PŁYNY INFUZYJNE c.d.

Płyny wyrównawcze stosowane w zaburzeniach równowagi kwasowo-zasadowej

Kwasica metaboliczna

Dochodzi do znacznego obniżenia pH poniżej 7,35 i zmniejszenia stężenia HCO₃^- poniżej 24 mmol/l. Często również występuje niedobór K⁺. Celem leczenia jest wyrównanie stężenia HCO₃^- aby zbliżyć pH do wartości fizjologicznej.

W ciężkich stanach zagrażających życiu (pH poniżej 7,1, HCO₃^- poniżej 10 mmol/l) stosuje się hiperosmotyczny roztwór NaHCO₃ (8,4%).

W lżejszych stanach stosowane są r-ry NaHCO₃ o stężeniach 1,4-5%, a także zależne od rodzaju kwasicy (Izo-, hipertonicznej) r-ry mleczanu sodu (1,68-11,2%), octanu sodu (2-13,6%), cytrynianu sodu (2,2-9,8%). Przy niedoborze K⁺ preparaty zawierające potas.

Zasadowica metaboliczna

Występuje zwiększone stężenie HCO₃^- w osoczu i podwyższone pH powyżej 7,45, niekiedy również znaczne zmniejszenie stężenia Cl-. Celem leczenia jest normalizacja tych wartości.

W stanach ciężkich stosuje się r-ry NH₄Cl (0,83%) w 5% r-rze glukozy.

W innych przypadkach r-ry NaCl (0,9% - uzupełnia niedobór Cl^-) lub KCl o odpowiednich stężeniach. Stosuje się również chlorowodorek L-argininy lub chlorowodorek L-lizyny (18,27%). Oba te r-ry są polecane przy zasadowicy przebiegającej BEZ niedoboru Na⁺ i K⁺. Przy zaburzeniach wątroby gdy jest zmniejszone stężenie Cl- można podawać kwas solny 0,05 lub 0,1 a nawet 0,2 mol/l z dodatkiem glukozy lub NaCl jako subst. Izotonizującej.

Płyny stosowane w niedoborze K+

Fizjologiczne stężenie K+ w surowicy wynosi 5mmol/l.

Hipokaliemia (Stężenie K+ w osoczu poniżej 3,8 mmol/l)

Jest wynikiem:

• niedostatecznej podaży potasu z pokarmem,

• utraty potasu przez przewód pokarmowy (np.wymioty, biegunki) lub nerki (np.w wyniku stosowania leków diuretycznych),

• trans mineralizacji (przemieszczanie się potasu z płynu pozakomórkowego do wnętrza kom.np.po przedawkowaniu insuliny)

W wyniku niedoboru potasu dochodzi do upośledzenia czynności OUN, porażenia m.szkieletowych oraz zaburzeń rytmu serca. W celu uzupełnienia tego niedoboru korzysta się najczęściej z koncentratów zawierających KCl dodając do do 5% r-ru glukozy (podajemy we wlewie kroplowym nie więcej niż 40mmol/l w ciągu godziny)

Roztwory zawierające potas podajemy POWOLI!!!

Stosuje się również roztwór I i II Elkintona. Często wystarczające jest podanie po prostu płynu wieloelektrolitowego np.roztwór Butlera. Pokrywają zapotrzebowanie zarówno na wodę jak i potas.

Płyny do dializ

Celem dializy jest usunięcie z krwi chorego toksycznych, endogennych produktów przemiany materii pochodzących z zaburzeń wodno-ellektrolitowych i równowagi kwasowo-zasadowej, które nie mogą być wydalone przez organizm na skutek trwałego lub odwracalnego uszkodzenia nerek.

