Wykład VII

1. Wybrane zagadnienia z biochemii gleby:

   1. 1897 – Bucherer wyekstrahował enzymy z komórek drożdży. Roztwór ten był zdolny do katalizowania alkoholowej fermentacji cukru. Bucherer nazwał ten roztwór „zymasse”.

   2. 1899 –Wood i in. sugerują, że znajdują się zewnątrzkomórkowe enzymy, które są bardzo aktywne.

   3. 1905 – 1910 – pierwsze pomiary aktywności enzymów w glebie dotyczyły pomiarów aktywności katalazy i peroksydazy.

   4. Summer wyizolował w krystalicznej formie ureazę, za co otrzymał nagrodę Nobla. W latach 1930 – 36 wyizolował pepsynę, trypsynę, chemotrypsynę. Stwierdzili, że enzymy te są białkami.

   5. 1950 – Hofmann i Seegener zaproponowali, aby żyzność gleby określać za pomocą indeksu, którego wartość byłaby definiowana przez aktywność enzymów glebowych.

   6. 1978 – Sapier i Ross twierdzą, że większe znaczenie mają enzymy pochodzące od drobnoustrojów niż od roślin i zwierząt, gdyż cechują się olbrzymią biomasą, wysoką aktywnością metaboliczną, selektywnie większą ilością enzymów zewnątrzkomórkowych niż rośliny i zwierzęta.

   7. 1978 – Skujnis dochodzi do wniosku, że uzyskanie „indeksu żyzności” tylko na podstawie aktywności enzymatycznej wydaje się nieprawdopodobne, gdyż aktywność enzymów związana jest z obecnością specyficznych substratów blisko poznanych z poziomem org. substancji i nie odzwierciedla ogólnego stanu zasobności gleby.

   8. 1981 – Tena i in.

   9. 1983 – Dick i Tabatabai stwierdzili, że Mg, Ca, Ba, Co, Ni, Zn, Mn pobudzają aktywność glebowej pirofosfatazy za pomocą tworzenia kompleksów (mostków) substrat – metal – enzym.

   10. 1984 – Speir sugeruje, że glebowa sulfataza może być użyta za indeks zasobności gleby w siarkę.

   11. 1985 – Dalton i in. stwierdzili, że enzymy mogą być wykorzystane do oceny zawartości przyswajalnych mikroelementów. Ureaza, która wymaga NI może być użyta do oceny zawartości tego metalu w glebie.

1. Aktywność enzymów w glebie:

AKTYWNOŚĆ ENZYMÓW W GLEBIE

Enzymy biotyczne Enzymy abiotyczne

(wewnątrzkomórkowe), występujące w

rozmnażających się komórkach

zakumulowane enzymy

Enzymy pozakomórkowe

Uwalniane z organizmów

żywych (wolne lub związane

ze składnikami gleby

nie związane zeskładnikami komórkowymi

w resztkach komórek

wydzielane przez mikroorganizmy

w martwych komórkach wydzielane przez mikroorganizmy wydzielane przez

organizmy roślinne i zwierzęce

enzymy wewnątrzkomórkowe

pozakomórkowe ze zniszczonych komórek

enzymy wolne lub związane ze składniami gleb

1. Pierwiastki i jakie enzymy są z nim związane:!!!!!!

WAHANIA AKTYWNOŚCI ENZYMÓW GLEBOWYCH

Enzym katalizujący przemiany C
Ksynkinaza
Celulaza
Inwertaza
B-glukozydaza
B-galaktozydaza
Enzym katalizujący przemiany N
Proteaza
Dipeptydaza
Amidaza
L- glutaminaza
Ureaza
Reduktaza azotanowa
Deaminaza argininy
L- asparaginaza
Enzym katalizujący przemiany S
Arylosulfataza
Enzym katalizujący przemiany P
Fosfataza alkaliczna
Fosfataza kwaśna
Fosfolipaza
Aktywność innych enzymów
Dehydrogenazy
Dehydrogenazy
Katalaza

1. AZOT- pierwiastek biogenny:

- wykorzystywany w procesach asymilacyjnych (azot jest budulcem materii organicznej) i dysymilacyjnych (redukcja enzymatyczna, w których azot jest pobierany ze środowiska w formie zredukowanej lub utlenionej);

- obieg azotu:

Do asymilatorów azotu wolno żyjących w glebie należą:

I. bakterie heterotroficzne

•         tlenowce - Azotobacter, Azotomonas, Beijrrinckia, Derxia, Achromobacter

•         mikroaerofile - Pseudomonas, Arthrobacter, Flavobacterium, Mycobacter Aerobacter

•         beztlenowce - niektóre gatunki Clostridium, np. C. pasteurianum, C. butyricum, C. pectinovorum

II. bakterie autotroficzne

•         bakterie fotosyntetyzujące - Rhodospirillum, Chlorobium, Chromatium

•         sinice - Nostoc, Cylindrospermum, Anabaena

AZOT na świecie [w Mg]:

- litosfera- 1x10¹⁷;

- atmosfera 3,9x10¹⁶;

- hydrosfera 2,3x10¹³;

- N organiczny w glebie 1x10¹¹;

- N w organizmach żywych 3,5x10⁹.

Procesy, wktórych uczestniczy:

- nitryfikacja, denitryfikacja, amonifikacja, mineralizacja, asymilacja, desymilacja,itp.

FORMY AZOTU W GLEBIE:

- swoiste związki próchniczne, aminokwasy, aminocukry, kwasy nukleinowe (94-96% w glebie);

- 4-6% azot mineralny w glebie.

WYKŁAD VIII

1. Bardzo ważnym etapem cyklu biogeochemicznego azotu w glebie jest uwolnienie azotu z substancji organicznej. Obecnie uważa się, że składa się ona z polimerów, polifenoli, pochodnych z rozkładu ligniny i amonokwasów.

