Katarzyna Żyła

I mgr Genetyka i biologia eksperymentalna

Nr indeksu: 250 622

PROJEKT

Cel projektu: Utworzenie konstruktu (plazmid + gen badany) zawierającego gen

ludzkiego białka w fuzji z genem białka fluorescencyjnego.

Etapy realizacji projektu:

1. Wybór sekwencji genu ludzkiego (gen badany)

2. Wybór plazmidu do klonowania zawierającego gen białka fluorescencyjnego

3. Zaplanowanie odpowiednich starterów do amplifikacji sekwencji kodującej badany gen

4. Zaplanowanie reakcji PCR umożliwiającej amplifikację badanego genu przy pomocy wcześniej utworzonych starterów

5. Zaplanowanie reakcji trawienia restrykcyjnego badanego genu i plazmidu

6. Zaplanowanie reakcji ligacji w celu połączenia sekwencji badanego genu i plazmidu z genem białka fluorescencyjnego

ETAP I – Wybór sekwencji genu ludzkiego

1. Informacje o genie – gen fosforylazy glikogenu mięśniowego (miofosforylazy) PYGM

• Lokalizacja: 11q13.1

• Długość transkryptu: 3198 bp, sekwencji kodującej: 2529bp

• Ilość eksonów: 20

• Długość eksonów: 242, 101, 78, 103, 132, 110, 82,143, 92, 146, 163, 114, 101, 147, 58, 141, 207, 134, 66, 149

• GenBank: AH002957.1 baza NCBI lub CCDS8079 w ensembl

• Ilość intronów: 19

• Długość intronów: 24, 28, 32, 20, 31, 28, 19, 29, 27, 31, 32, 24, 31, 34, 34,35, 21, 26, 27

• Ilość i długość sekwencji UTR (sekwencje 3' i 5' nietranslatowane) – wyróżnione na fioletowo

- sekwencja 1: nukleotydy 1-224 (długość: 224)

- sekwencja 2: nukleotydy 3305 – 3541 (długość:236)

• Położenie intronów w sekwencji kodującej: wyróżnione na zielono

• Sekwencja:

ORIGIN

1 aagtgagctc acctctccct cccctctcct ctcctcccct tgccctcaaa atagctccct

61 gagctgccag gccaagaccc tcccattgca ggggaggcgg cgtgctgccc agagccaggc

121 tttaaatccc cttgaggctg ggagctccac tccttggctg aggcagtgct tgaggccgcc

181 gtcccctcta ccatcagtcc agtccggccc gccctcctgc agccatgtcc cggcccctgt

241 cagaccaaga gaaaagaaag caaatcagtg tgcgtggcct ggccggcgtg gagaacgtga

301 ctgagctgaa aaagaacttc aaccggcacc tgcatttcac actcgtaaag gaccgcaatg

361 tggccacccc acgagactac tactttgctc tggcccatac cgtgcgcgac cacctcgtgg

421 ggcggtggat ccgcacgcag cagcactact atgagaagga ccccaaggtg ctgctgggga

481 ctctctgggc agaggatcta ctacctgtct ttagagttct atatgggacg gacgctacag

541 aacaccatgg tgaacctggc cttagagaat gcctgtgacg aggccaccta ccaggtgtgt

601 gtggggtggg ctcactcctc cagctgggcc tggacatgga ggagctggag gaaattgagg

661 aggatgcggg gctgggcaac gggggcctgg gccggctggc aggtaagaag acagggccgt

721 ccctgcacac cccagcctgc tttcttgact ccatggcaac actgggcctg gctgcctatg

781 gctacgggat tcgctatgag tttgggattt ttaaccagaa gatctccggg ggctggcagg

841 tgagcagcct ttgggtgcag atggaggagg ccgatgactg gcttcgctac ggcaacccct

901 gggagaaggc ccggcccgag ttcacgctac ctgtgcactt ctacggccat gtggagcaca

961 ccagccaggg tgccaagtgg gtggacacac agggtgagga tgaagctggg aaggattgcc

1021 ccgagtggta ctggccatgc cctacgatac cccggtgcct ggctatcgca acaatgttgt

1081 caacaccatg cgcctctggt ctgccaaggc tcccaatgac ttcaacctca aggactgtga

1141 gttcatccac acttttgtcc ctcagtcaat gtcggtggct acatccaggc tgtgttggac

1201 cgaaacctgg cggagaacat ctctcgtgtc ctgtacccca atgataatgt gcgtcatgct

1261 gtccccagtt cttcgaaggg aaggagctgc ggctgaagca ggagtatttc gtggtggctg

1321 ccaccctcca ggacatcatc cgtcgcttca agtcttccaa gttcggctgc cgtgatcccg

1381 tgcgcacgaa cttcgatgcc ttcccagata aggtaccatg cgtgtgcctc cccctacccc

1441 aggtggccat ccagctcaat gacacccacc cctccctggc catccccgag ctgatgagga

1501 tcctggtgga cctggaacgg atggactggg acaaggtggg cttcagccca ccccgtgtgc

1561 caggcgtggg atgtgacagt gaggacctgt gcctacacca accacacggt gctgcccgag

1621 gccctggagc gctggccggt gcacctcttg gagacgctgc tgccgcggca cctccagatc

1681 atctacgaga tcaaccagcg cttcctcaac gtgagtccgg agcttggctc tctcgggcac

1741 agcgggtggc ggccgcattc ccaggggacg tagaccggct gcggcgcatg tcgctggtgg

1801 aggagggcgc agtgaagcgc atcaacatgg cacacctgtg catcgcgggg tcgcacgccg

1861 tcaacggtgt ggcccgcatc cactcggaga tcctcaagaa gaccatgtgt gcccgctttc

1921 cgtccaacct catcctgagc ttcaaagact tctatgagct ggagcctcat aagttccaga

1981 ataagaccaa cggcatcacc cctcggcgct ggctggttct gtgtaacccc gggctggcag

2041 aggtcattgc tgaggtgaga aggggatcca ttcccatagc gcatcgggga ggacttcatc

2101 tctgacctgg accagctgcg caaactgctc tcctttgtgg atgatgaagc tttcattcgg

2161 gatgtggcca aagtgaagca ggtggggaga gatgcaatgt tctctgcctc caggaaaaca

2221 agttgaagtt tgctgcctac ctagagaggg aatacaaagt ccacatcaac cccaactcac

2281 tcttcgacat ccaggtgaag cggattcacg aatataaacg acagctcctc aactgcctcc

2341 atgtcatcac cctgtacaac cgtgatggca gccactctac tctcgtttct ccacaggcat

2401 caagagggag cccaataagt tttttgtgcc tcggactgtg atgattggag ggaaggtgag

2461 aggccaggct cccagacttt gtcccctcag gctgcacctg ggtaccacat ggccaagatg

2521 atcatcagac tcgtcacagc catcggggat gtggtcaacc atgacccggc agtgggtgac

2581 cgcctccgtg tcatcttcct ggagaactac cgagtctcac tggccgagaa aggtgggtgc

2641 tgcaacaggg cccctgctgc acccgaagtg atcccagctg cagacctctc tgagcagatc

2701 tccactgcgg gcactgaagc ctcaggcacc ggcaacatga agttcatgct caacggggct

2761 ctgaccattg gcaccatgga cggggccaat gtggagatgg cagaagaggc gggagaggaa

2821 aacttcttca tctttggcat gcgggtggag gatgtggata agcttgacca aagagggtcc

2881 acagctctgt cctggcaggt acaatgccca ggagtactac gatcgcattc ctgagcttcg

2941 gcaggtcatt gagcagctga gcagtggctt cttctccccc aaacaacccg acctgttcaa

3001 ggacattgtc aatatgctca tgcaccatga ccggtgagct ggttggcctt tcccctccag

3061 gtttaaagtc ttcgcagatt atgaagacta cattaaatgc caggagaaag tcagcgcctg

3121 gtacaaggta ggggtcctct tccctttacc tgcagaaccc aagagagtgg acgcggatgg

3181 tgatccggaa catagccact tctggcaagt tctccagtga ccgcaccatt gcccagtatg

3241 cccgggagat ctggggtgtg gagccttccc gccagcgcct gccagccccg gatgaggcca

3301 tctgagtctc agaccagacc ccaaaccatc ccttgagtct gtcacactct cttgggccag

3361 ccccacacct catgcagagg gtggggtact ggagttagat ctctaccacc ctcctggaac

3421 cctcattaac cccactctca atgtccagtg tccagcgtga ctaaggacac gggccccctt

3481 ccgtgcctgg ctcccggtac ccctcctatt tatggggtct gaccaactgc accactccct

3541. aataaattca tctccattgg gaaa

ETAP 2 - Wybór plazmidu do klonowania zawierającego gen białka fluorescencyjnego

*dokładna specyfikacja w załączeniu

ETAP 3 - Zaplanowanie odpowiednich starterów do amplifikacji sekwencji kodującej badany gen