Podział dializoterapii:

• Wewnątrzustrojowa (otrzewnowa)

• Zewnątrzustrojowa (hemodializa)

Dializa otrzewnowa

Polega na wielokrotnym, cyklicznym wprowadzaniu odpowiedniej objętości płynu dializacyjnego do jamy otrzewnowej, który jest następnie co 30-60min wymieniany na nowy. W tym czasie (na pow.200cm3) dochodzi do wyrównania stężeń bo obu stronach błony dializacyjnej. Usuwanie substancji toksycznych odbywa się głównie metodą transportu dyfuzyjnego i zależy od gradientu stężeń.

Wskazaniem do dializy otrzewnowej jest:

• - niewydolność nerek oraz zatrucie egzogenne

• -obrzęk płuc z przewodnienia

• -zaburzenia rytmu serca spowodowane hiperkaliemią ( K+ powyżej 6mmol/l)

• -kwasica metaboliczna

• -zwiększenie stężenia mocznika we krwi powyżej 33,3 mmol/l

Rodzaj i objętość płynu zależą od stanu chorego i od stosowanej techniki dializacyjnej (przerywana, ciągła ambulatoryjna, ciągła cykliczna, dzienna, nocna). Przeciętnie dla jednego chorego w ciągu tygodnia potrzeba 56-150 l płynu. Wszystkie sosowane obecnie płyny do dializacji zawierają jako czynnik osmotyczny, glukozę w stężeniu 1,5%, 3,5% i 4,25% - glukozą warunkuje się ciśnienie osmotyczne płynów. Płyny te nie zawierają K+, ponieważ ich stężenie w osoczu osoby dializowanej zazwyczaj jest podwyższone.

Płyny do dializacji muszą być jałowe i apirogenne.

Do dializy chorych ze znaczną retencją Na zalecane są płyny o największej zawartości glukozy., zawierających zmniejszone stężenie jonów sodu (125mmol/l)

Dializa zewnątrzustrojowa

Jest to skuteczna metoda lecenia ciężkiej niewydolności nerek oraz niektórych zatruc. Wymaga skomplikowanej aparatury i dużych objętości płynów (ok. 450l na jeden zabieg). Aparat do hemodializy = sztuczna nerka:

- dializator zawiera błonę półprzepuszczalną, która może być zbudowana z

• Celulozy

• Regenerowanej lub modyfikowanej celulozy

• Octanu celulozy

• Polisulfonowe

• Poliakrylonitrylowe

• Polimetylometakrylowe

• Poliamidowe

• Poliwęglanowe

Błony te wykazują przepuszczalność podobna do naczyń włosowatych kłębuszka nerkowego. Nie przepuszczają: albumin i innych białek, związków organicznych o dużych m.cz., bakterii, kom.krwi. Swobodnie dyfundują: woda, elektrolity, cukry, mocznik i inne małocząsteczkowe produkty rozkładu białek.

- układ przewodów doprowadzających i odprowadzającyych

- system uzdatniania wody

- urządzenie do przygotowywania i transportu płynu dializacyjnego – pobieranie koncentratu i mieszanie go z odpowiednią ilością wody.

- elektroniczny system monitorowania – utrzymanie stałego ciśnienia krwi, stabilizacja temperatury i składu płynu dializacyjnego

Podczas hemodializy krew jest wprowadzana do dializatora, w którym przepływa między wrkuszami, zwojami lub w kapilarach i jest obmywana w przeciwprądzie przez płyn dializacyjny. Oczyszczona krew wraca do żyły chorego. Czas trwania zabiegu trwa 4-5h.

Stosuje się roztwory elektrolitowe o składzie zbliżonym do osocza krwi. Uzyskuje się je z koncentratów, które są rozcieńczane zwykle 30-40 krotnie wodą destylowaną, demineralizowaną lub otrzymaną na drodze odwróconej osmozy.

Sporządza się 3 koncentraty:

• Koncentrat 1 – z octanem lub mleczanem sodu

• Koncentrat kwaśny 2 – bezpośrednio przed użyciem dodaje się wodorowęglan sodu w ilości nie większej niż 45mmol/l

• Koncentrat 3 – nie zawiera buforu,

Rozcieńczone roztwory koncentratów nie powinny być przechowywane, powinny być natychmiast zużyte.