2. Związki występujące w humusie (próchnicy) dzieli się na:

1. związki humusowe- wśród, których wyróżnia się kwasy huminowe- rozpuszczalne w stężonych zasadach; Kwasy huminowe to frakcja związków próchnicznych o barwie ciemnobrązowej do czarnej, które mogą być ekstrahowane z gleby tylko za pomocą rozpuszczalników alkalicznych (NaOH, KOH). Są nierozpuszczalne w wodzie w warunkach kwaśnych (pH < 2), a więc w dużo mniejszym stopniu wymywane z gleby, dlatego można je w sadach stosować jednorazowo na początku okresu wegetacji. Obok minerałów ilastych kwasy huminowe są jednymi z ważniejszych elementów kompleksu sorpcyjnego gleby.

2. kwasy fulwowe- to frakcja związków próchnicznych o barwie żółtej do żółtobrązowej. Ich cząsteczki są mniejsze, a budowa jest bardziej złożona od kwasów huminowych. Kwasy fulwowe cechują się wysoką zdolnością sorpcyjną – zwiększają zatrzymywanie jonów w kompleksie sorpcyjnym we wszystkich rodzajach gleb, co sprawia, że dostępność składników mineralnych dla roślin jest zwiększona. Frakcja ta ogranicza proces bielicowania gleb (wypłukiwania tlenków żelaza, krzemionki, fosforu i manganu w głąb gleby, co pogarsza jej właściwości fizyczne i sprzyja wymywaniu składników pokarmowych poza obręb korzeni). Kwasy fulwowe są rozpuszczalne w wodzie w całym zakresie pH i w warunkach naturalnych szybko przemieszczają się w głąb gleby. Wykorzystując je w praktyce sadowniczej trzeba uwzględnić konieczność ich uzupełniania w postaci kolejnych dawek preparatów. Kwasy fulwowe są szczególnie przydatne do podawania poprzez systemy fertygacji. (rozpuszczalne w H2O, alkoholach, alkaliach).

3. Huminy i ulminy to trzecia grupa, prawie nierozpuszczalna w żadnych odczynnikach chemicznych – frakcja związków próchnicznych o barwie czarnej nierozpuszczalnych w wodzie w całym zakresie pH. Huminy należą do najmniej zbadanych substancji próchnicznych.( zarówno kwasach jak i zasadach, różnią się budową i wielkością cząsteczek oraz rodzajem grup funkcyjnych w cząsteczce).

1. Kwasy fulwowe zawierają 1-3%N, Kwasy huminowe 2-6%N, kwasy huminowe zawierają od 2,5 do 5 razy więcej N niż kwasy fulwowe!!!

2. Mineralizacja azotu:

$\mathbf{W = \ }\frac{\mathbf{Cm:Nm}}{\left( \mathbf{1 - e} \right)\mathbf{*(Cr:Nr)}}$ $\mathbf{e = \ }\frac{\mathbf{C - CO}}{\mathbf{C - ogolny}}$ W- współczynnik transfiormacji charakteryzujący równowagę

mineralizacji i immobilizacji; N

W=1- min= immobilizacja W>1 mineralizacja > immobilizacja W<1 mineralizacja < immobilizacja

m- pochodzenie mikrobiologiczne r- pochodzenie roślinne Cm:Nm≈ 5

bezpośredni stosunek C:N 12:15 przy e=0,6- 0,7

1. Mineralizacja azotu:’

- głównie biologiczne formy azotu: białka, składniki ściany komórkowej, drobnoustroje, chityna, peptydoglikogen, kwasy nukleinowe;

- białko ulega hydrolizie do peptydów pod wpływem enzymów proteinaz, proteaz i peptydaz;

- termin mineralizacja azotu odnosi się do degradacji białek, aminokwasów i kwasów nukleinowych do NH4+.

PROTEOLIZA- wstępne stadium mineralizacji azotu organicznego z resztek roślinnych i zwierzęcych, gdyż głównym składnikiem tej masy jest białko. Proteolizę czyli rozkład białek przeprowadzają drobnoustroje mające enzymy proteolityczne; białko ze względu na swoją wielkość musi ulec rozkładowi poza komórką.

Enzymy proteolityczne inaczej nazywane proteazami sa enzymami trawiennymi i wydzielane są przez komórki do srodowiska zewnetrznego. Enzymy te rozszczepiaja wiązania peptydowe ppmiedzy resztami aminokwasów i są syntetyzowane między innymi przez bakterie z rodzaju Proteus, Bacillus, Clostridium, a także niektóre grzyby. Są one enzymami hydrolitycznymi i powoduja rozpad wiązań peptydowych (CO-NH), prowadzą do powstawania peptydów, polipetydów i peptanów. Dalszy etap rozkładu białek stanowi uwolnienie cząsteczek aminokwasów z peptydów.

Proteazy nie wykazuja zdolności substratowej tzn,że są zdolne hydrolizowac różne białka. W śród nich wyróżniamy:

- endopeptydazy- hydrolizujące białko z wytworzeniem poli i oligopeptydów;

- egzopeptydazy- odszczepiające pojedyńcze aminokwasy , włączane bezposrdnio do biosyntezy białek lub rozkładane w reakcjach deaminacji, dekarboksylacji lub transaminacji.

BIAŁKA SĄ ROZKŁADANE W 3 FAZACH:

1. Na proteiny działaja enzymy proteazy lub peptydohydrolazy, w wyniku czego powstaja krótsze łańcuchy, zwane polipeptydami;

2. Polipeptydy rozkładane są przez hydrolazy aminokwasowe i powstaja aminokwasy;

3. Aminokwasy ulegają procesowi nazywanemu amonifikacją i rozkładowi na amoniak i tresztę organiczną, która stanowią różne związki o różnej kaloryczności, są one związane w perocesach oddechowych lub włączane w cykl odżywiania.

Aminokwasy: wolne, peptydy, białka, związane z minerałami ilastymi, z próchnicą, kwasami muranowymi, itp.

