden z najczęściej stosowanych testów do oceny ilościowej w badanym materiale antygenu lub przeciwciała

• test jest szybki i może być wykorzystywany w badaniach masowych

TEST ELISA bezpośredni (najrzadsze, najdroższe)

Płytki opłaszczone przeciwciałami

Antygen, przeciwciało pierwszorzędowe połączone z enzymem, substrat dla enzymu związanego z przeciwciałem diagnostyka chorób zakaźnych HIV, HCV

TEST ELISA pośredni

Antygen, przeciwciało pierwszorzędowe, przeciwciało drugorzędowe połączone z enzymem, substrat dla enzymu związanego z przeciwciałem drugorzędowym

TEST ELISA kanapkowy

Przeciwciało anty-antygen, antygen, przeciwciało pierwszorzędowe, przeciwciało drugorzędowe, substrat dla enzymu

Wykonanie:

1. naniesienie białka (antygenu) i wiązanie z powierzchnią studzienek płytki, w których są przeciwciała

przepłukiwanie studzienek w celu usunięcia niezwiązanych cząsteczek

1. nanoszona jest próba badana, przeciwciała w niej zawarte łączą się z antygenem związanym z powierzchnią studzienki; przepłukiwanie studzienek w celu usunięcia niezwiązanych cząsteczek

2. nanoszony jest koniugat przeciwciała z enzymem, który wiąże się z przeciwciałami, które wcześniej zostały związane z antygenem na powierzchni studzienek; przepłukiwanie studzienek w celu usunięcia niezwiązanych cząsteczek

3. dodawano bezbarwnego substratu enzymu, zachodzi reakcja enzymatyczna i powstaje barwny produkt

Zastosowanie:

• powszechnie do wykrywania obecności w płynach biologicznych antygenów i przeciwciał w chorobach zakaźnych i pasożytniczych

• ilościowa ocena stężenia wielu hormonów

• wykrywanie obecności autoantygenów

TECHNIKI IMMUNOMORFOLOGICZNE

-pozwalają wykryć obecność przeciwciała lub antygenu związanego bezpośrednio z komórką lub tkanką

-metody zarówno jakościowe i ilościowe, charakteryzujące się bardzo wysoką czułością

ZASTOSOWANIE:

-wykrywanie obecności antygenów nowotworowych w komórkach

-różnicowanie nowotworów o niejasnym pochodzeniu (przy użyciu przeciwciał monoklonalnych)

-wykrywanie kompleksów immunologicznych w tkankach oraz ocenie składu tych kompleksów

-wykrywanie obecności antygenów pasożytów w zakażeniach

-wykrywanie obecności antygenów bakteryjnych i wirusowych w zakażeniach

-określanie typu immunoglobulin i antygenów różnicowania komórek limfoidalnych w zespołach limfoproliferacyjnych

ogólna zasada – wyznakowanie jednego ze składników reakcji antygen-swoiste przeciwciało znacznikiem (markerem)

biorąc pod uwagę przebieg reakcji można podzielić je na:

• metody bezpośrednie (wyznakowany składnik reakcji wiąże się bezpośrednio z drugim składnikiem)

• metody pośrednie (najpierw zachodzi reakcja między nieznakowanymi reagentami-antygen i przeciwciało, a następnie wykrywa się powstały kompleks przy pomocy znakowanych przeciwciał antyglobulinowych)

PAP (peroksydaza – anty-peroksydaza)

• ilościowa ocena identyfikacji komórek (w tkankach) w oparciu o ekspresję markerów powierzchniowych (Ag-Ab)

• należy do metod immunoenzymatycznych

• bardzo czuła i często stosowana

Wykonanie:

1. Inkubacja tkanki ze specyficznymi przeciwciałami przeciwko antygenom powierzchniowym (AbI)

Jeśli poszukiwany Ag jest obecny w tkance swoiste przeciwciała zwiążą się → KI

2. Inkubacja z przeciwciałami anty-Ig (AbII)

Jeśli powstał KI , przeciwciała anty-Ig zwiążą się.

3. Inkubacja z przeciwciałami anty- peroksydaza (otrzymane z tego samego gatunku co AbI, połączone z peroksydazą) → KI (peroksydaza-anty-peroksydaza).

Kompleks peroksydaza-anty-peroksydaza wiąże się do przeciwciał anty-Ig

Substrat dla peroksydazy (enzym) → zmiana koloru

APAAP (fosfataza alkaliczna - anty- fosfataza alkaliczna)

stosowana do wykrywania obecności antygenów w tkankach (szczególnie te bogate w peroksydazę)

Wykonanie:

1. Inkubacja tkanki ze specyficznymi przeciwciałami przeciwko antygenom powierzchniowym (AbI)
   Jeśli poszukiwany Ag jest obecny w tkance swoiste przeciwciała zwiążą się → KI

2. Inkubacja z przeciwciałami anty-Ig (AbII)

Jeśli powstał KI , przeciwciała anty-Ig zwiążą się.

3. Inkubacja z przeciwciałami anty- alkaliczna fosfataza (otrzymane z tego samego gatunku co AbI, połączone z alkaliczną fosfatazą) → KI (alkaliczna fosfataza- anty-alkaliczna fosfataza).

Kompleks alkaliczna fosfataza- anty-alkaliczna fosfataza wiąże się do przeciwciał anty-Ig

Substrat dla alkalicznej fosfatazy (enzym) → zmiana koloru

Pomiar absorbancji barwnego produktu reakcji → intensywność koloru jest wprost proporcjonalna do stężenia poszukiwanego antygenu

• substrat – H₂O₂ + chromogen