Hemofiltracja

Ultrafiltracja krwi przez odpowiednie błony np.poliamidowe, bez udziału płynu dializującego. Oparta jest na różnicy ciśnień, jakie panuje po obu stronach błony, i szybkości przepływu krwi.

Hemoperfuzja

Proces eliminacji substancji toksycznych zawartych we krwi przez odpowiednie sorbenty lub układy biologicznie czynne, umieszczone bezpośrednio w strumieniu krwi przepływającej w systemie krążenia pozaustrojowego. Najczęściej używane są kolumny węglowe, rzadziej żywiczne. Wykorzystuje się tutaj zjawisko sorpcji fizycznej lub chemicznej.

SPORZĄDZANIE ROZTWORÓW INFUZYJNYCH Z ZASTOSOWANIEM KONCENTRATÓW

Koncentraty elektrolitowe – roztwory które w 1ml zawierają 1mEq odpowiedniego kationu i 1mEq odpowiedniego anionu. Są stosowane przede wszystkim jako płyny pomocnicze, dodawane w odpowiednich objętościach do gotowych płynów infuzyjnych, w zależności od potrzeb. Sporządza się je w ampułkach 10 i 20ml lub w butelkach po 50 i 100ml. Nie mogą być wstrzykiwane bezpośrednio, bez uprzedniego rozcięczenia w płynie infuzyjnym.

Nietypowym koncentratem jest roztwór Elkintona – jest dwuskładnikowy i zawiera w 1 ml więcej niż 1mEq każdego jonu (NaCl, KCl, woda do wstrzykiwań). Stosowany jest do sporządzania płynów infuzyjnych ze wskazaniem w leczeniu gł.niedoborów jonów K+. sporządzany jest w ampułkach 20ml. Zawartośc ampułki przed użyciem rozcieńcza się w 500ml wody do wstrzykiwań bądź w 5% roztworze glukozy.

Koncentrat	Stężenie [%]	Stężenie [mEq/ml] kationu i anionu
Chlorek amonu Chlorek wapnia Octan potasu Chlorek potasu Cytrynian potasu Wodorowęglan potasu Chlorek magnezu Siarczan magnezu Octan sodu Wodorowęglan sodu Chlorek sodu	5,35 10,95 9,81 7,46 10,81 10,01 10,17 12,32 13,61 8,4 5,85	1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

NIEKTÓRE PROBLEMY TECHNOLOGICZNE W PREPARATYCE LEKÓW POZAJELITOWYCH

- wyjaławianie za pomocą nasyconej pary wodnej – reakcje hydrolizy, utlenienia, redukcji, racemizacji

- wrażliwość substancji na wysoką temperaturę – sączenie wyjaławiające

- trwałośc leków podczas przechowywania – zmiana barwy, zmętnienie, osad

Roztwory glukozy do wstrzykiwań i do wlewów dożylnych

Sporządzane są przez przemysł farmaceutyczny i przez apteki szpitalne. Przechowywane w pojemnikach 100, 250, 500ml i stężeniu 5, 10, 20, 30% rzadziej 40 i 50%. Roztwory glukozy sporządzane są również w ampułkach 10 i 20ml w stężeniu 10, 20, 40 i 60%. Ulega rozkładowi pod wpływem temperatury. Gł. Produktem rozkładu glukozy w środowisku kwaśnym bądź obojętnym jest 5-hydroksymetylofuurfural, rozkładający się dalej do kw. mrówkowego i lewulinowego lub polimeryzując do barwnych połączeń. Pod wpływem tworzących się kwasów dochodzi do obniżenia pH r-ru glukozy do 3,6-6,5.

Badania na obecność 5-HMF: odmierzamy obj.r-ru odpowiadającego 2,5g glukozy, uzupełniamy wodą do 100ml i badamy spektrofotometrycznie (max 284nm). Absorbancja nie powinna być wyższa niż 0,8.