1. Rozkład aminokwasów  - Aminokwasy są rozkładane przez odłączenie grupy α – aminowej i przekształcenie pozostałego szkieletu węglowego w jeden lub więcej metabolitów pośrednich. Aminokwasy, których szkielety węglowe służą do syntezy, nazywamy glikogennymi, a te które są przekształcane w ciała ketonowe, noszą nazwę ketogennymi. Niektóre aminokwasy mogą ulegać przekształceniu do wiązania jednego metabolitu pośredniego i są używane zarówno do syntezy glukozy, jak i ciał ketonowych. Także aminokwasy są jednocześnie glukogenne i ketogenne.

·         Procesy amonifikacji – w warunkach tlenowych, panujących zwykle w obiektach zabytkowych, przebiegają przy udziale następujących procesów:

I.        Dezaminacja hydrolityczna – polegająca na odłączeniu od aminokwasu amoniaku i powstaniu hydroksykwasu w myśl równania:

R-CH-NH₂-COOH + HOH = NH₃ + R-CHOH-COOH

Powstaje kwas mlekowy, tłuszczowy i inne, zależnie od rodzaju aminokwasu.

 

II. Reduktatywna COOH:

R-CH-NH2-COOH –(+2H+; NH3 )R-CH2-COOH kwas nasycony

III.     Dezaminacja przez utlenienie (oksydatywna)  - polegająca na odłączeniu aminokwasu i przyłączenie jednego atomu tlenu w  myśl równania:

R-CH-NH₂-COOH + ½ O₂ = NH₃ + R-CO-COOH

Powstaje aminokwas i ketokwas, np. kwas pirogronowy.

IV. Desaturatywna- rozkład amoniaku z utworzeniem kwasu organicznego nienasyconego:

NH2- CH-R-CH2-COOH-(NH3)-> R-CH=CH-COOH

V. Typu Sticklanda- nalezy do reakcji redox:

NH2-R-CH-COOH + NH2-R-CH-COOH –(H2O; 2NH3)-> R-C=O-COOH + R-CH2-COOH

Dezaminacja z odłączeniem siarkowodoru od aminokwasów siarkowych – wytwarza się amoniak, siarkowodór i kwasy organiczne, m.in. kwas pirogronowy. Szczególnie  uzdolnionym do wytwarzania znacznych ilości siarkowodoru z bogatych w aminokwasy siarkowe substancji są promieniowce. Siarkowodór przez nie produkowany powoduje czernienie farb zawierających biel ołowianą.

Są różne rodzaje deaminacji:

· hydrolityczna

· hydrolityczna z dekarboksylacją

· przez redukcję

· desaturatywna

· Utlenianie; Utlenianie aminokwasów prowadzi do powstawania ketokwasów.

· Zasady Schiffa; Aminokwasy, które są powiązane w postaci zasady Schiffa mogą ulegać

różnym przemianom biochemicznym tj. transaminacja, dekarboksylacja

Aminokwasy- związki organiczne których cząsteczki zawierają 2 gr funkcyjne, grupe amionową, zktóra ma wiązanie zasadowe i karboksylową.

DEKARBOKSYLACJA- prowadzi do wytworzenia amin oraz CO2, procesy dekarboksylacji mają charakter pierwotny lub wtórny , kiedy zachodza po uprzednim przekształceniu aminokwasu. W wyniku dekarboksylacji z aminokwasów obojętnych powstają monoaminy I rzędowe, a przykładem są: histydyna do histaminy, fenyloalanina do fenyloetyloaminy, tryptofanu do serotoniny, seryny do dietanoloaminy.

WYKŁAD IX

1. NITRYFIKACJA- proces przemiany amoniaku i soli amonowych na azotyny przez ich utlenianie pod wpływem nitrozobakterii oraz przemiany azotynu w azotan przez nitrobakterie. Proces przebiega dwuetapowo. Najpierw amoniak jest utleniany do kwasu azotowego (III) według reakcji: 2NH₃ + 3O₂  2HNO₂ + 2H_2O + energia, przez bakterie z rodzaju Nitrosomonas. Następnie kwas azotowy (V) ulega utlenieniu przez bakterie z rodzaju Nitrobacter, w reakcji: 2HNO₂ + O₂ 2HNO₃ + energia, z której powstaje kwas azotowy (V). Amoniak powstający podczas rozkładu materii organicznej jest trudno przyswajalny przez rośliny. Azot staje się przyswajalny dla roślin dopiero po utlenieniu amoniaku do azotanów, głównie jonów azotanowych NO₃^- . W procesach pobierania azotu przez rośliny, w postaci jonów azotowych (NO₃^-) i amonowych (NH₄⁺), najważniejszą rolę pełni powierzchnia chłonna korzeni roślin lądowych lub powierzchnia komórek wodnych organizmów planktonowych. Pobrany w tej postaci azot jest wbudowywany w białko i kwasy nukleinowe roślin. Z kolei roślinożercy przyswajają substancje roślinne w procesie trawienia i pochodzący z nich azot staje się częścią białek i kwasów nuklieinowych zwierząt. Po pewnym czasie azot staje się częścią zbędnych produktów przemiany materii, np. jako mocznik u ssaków i kawas moczowy u ptaków. Usuwane produkty przemiany materii oraz szczątki obumarłych organizmów są substratem dla bakterii amonifikacyjnych, które przetwarzają go w amoniak (NH₃). Proces ten nosi nazwę amonifikacji.

2. Nitryfikacja jest procesem dwuetapowym, w którym uczestniczą dwie grupy mikroorganizmów. Nie wyizolował on organizmów przeprowadzających ten proces. W 1890 roku Percy i ……stwierdził że zmiana NH4+ w NO2- jest przeprowadzana przez pojedyńczą kulturę bakterii (o 1 miesiąć wczesniej niż Winogradzki). Autorzy ci opisali izolowanie czystej kultury bakterii utleniającej NH4+, produkujących NO2-, rosnącej w podłożu niieorganicznym i wyizolował techniką rozcieńczeń.