Starter forward: AAA CTC GAG ATG TCC CGG CCC CTG TCA

• Tm: 4 x (12) + 2 x (6) = 48 + 12 = 60°C

• Tm wg Oligoanalyzer: 62°C

Starter reverse: AAA GAA TTC GAT GGC CTC ATC CGG GGC

• Tm: 4 x (13) + 2 x (5) = 52 + 10 = 62°C

• Tm wg Oligoanalyzer: 61,5°C

*na niebiesko 3 dodatkowe nukleotydy, na zielono sekwencje dla enzymów restrykcyjnych

ETAP 4 – Zaplanowanie reakcji PCR umożliwiającej amplifikację badanego genu przy pomocy wcześniej utworzonych starterów

Skład reakcji – całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej: 50 µl

Składnik	Końcowe stężenie w próbie	Ilość
matryca DNA	100 ng	1 µl
starter forward	0,4µM	2 µl
starter reverse	0,4µM	2 µl
mieszanina dNTP	0,2mM każdego	5µl
MgCl2	1,5 mM	3µl
polimeraza Taq	1,25 U	1,25 µl
bufor 10x Taq		5µl
woda wolna od nukleaz		do 50 µl

Warunki reakcji:

Wstępna denaturacja: 95°C przez 5 minut

Denaturacja: 95°C przez 30 sekund

Hybrydyzacja: 57°C przez 40 sekund

Elongacja: 72°C przez 40 sekund

Końcowa elongacja: 72°C 5 minut

Schładzanie: 4°C

Denaturacja, Hybrydyzacja i elongacja w 35 cyklach

ETAP 5 – Zaplanowanie reakcji trawienia restrykcyjnego badanego genu i plazmidu

Restryktazy, które nie tną genu PTGM

Wybrane enzymy restrykcyjne:

- forward: XhoI

- reverse: EcoRI

Bufor, w którym oba enzymy działają ze 100% aktywnością to 2XTango

*enzym SalI wytnie większy fragment MCS, jednak enzymy te nie będą miały wtedy 100% aktywności w jednym buforze.

	XhoI	EcoRI
	długość	długość/ cięcie
λDNA (1µg)	48 502	48 502
wstawka (1µg)	2 529	2 529

* enzym XhoI tnie λDNA w 1 miejscu, natomiast EcoRI w 5 miejscach (tabela w załączeniu)

	XhoI	EcoRI
	długość	długość/ cięcie
λDNA (1µg)	48 502	48 502
plazmid (1µg)	4 700	4 700

*stężenia obu enzymów u producenta LifeTechnology = 10U/µl

Reakcja na 20µl dla wstawki:

- bufor 2X Tango: 4 µl

- enzymu XhoI: 19,18 U, czyli 1,918 µl

- enzymu EcoRI: 3,83 U, czyli 0,383 µl

- wstawka: 1 000 ng = 1 µg, czyli 1 µl

- uzupełnienie MiliQ do 20 µl (ok. 12,699 µl)

Inkubacja w 37°C całą noc

Reakcja na 20µl dla plazmidu:

- buforu 2XTango: 4 µl

- enzymu XhoI: 25,8 U, czyli 2,58 µl

- enzymu EcoRI: 5,15 U, czyli 0,515 µl

- plazmid: 1 000 ng = 1 µg, czyli 1 µl

- woda MiliQ do 20 µl (ok. 11,905 µl)

Inkubacja w 37°C całą noc

ETAP 6 – Zaplanowanie reakcji ligacji w celu połączenia sekwencji badanego genu i plazmidu z genem białka fluorescencyjnego

• XhoI zostawia lepkie końce

• EcoRI zostawia lepkie końce

• Zastosowana ligaza DNA T4 (5 Weiss U/ µl ) z uwagi na to, że jest dostępna i popularna oraz łączy lepkie końce

• Stosunek 3:1

Reakcja ligacji:

Składnik	Ilość na 20 µl reakcji
10X bufor dla ligazy T4 DNA	2 µl
wektor DNA (4,7 kb)	50 ng*
wstawka DNA (2,259kb)	80,71 ng*
ligaza T4 DNA	1 U, czyli 0,2 µl
woda wolna od nukleaz	uzupełnienie do 20 µl

* wyliczone z http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation oraz

(50 x 2,529)/4,7 x 3:1 = 80,71 ng wstawki (na 50 ng plazmidu)

Ilość moli końców wstawki:

- mole DNA: 51,64 pmol

- mole końców DNA: 103,3 pmol

Inkubacja 16 °C na całą noc (pomimo, ze napisali w protokole inaczej) – najbardziej efektywnie