Roztwory wodorowęglanu do wstrzykiwań

W leczeniu stosuje się r-ry o stężeniach 1,4-8,4%. Pod wpływem temperatury ulega rozkładowi . powinien być o najwyższej czystości, gdyż nawet śladowe ilości zanieczyszczeń ( jony wapnia czy magnezu) powodują wytrącanie trudno rozpuszczalnych węglanów – dodajemy wersenian di sodu, który chelatuje jony magnezu i wapnia.

Nie należy używac gorącej wody do rozpuszczania, rozpuszczamy w wodzie o temp.40⁰C i ostrożnie mieszamy.

Roztwór mannitolu do wlewu dożylnegoStosowany w stężeniach 10, 15, 20, 25%. Roztwór izoosmotyczny z surowicą krwi ma st.5,46%.. do sporządzania roztworów mannitolu używa się gorącej wody. Roztwory 20 i 25% są roztworami przesyconymi – w czasie przechowywania (w temp.nieznacznie powyżej 20^oC) może wytracać się krystaliczny mannitol. W takim przypadku r-ów należy ogrzać (np.na łaźni wodnej) do temp. 50^oC aż do całkowitego rozpuszczenia kryształów, a następnie ochłodzić do tem.ciała.

WYMAGANIA DOTYCZĄCE SPORZĄDZANIA LEKÓW POZAJELITOWYCH

Postępowanie aseptyczne – całokształt zabiegów, których celem jest niedopuszczenie do skażenia drobnoustrojami sporządzonych leków. Można to osiągnąć używając jałowych substancji, urządzeń, pojemników, specjalnego typu odzieży ochronnej i wykonując wszystkie czynności w pomieszczeniach z laminarnym nawiewem jałowego powietrza.

Antyseptyka – ma na celu zniszczenie drobnoustrojów chorobotwórczych na skórze, błonach śluzowych i uszkodzonych tkankach za pomocą środków chemicznych (nie mogą być toksyczne, szerokie spektrum działania, ich akt.nie powinna się zmniejszać po kontakcie z krwią czy płynami tk.). do odkażania rąk służy najczęściej 70% alk.etylowy, 60-70%alk.propylowy, 0,5-1,0% r-ór chloroheksydyny, 0,5-2,0% roztwór chlorku lub bromku benzalkoniowego.

Dezynfekcja – zabiegi chemiczne i fizyczne, mające na celu zniszczenie drobnoustrojów na powierzchni różnego typu przedmiotów, a także na powierzchni ścian, podłóg, stołów w pomieszczeniach przeznaczonych do produkcji leków.

GMP zasady dobrej praktyki wytwarzania – są to wytyczne określające zasady postępowania podczas wytwarzania i kontroli leków.

Grupa leków	Wymagania
I Leki stosowane pozajelitowo Leki do oczu Leki stosowane na rany i rozległe oparzenia	Jałowość
IIa Leki stosowane zewnętrznie Leki stosowane na skórę i bł.śluzowe Leki do nosa, ucha, gardła Leki inhalacyjne	Nie więcej niż 10^2 bakterii i grzybów w 1g/1ml Nieobecność: s.aureus, p.aeruginosa
IIb Leki stosowane zewnętrznie zawierające surowce poch.naturalnego	Nie więcej niż 5*10^2 bakterii i 10^2 grzybów Nieobecność: s.aureus, p.aeruginosa, clostridium
IIIa Leki stosowane doustnie Leki doodbytnicze	Nie więcej niż 10^3 bakterii, 10^2 grzybów, 10^2 enterobacteriaceae Nieobecnośc: s.aureus
IIIb Systemy przez skórne Leki dopochwowe	Nie więcej niż 10^3 bakterii, 10^2 grzybów, 10^2 enterobacteriaceae Nieobecnośc: s.aureus, e.coli, p.aeruginosa
IIIc leki doustne zawierające surowce pochodzenia naturalnego	Nie więcej niż 10^4 bakterii, 10^2 grzybów, 10^2 enterobacteriaceae Nieobecność: jak wyżej Nieobecność salmonella w 10g lub 10ml
IIId Surowce roślinne poddawane dz.wrzącej wody	Nie więcej niż10^7 balterii, 10^5 grzybów, 10^2 e.coli (w 1g lub 1ml)
IIIe Surowce roślinne nie poddawane dz.wrzącej wody	Nie więcej niż 10^5 bakterii, 10^4 grzybów, 10^3 enterobacteriaceae (w 1g lub 1ml), Nieobecność: e.coli (w 1g lub 1ml), salmonella ( w 10g lub 10ml)