3. Przemiany form mineralnych azotu: immobilizacja, nitryfikacja, denitryfikacja.

4. Nitryfikacja autotroficzna:

1. Warubnki nitryfikacji: temp.:25-30C, pH 7,5-8,0, wilgotność 60%, stosunek C:N < 12;

2. I faza nitryfikacji-

2NH4+ + 2H+ + 2e + O2 -> NH4OH + 2H2O + H+

Enzym monooksyguanoza amonowa ma szeroka specyficzność i katalizuje utlenianie także propylenu, benzenu, cykloheksanu, fenolu, metanolu, CH4.

Acetylen hamuje nieodwracalnie katalizowana przez ten enmzym reakcję. Utlenianie NH4+ przez gatunki Nitrosomonas, jest znacznie wolniejsze niż przez metanotrofy i wydaje się że nie ma wpływu na wzrost. Podobnie utlenianie NH4+ przez metanotrofy jest także bardzo powolne.

Hydroksyloamina jest utleniana do NO2- w następujący sposób:

NH2OH + H2O –(oksydoreduktaza NH2OH)-> HONO+ 4e + 4H+

2H+ + ½ O2 + 2e-(oksydaza)-> H2O

1. II faza:

HNO2 + H2O –(dehydrogenaza azotanowa (III))-> HNO3 + 2H+

Uwolniona energia 1,4x10^-5J. stosunek ilości utleniacza N do pobranego C: -135

NO NO NO

NH4+ -> NH2OH-> [HNO] NO2-

NO2NHOH

N2O

Produkty pośrednie autotroficznej nitryfikacji ze wskazanymi prawdopodobnymi miejscami uwalniania azotu.

STRATY:

-powstaja lotne tlenki N i N2 ;

- reakcje azotanów(III) z aminokwasami:

R-CH*NH2*COOH + HNO3 -> RCHOHCOOH + H2O+ N2

- reakcje NO2 z NH3;

- reakcje NO2 z NH4+;

- Reakcje rozkładu samych azotanów (III).

Reakcje procesów nitryfikacji przebiegają na membranie, a reakcja utleniania NO2- jest odwracalna może więc zachodzić także redukcja azotanu. Większość uzyskanej energii (do 80%) jest zużywana na redukcję podczas procesów cyklu Calvina. Efektywność wzorostu nitryfikatorów jest bardzo niska. Bakterie utleniające NH4+ asymiliują aminokwasy, mrówczan, octan, lecz pirogronian hamuje wzrost niektórych z tych bakterii, a stymuluje wykorzystanie związków organicznych jako źródła energii. Organizmy utleniajće NO2- są zdolne do wzrostu na octanie, hydrolizami glicerolu, pirogronianie, uzyskuje wtedy większą tempo wzrostu organizmów , z tego powodu mówi się że są one zdolne do wzrostu mikostatycznego.

WYKŁAD X- doczytać wiązanie azotu z Paula i Clarka

1. Stopnie utlenienia azotu:

- R- NH2 (-3); NH3 (-3); N2(o), N2O(1);NO(2); NO2-, NO2(3);NO3- (5).

1. Denitryfikacja jest to mikrobiologiczna redukcja azotanów V do produktów pośrednich oraz do gazowych: NO, NO2, N2, które są zazwyczaj tracone do atmosfery.

2. Warunki denitryfikacji:

- brak tlenu (obecność reduktanta np. C lub S, HS-, NH4+);

- obecność NO3 lub innego tlenku N jako oksydanta, obecno ść organizmów denitryfikujących;

- w przypadku gleby tracenie azotu w wyniku denitryfikacji jest procesem niekorzystnym natomiast w przypadku ścieków korzystnym.

4. Czynniki regulujące przebieg denitryfikacji w glebie:

Klimat-> opad deszczowy, H2O

temp. gleby, O2 ><

rośliny oddychanie

H2O

Substancja organiczna

1. Organotrofy i oligotrofy przeprowadzają denitryfiokację dlatego dobra jest wyst ępująca tu duża ilosć substancji organicznej.

2. Denitryfikacja- pierwotnie termin ten używany był w kontekście bilansu azotowego i oznaczał starty azotu w warunkach beztlenowych. W 1920 roku proces denitryfikacji został bardziej uściślony przez Kluvena. Wg niego denity=ryfikacja jest typem oiddychania beztlenowego, w którym gazowe ijonowe tlenki azotu pełnią rolę końcowego akceptora elektronów. Denitryfikacja oznacza dysymilacyjną regulację azotanów (III) i azotanów (V) do gazowych form NO, N2O lub N2, którym towarzyszy zysk energii. Jest to proces w którym jaony azotanowe nie służa jako substarty do syntezy jak to ma miejsce w przypadku asymilacyjnej redukcji azotanów, w którym jony amonowe są źródłem azotu.

3. Denitryfikacja- redukcja azotanów przez mikroorganizmy w warunkach beztlenowych.

4. Wpływ pH gleby na denutryfikację:

- 6-8- optymalne;

-< 5- silnie ghamowane;

- < 4- niezachodzi.

8. Wpływ temperatury gleby na denitryfikację:

- 5C- temp. minimalna;

- 15-20C- gleby zimne, zależność pomiędzy temp. a potencjałem denitryfikacyjnym jest liniowa zamiast wykładniczej;

- 75C- temp. max.;

->50C- zachodzi rozkład chemiczny NO2-.