Klasyfikacja jakości powietrza przestrzeni pracy

Klasa czystości	Max.dopuszczalna liczba cząstek w 1cm^3 o wielkości równej lub większej niż	Max.dopuszczalna liczba żywych drobnoustrojów w 1cm^3
	0,5µm	5µm
100 10 000 100 000	A B C D	3 500 3 500 350 000 350 000

Pomieszczenie przeznaczone do produkcji leków powinno być zaopatrzone w:

• Wejścia ze śluzami powietrznymi

• Filtry umożliwiające laminarny napływ jałowego powietrza

Ściany, podłogi i sufit muszą być gładkie, łatwe do czyszczenia i dezynfekcji.

Pomieszczenie do sporządzania leków, których nie wyjaławia się w opakowaniach bezpośrednich, musi zapewniać prowadzenie procesu wytwarzania w strefie powietrza klasy czystości A, przy powietrzu klasy czystości B wypełniającym całe pomieszczenie. W przypadku, gdy przewidziane jest wyjaławianie leku, może być on wykonywany przy powietrzu klasy czystości C.

Urządzenia i sprzęt powinny być starannie oczyszczone, a jeżeli to niezbędne również wyjałowione. SL i substancje pomocnicze powinny być wole od substancji gorączkotwórczych i w miarę możliwości jałowe (pro injectione).

Schemat produkcji leków pozajelitowych w postaci roztworów

NIEKTÓRE PROBLEMY ZWIĄZANE Z ŁACZENIEM PŁYNÓW DO PODAWANIA POZAJELITOWEGO

Interakcje w fazie farmaceutycznej – powstanie różnego rodzaju niezgodności fizycznych czy chemicznych, mogą one wystąpić natychmiast po połączeniu leków przeznaczonych do wspólnego wstrzykiwania lub wlewu kroplowego i są sygnalizowane poprzez wizualne zmiany (zabarwienia, konsystencji, zmętnienia, osadu itp.) lub też występują z opóźnieniem i są dostrzegane dopiero w czasie przechowywania lub w czasie trwania kilkugodzinnego podawania.

Ukryte niezgodności – często związane z rozkładem SL, nie ujawniają się wizualnie, mimo że powodują osłabienie działania leczniczego.

Przyczyny niezgodności:

-zmiana odczynu w wyniku połączenia płynów o różnych wartościach pH co może działać katalizująco na reakcje hydrolizy czy utlenienia SL (zmniejszenie akt.farmakologicznej leku)

-wysolenie SL przez elektrolity znajdujące się w roztworze

-tworzenie kompleksów

-rozcieńczenie zawartości SP po dodaniu leku do płynu infuzyjnego – niewystarczająca ilość p/utleniacza-rozkład SL

-wytrącanie osadów – łączenie roztworów soli słabych kwasów ze słabymi zasadami

SUBSTANCJE GORĄCZKOTWÓRCZE

Substancje pirogenne pochodzenia bakteryjnego są endogennymi toksynami bakteryjnymi Gramm (-). Są to związki wielkocząsteczkowe umiejscowione w zewnętrznych warstwach ściany komórkowej. W skład kompleksu endotoksyny wchodzi białko, lipid i wielocukier. Zasadniczą częścią endotoksycznego kompleksu jest lipopolisacharyd – wykazuje aktywnośc endotoksyczną łącznie z pirogennością.