1. SCHEMAT DENITRYFIKACJI:

2. SZCZEGÓŁOWA DENTRYFIKACJA:

1. DENITRYFIKACJA CHEMICZNA:

1. NAR- reduktaza azotanowa (V);

2. NIR- reduktaza azotanowa (III);

3. NOR- reduaktaza tlenku azotu ;

4. N2OR(NOS)- reduktaza podtlenku azotu.

5. Denitryfikacja jest wieloetapowym procesem obejmującym:

1. Redukcję azotanów z udziałem zredukowanej formy koenzymu Q (UQH2)- zwanej ubichonolem, katalizowana przez reduktazę azotanową NAR;

2. Redukcja azotanów III za pomocą reduktazy azotanowej NIR: NO2- + 2H+ -> NO+ H2O

3. Redukcja tlenku azotu w błonie cytoplazmatycznej przez reduktaze tlenku azotu: 2NO+ 2H+ -(NOR)-> N2O + H2O;

4. Redukcja podtlenku azotu za pomocą reduktazy NOS: N2O + 2H+ -(N2O)-> N2 + H2O.

1. Schemat transportu elektronów denitryfikacji:……………

2. Denitryfikacja a respiracja azotanowa:

Pełna denitryfikacja

2NO2- + 8H+ + 3e-> N2 + 4H2O

Respiracja azotanowa

NO3- + 2H+ +2e -> NO2- + H2O

NO2- +8H+ + 6e-> NH4+ + 2H2O

Amonifikacja respiracyjna

1. Reduktaza azotanowa NAR- proces denitryfikacji jest katalizowany na początku łańcucha biochemicznego, przemiana azotanów przez reduktazę azotanową V typu A, która jest silnie związana z błona cytoplazmatyczną komórki, zawierającą cytochromy b i c. Aktywnośc tego enzymu jest aktywowana obecnością azotanów i molibdenu. Mechanizm działania enzymu nie jest do końca poznany, ale przyjmuje się że redukuje azotany V do III, oraz że proces ten przbiega w centrum molibdenowym. Działanie inhibitujące mają między innymi tlen, miedź wolfram. Aktywność enzymu nie ulega represji w obecności NH4+. Obok reduktazy azotanowej V związanej z błona komórkową, zidentyfikowano u wileu drobnoustrojów de nitryfikujących także reduktazę azotanową V występujacą w przstrzeni pery plazmatycznej. Składa się ona z 3 różnych podjednostek: alfa- NarG, beta-NarH, i gamma nar-I, które są związane z cytochromem b556, zawierającej dwie grupy hemowe. Zawiera molibdodi……perynoglikolidowe???? (bis MGD) i 5 reszt żelazo- siarkowych. Bakterie z rodzaju Paracoccus mają jeszcze jedną pery plazmatyczną reduktazę azotanów, zwaną reduktazą azotanową P lub Nap.

2. Reduktaza azotanowa (III) NIR- u bakterii gram ujemnych SA enzymami pery plazmatycznymi, katalizują one jednoelektrodową redukcję azotanu III do tlenku azotu, występują miedzy błoną plazmatyczną wewnętrzną a zewnętrzną. Znane są dwa typy dysymilacji reduktazy azotanowej III, oba związane są z peryplzmą i maja złożona budowę. Pierwszy z nich jest trimerem i ma dwa rodzaje centrów aktywnych zawierających miedź. Jedno z centrów aktywnych trimeru jest akceptorem elektronów, zaś drugie katalizuje reakcje redukcji azotanu III. Drugi typ reduktazy azotanowej jest dimerem zawierającym dwa typy ugrupowań hemowych (cytochromów) c i d1. Cytochrom c jest akceptorem elektronów przekazywanych do d1. Cytochrom d1 dimeru katalizuje reakcję redukcji azotanu III do tlenku azotu. Optimum aktywności reduktazy azotanowej III przypada w temperaturze 30C i pH 7,0.

3. Reduktaza tlenku azotu- NOR- jest związana z błona cytoplazmatyczną zawierającą dwa cytochromy c i b, które SA odpowiedzialne za transport elektronów, ale nie uczestnicza w transporcie protonów. Za transport protonów odpowiedzialny jest ostatni enzym łańcucha denitryfikacyjnego- reduktaza podtlenku azotu.

4. Reduktaza podtlenku azotu- NOS lub N2OR- tlenek azotu powstały we wcześniejszych przemianach jest toksyczny dlatego jego stężenie w komórce musi być niższe niż 100nm,( za protony odpowiedzialny jest enzym w przestrzeni pery plazmatycznej czyli reduktaza). Reduktaza ta jest białkiem pery plazmatycznym. Enzym ten jest homodimerem z centrami aktywnymi zawierającymi miedź. Ich funkcja polega na przeniesieniu elektronów z cytochromu c reduktazy tlenku azotu do centrum aktywnego i na podtlenek azotu.

5. Reduktazy przeprowadzające denitryfikację są zasilane elektronami z łańcucha transportu elektronów związanych z błona cytoplazmatyczną. Z błona cytoplazmatyczną związane są reduktaza azotanowa V i reduktaza tlenku azotu. Kluczowy w denitryfikacji enzym: reduktaza azotanowa III oraz reduktaza podtlenku azotu są białkami peryplazmatycznymi.

Wykład XI

1. Obecnie stosuje się ponad 1000 substancji aktywnych.

2. Podział środków ochrony roslin:

I. Zoocydy - środki do zwalczania szkodników zwierzęcych: 
1. Insektycydy - środki owadobójcze,  Są to substancje chemiczne i mikrobiologiczne używane do tępienia szkodliwych owadów. Mogą być one naturalne (np. nikotyna, pyretrum) i - najczęściej – syntetyczne, np. z grupy chlorowanych węglowodorów, fosforanów organicznych, karbaminianów. Insektycydy mikrobiologiczne, tzw. biopreparaty, zawierają drobnoustroje chorobotwórcze dla owadów.. Rodentycydy - środki gryzoniobójcze,  Moluskocydy - środki mięczakobójcze,. Nematocydy - środki nicieniobójcze, Larwicydy - środki larwobójcze, Aficydy - środki mszycobójcze,  Akarycydy - środki roztoczobójcze,  Owicydy - środki do niszczenia jaj owadów i roztoczy, Bakteriocydy – środki zwalczające bakterie. 
II. Fungicydy - środki grzybobójcze. Są to substancje chemiczne stosowane w celu zapobiegania i zwalczania chorób roślin wywołanych przez grzyby pasożytnicze. Stosowane są także do ochrony drewna, skór i innych materiałów. Jako fungicydy stosuje się m.in. organiczne związki siarki, rtęci, chloro pochodne węglowodorów. 
III. Herbicydy - środki chwastobójcze.

1. Podział środków ochrony roślin ze względu na ich budowę:

1. Środki ochrony roslin nieorganiczne:

- insektycydy fluorkowe( kryolit, fluorek sodu);

- insektycydy arsenowe ( zieleń paryska);

- insektycydy nieorganiczne (boraks);

- fungicydy nieorganiczne (zasadowy chlorek miedzi).

1. Środki ochrony roślin organiczne:

- pestycydy chloro organiczne- aldryna, dieldrin, endrin;

- pestycydy fosfoorganiczne – poration;

- karbaminiany- karb aryl;

- pochodne kwasu fenooksyoctowego;

- pochodne tri azynowe (symazyna, atrazyna).

2. Trwałość wybranych pestycydów:

- aldryna 1-6 lat;DDT- 4- 30 lat;y-HCl- 3-10lat; chlor fos 3 miesiące.

2. Główne przemiany środków ochrony roślin w środowisku:

- sorpcja, desorpcja;

- degradacja biologiczna;

- wymywanie;

- hydroliza;

- fotoliza;

- ulatnianie się.

1. Głównymi procesami, które prowadzą do rozkładu są:

- biodegradacja z udziałem mikroorganizmów;

- hydroliza- rozkład z udziałem wody;

- fotoliza- rozkład z udziałem energii słonecznej.

1. PESTYCYD

1. Różne procesy powodują degradacje pestycydów: biodegradacja, degradacja mechaniczna, degradacja hydrolityczna; degradacja termiczna; fitodegradacja.

REAKCJE PRZEMIAN KSENOBIOTYKÓW, PESTYCYDÓW ITP.

1. Utlenianie :

a. B-oksydacja– podczas której, degradacji ulegają kwasy tłuszczowe. Po związaniu się z koenzymem A, są degradowane do kwasów krótszych o dwa atomy węgla i acetylo-CoA.

b. Alfa – oksydacja- w procesie tym rozkladowi ulegaja tylko kwasy mające 13-18 at. C. Pierwszy etap katalizowany przez peroksydaze kwasów tluszczowych polega na dekarboksylacji kwasu tluszczowego do aldehydu krótszego o jeden at. C. Drugi etam, dehydrogenaza związana z NAD powoduje odwodorowanie wodzianu do aldehydu dając w rezultacie kw. tluszczowy o lańcuhu skróconym o 1 at C Znikoma wydajność daje tlyko 3 ATP.

c. ώ- oksydacja- zachodząca głównie w przypadku alkanów rozgałęzionych. Podczas oksydacyjnej degradacji takich związków jak pristan lub fitan, tworzą się kwasy dikarboksylowe, zamiast jedynie monokarboksylowych, jak przy typowej Beta-oksydacji.

1. hydroksylacja- reakcja dołączenia grupy hydroksylowej –OH do substratu, katalizowana przez →hydroksylazy (monooksygenazy).

2. hydroliza-  reakcja podwójnej wymiany (często odwracalna), która przebiega między wodą i rozpuszczoną w niej substancją. W jej wyniku powstają nowe związki chemiczne. Jest szczególnym przypadkiem liolizy (solwolizy). Często przebiega w obecności katalizatorów (kwasów lub zasad). Hydrolizę wykorzystuje się w przemyśle chemicznym (np. hydroliza wielocukrów na cukry proste lub hydroliza chlorobenzenu do fenolu).

3. dekarboksylacja- reakcja chemiczna, w której dochodzi do usunięcia grupy karboksylowej z kwasów karboksylowych lub ich soli i estrów. W wyniku tej reakcji następuje zazwyczaj wydzielenie dwutlenku węgla. W organizmie jest wywoływana najczęściej poprzez działanie enzymów.

4. de alkalizacja-

5. deaminacja-  reakcja chemiczna polegająca na eliminacji z cząsteczki związku chemicznego grupy aminowej (-NH₂), najczęściej z wydzieleniem amoniaku.W wielu przypadkach deaminacji towarzyszą reakcje następcze, prowadzące do zastąpienia grupy aminowej inną grupą organiczną. Bardzo częstą formą deaminacji jest przekształcenie grupy aminowej do ketonowej w cyklicznych związkach organicznych. Przykładem może być deaminacja cytozyny, w wyniku której powstaje uracyl. W środowisku naturalnym, deaminacja aminokwasów jest pierwszym procesem ich degradacji umożliwiającym późniejsze wykorzystanie tych związków chemicznych jako substratu oddechowego. W tym sensie jest to reakcja przeciwna do transaminacji. Deaminacja zachodząca w środowisku naturalnym nie wymaga obecności tlenu. Warunkiem jest odpowiednia ilość azotanów oraz organizmów denitryfikacyjnych.

6. koniugacja- co czyni związek mniej niebezpiecznym (zazwyczaj elektrofilowe związki zanieczyszczające stanowią zagrożenie dla nukleofilowych składników komórki) i bardziej hydrofilnym, następnie III faza służy usunięciu z cytozolu takich inaktywowanych pochodnych;

7. rozkład związków pierścieniowych nitrofenoli- proces mikrobiologicznego rozkładu trudno degradowanych i silnie toksycznych związków, takich jak nitrofenole, bardzo często jest ograniczony przez słaby przyrost biomasy. z tego względu, aby przyspieszyć rozkład ksenobiotyków, postuluje się stosowanie układów kometabolicznych, do których oprócz trudno degradowanego związku, zwanego kometabolitem (substratem niewzrostowym), wprowadza się łatwo przyswajalne źródło węgla i energii, tzw. substrat wzrostowy [roldan i in. 1998].

Przemiany ksenobiotyków

a) I Faza biotransformacji
W pierwszej fazie biotransformacji lipofilne ksenobiotyki ulegając utlenieniu, redukcji lub hydrolizie i przekształcają się w związki bardziej hydrofilowe, zawierające grupy karboksylowe, aminowe lub hydroksylowe. W katalizie tego etapu biotransformacji uczestniczą współdziałające z układem cytochromowym P450 enzymy mikrosomalne hepatocytów zwanemonooksygenazami. Enzymy te w obecności cząsteczkowego tlenu oraz zredukowanego dwunukleotydu nikotynamido-adeninowego (NADPH⁺ + H⁺), spełniającego funkcje koenzymu, modyfikują ksenobiotyki i przygotowują je do dalszych przekształceń realizowanych w II fazie biotransformacji.

Typy reakcji zachodzących w I fazie biotransformacji :
• utlenianie mikrosomalne:
- hydroksylacja związków alifatycznych
- hydroksylacja związków aromatycznych (np. aldehyd benzoesowy do kwasu hialuronowego) 
- dehalogenacja oksydacyjna (np. nalotan do kwasu trifluorooctowego) 
- epoksydacja (np. naftalen do 1,2-dihydroksynaftlenu) 
- N, S, O – dealkilacja (np. diazepam do N-desmetylodiazepamu) - deaminacja (np. amfetamina do fenyloacetonu) 
- N-hydroksylacja (np. anilina do nitrobenzenu) - sulfooksydacja (np. omeprazol do sulfon omeprazolu) 
- desulfuracja
• redukacja mikrosomalna:
- redukacja aromatycznych związków nitrowych (np. chloramfenikol – metabolit aryloaminowy) 
- dehalogenacja redukcyjna (DDT ->DDE) 
• redukacja pozamikrosomalna:
- hydroliza (np. prokainamid do octanu winylu) 
- utlenianie alkoholi (np. alkohol etylowy do aldehydu octowego) 
- utlenianie aldehydów 
b) II Faza biotransformacji
W II fazie biotransformacji, zmodyfikowane podczas reakcji utleniania, redukcji lub hydrolizy ksenobiotyki zostają sprzężone z niektórymi reaktywnymi metabolitami ustrojowymi, stając się przez to lepiej rozpuszczalnymi w wodnym środowisku płynów ustrojowych i w konsekwencji łatwiej wydalanymi z moczem. Reakcje sprzęgania zachodzące w II fazie biotransformacji katalizują głównie enzymy klasy transferaz, a metabolitami, które biorą udział w tych reakcjach są aminokwasy, glutation, oraz aktywowane kwasy tj: octowy, siarkowy i przede wszystkim glukuronowy.

Wykład XII

1. Około 40% awarii i wypadków prowadzi do zanieczyszczenia gleby i gruntów, są to zadarzenia z udziałem węglowodorów ropopochodnych.40% benzyny, paliwa lotne, oleje opałowe, inne pochodne ropy naftowej.

2. Skład ropy naftowej:

- węgiel 87%-83%;

- wodór 11-14%;

- siarka 0,5-6%;

- tlen 0,1- 4%;

- dodatkowo arsen, ołów, Hg i żelazo.

2. WWA obecne w ropie naftowej:

- naftalen, antracen, acenaften, fenantren, acenaften, b(a)p.

1. Węglowodoru aromatyczne stanowią 15% masy ropy naftowej BETX: benzene, etylobenzen, toluene, ksylen.

2. WWA nie są bardzo mobilne w glebie, natomiast są trudno rozpuszczalne w wodzie i odporne na fizyczne, chemiczne i biologiczne metody degradacji.

3. W standardach środowisk wyróżnia się następujące rodzaje zanieczyszczeń węglowodorowych:

- suma benzyn (węglowodory C6- C12)

- olej mineralny (węglowodory C12- C35)

- węglowodory aromatyczne (benzen, etylobenzen, toluen, ksylen, styren, suma węglowodorów aromatycznych)

- WWA (naftalen, fenantren, antracen, flouranten, benzo(a)antracen, bezno(a)piren, benzo(a)flouranten, benzo(g,h,i)perylen, suma WWA, chryzen).

1. Produkty naftowe:

1. Formy degradacji gleby:

• odgórne zanieczyszczenie przez niekontrolowane wylewy ropy i jej pochodnych;

• odgórne zanieczyszczenie przy głównym udziale ropopochodnych i olejowych;

• oddolne zanieczyszczenie w wyniku procesów dyfuzji i podsiąkania ropy ze źródeł podziemnych;

• odgórne zanieczyszczenia wywołane długotrwałym rozpraszaniem substancji ropopochodnych.

1. Substancje te są najczęściej odpowiedzialne za degradację biologiczną właściwości gleby.

- Nie notuje się widocznego negatywnego wpływu na wegetację roślin pomimo stwierdzonej zawartości węglowodorów w warstwie gleby.

- Punktowe zamieranie roślinności darniowej, widoczna jest słaba kondycja roślin uprawianych na takich terenach.

- Punktowe zamieranie roślinności darniowej, ewentualny spadek plonowania roślin uprawnych nawet do 50%.

- Zanikanie lub całkowite zamarcie roślinności darniowej, obszar nie nadaje się pod uprawę.

1. Schemat włączania bioremediacji w usuwanie zanieczyszczeń z ekosystemu:

1. Szlaki mikrobiologicznej degradacji alkanów:

1. Alkany: alifatyczne, izoalkany, cykloalkany;

2. Wiązanie C-H-> metaloenzymy je rozbijają;

3. Możliwe drogi absorpcji alkanów przez bakterie:

- mikrokrople;

- alkany rozpuszczalne w wodzie;

- makrokrople.

- z czego dwa ostatnie nie mają żadnego ważnego dla nas znaczenia

d. mikrokrople- SPC(substancje powierzchniowo czynne), transport bierny i aktywny.

1. Podatność różnych związków na biodegradację:

1. Łatwo rozkładalne: alifatyczne, ropopochodne, węglowodory aromatyczne jednopierścieniowe i heterocykliczne, WWA (do 4 pierścieni), lotne węglowodory chlorowcopochodne;

2. Trudno rozkładalne: WWA, polichlorofenole, dibenzenodioksyny i dibenzofurany polichlorowane, pestycydy i ich pochodne;

3. Metale ciężkie nie ulegają biodegradacji.

1. Lista WWA wg US EPA:

• Naftalen (Nt)

• Acenaften (Ace)

• Acenaftylen (Act)

• Fluoren (FI)

• Fenantren (Fen)

• Antracen (Ant)

• Fluoranten (Fiu)

• Piren (Pir)

• Benzo(a)antracen (BaA)

• Chryzen (Ch)

• Benzo(b)tluoranten (BbF)

• Benzo(k)tluoranten (BkF)

• Benzo(a)piren (BaP)

• Dibenzo(a,h)antracen (DahA)

• Benzo(ghi)perylen (BPer)

• Indeno(1,2,3-cd)piren (IndP)

1. Główne procesy przemian węglowodorów w środowisku:

1. Przemiany w warunkach tlenowych:

1. Oksydacja di terminalna- polegająca na przyłączeniu tlenu na obu końcach alkanu, co prowadzi do otrzymania kwasu dikarboksylowego;

2. Oksydacja terminalna- podczas której, insercja aktywnego tlenu zachodzi w wolnym koñcu alkilowego łańcucha węglowodoru z utworzeniem alkoholu, aldehydu i następnie do kwasu tłuszczowego. Kwasy tłuszczowe są degradowane na drodze beta-oksydacji;

3. Oksydacja subterminalna- w ramach której dochodzi do utlenienia wewnętrznych atomów węgla w łańcuchu węglowodorów alifatycznych. Reakcje takie obserwowano zarówno u bakterii jak i grzybów. Z drugorzędowych alkoholi tworzone są ketony i estry.

1. Monooksydazy alkanowe (charakterystyka na koło):

W zależności od długości łańcucha węglowego alkanu wyróżnia się trzy typy monooksygenaz. Do pierwszego

zalicza się monooksygenazę metanową i enzymy do niej podobne, utleniające alkany C1–C4. Drugi typ stanowią

hydroksylazy zawierające żelazo niehemowe oraz mono-oksygenazy cytochromowe P450; utleniające alkany od

pentanu do heksadekanu. Enzymy zaliczane do trzeciego typu utleniają alkany siedemnastowęglowe, bądź dłuższe. Monooksygenazy metanowe odgrywają kluczową rolę w obiegu węgla w biosferze. Enzymy te występują w dwóch formach. Prawie wszystkie tlenowe organizmy degradujące metan posiadają – związaną z błoną komórkową – monooksygenazę metanową zawierającą miedź pMMO (ang. particulate Methane Monooxygenase).

Najlepiej scharakteryzowanym członkiem tej rodziny jest rozpuszczalna monooksygenaza metanowa wyizolowana z M. capsulatus. W centrum ak-tywnym hydroksylazy zachodzi reakcja między metanem i tlenem, prowadząca do powstania metanolu. Reduktaza związana z FAD (dinukleotyd flawinoadeninowy) jest akceptorem elektronów pochodzących z NADH (zreduko-wany dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy). Elektrony są przekazywane ze zredukowanej flawiny do dwóch atomów żelaza (III) w centrum aktywnym hydroksylazy. Dzięki tej reakcji, enzym ze stanu spoczynkowego formy utlenionej MMO-Hox przechodzi w aktywną formę zredukowaną MMO-Hred, gdzie atomy żelaza znajdują się na II stopniu utlenienia. Następnie, kompleks (utworzony z centrum diżelazowego (II) MMO-H i kom-ponentu MMO-B) reaguje z tlenem cząsteczkowym.

1. PRZEMIANY DDT

1,1,1-Trichloro-2,2- 1,1,1-Trichloro-2,2-

bis(4'-chlorophenyl)ethane bis(4'-chlorophenyl)ethane

(DDT) (DDT)

Microbial Consortium Ralstonia eutropha A5

| |

| from the |

DDT dehydrochlorinase | +--- Anaerobic Pathway | DDT 2,3-dioxygenase

| | |

V V |

1,1-Dichloro-2,2- V

bis(4'-chlorophenyl)- [cis-2,3-Dihydrodiol DDT]

ethylene (DDE) |

| |

Microbial Consortium | Pseudomonas acidovorans M3GY |

+------------+------------+ | cis-2,3-dihydrodiol

DDE de- | V A | DDT dehydrogenase

halogenase | | |

| | |

V V |

1-Chloro-2,2-bis- 1,1-Dichloro-2- V

(4'-chlorophenyl)- (dihydroxy-4'-chlorophenyl)- [2,3-Dihydroxy DDT]

ethylene (DDMU) 2-(4-chlorophenyl)ethylene |

| | |

| | 1,1-dichloro-2-(dihy- |

| | droxy-4'-chlorophenyl)- | 2,3-dihydroxy DDT

| | 2-(4'-chlorophenyl)- | 1,2-dioxygenase

V | ethylene 1,2-dioxygenase |

to the | |

Anaerobic Pathway V V

6-Oxo-2-hydroxy- 6-Oxo-2-hydroxy-

7-(4'-chlorophenyl)- 7-(4'-chlorophenyl)-

3,8,8-trichloroocta- 3,8,8,8-tetrachloroocta-

2Z,4Z,7-trienoate 2Z,4Z-dienoate

| |

| 6-oxo-2-hydroxy-7-(4'- |

| chlorophenyl)-3,8,8- |

| trichloroocta-2Z,4Z,7- |

| trienoate hydrolase |

| |

V V E

2-(4'-Chlorophenyl)-3,3- |

+-------------- dichloropropenoate |

| | |

| | |

V D V B |

| | V

| | +----> 4-Chlorobenzoate

V V | |

4-Chlorophenyl- 4-Chloroacetophenone | |

acetate | | 4-chloro- |

| | | benzaldehyde |

| V C | dehydrogenase |

| | | |

| | | V

V V | to the

to the 4-Chlorobenzaldehyde --+ 2,4-Dichlorobenzoate

L-Tyrosine Pathway Pathway