Lipopolisacharydy są również składnikami ściany kom.bakterii. Lipopolosacharyd składa się z 3 regionów:

1. Lipidu A – charakterystycznymi składnikami są długie łańcuchy kw.tłuszczowych ( D-3-hydroksymirystynowego, laurylowego, palmitynowego)

2. Rdzenia – człon wiążący między łańcuchem O-swoistym a lipidem A

3. Łańcucha O-swoistego – łańcuch hetero polisacharydowy, zawierający powtarzające się jednostki oligosacharydowi, skład zależny od gatunku. Do najczęściej występujących cukrów zalicza się: mannozę, ramnozę, galaktozę, glukozę. Odpowiedzialne są za swoistośc serologiczną

Pirogeny charakteryzują się ciepło trwałością!

Pirogeny są dobrze rozpuszczalne w wodzie ( ich głównym źródłem jest woda dlatego w technologii leków pozajelitowych stosowana jest woda wolna od pirogenów), nierozpuszczalne w alkoholu i acetonie.

Są wrażliwe na działanie takich substancji utleniających jak:

• Nadmanganian potasu

• Nadtlenek wodoru

• Podchloryn sodu

Można je zniszczyc działaniem mocnych kwasów lub zasad.

Wprowadzenie ich do organizmu dożylnie powoduje:

• Wzrost temperatury ciała – często towarzyszą zmiany w obrębie krwinek białych, początkowo obserwuje się leukopenię,a następnie leukocytozę

• Dreszcze

• Bóle głowy

• Duszności

• Zaburzenia oddychania połączone z niepokojem

Pirogen egzogenny (lipo polisacharyd) uwalnianie z krwinek białych polipeptydu (pirogen endogenny)

Oddziaływanie na podwzgórze wzrost temp.ciała

Pirogen endogenny może być także uwalniany z :

-monocytów

-makrofagów płuc, śledziony, węzłów chłonnych

Pirogen endogenny jest uwalniany pod wpływem:

-bakterii gram(-)

-wirusów

-grzybów

-pierwotniaków

-nadwrażliwośc, uszkodzenie i rozpad tkanek

-stany zapalne

KONTROLA LEKÓW POZAJELITOWYCH

1. BADANIE JAŁOWOŚCI

Ma na celu stwierdzenie, z możliwie dużym prawdopodobieństwem, czy badany lek jest wolny od żywych drobnoustrojów. Przy badaniu jałowości powinny być spełnione następujące warunki:

• Używanie jałowych materiałów

• Badania wykonywać w specjalnych pomieszczeniach, w warunkach zapewniających jałowość

• Zapewnić optymalne warunki rozwoju dla szerokiego zakresu drobnoustrojów tlenowych i beztlenowych (odpowiednie podłoża, temperatura, czas obserwacji)

• Inaktywacja lub usunięcie wszystkich czynników bakteriostatycznych lub grzybostatycznych obecnych w badanych lekach

Podłoża - stosuje się kilka pożywek, ich skład jest zróżnicowany, ale zwykle są to podłoża do wzrostu bakterii tlenowych, beztlenowych, grzybów. FP VI przewiduje dwa podłoża :

• tioglikolanowe – dla bakterii beztlenowych, przechowuje się je w temp.pokojowej bez dostępu światła, ma barwę słomkową. Podczas przechowywania może dojść do znacznego natlenowania (zmiana barwy na różową)-nie może być użyte do badań, poddaje się je regeneracji (proces regeneracji może być przeprowadzany tylko raz)-ogrzewanie na łaźni wodnej

• z hydrolizatem kazeiny i soi – dla bakterii tlenowych, mogą rosnąc również grzyby.

Można użyć również inne podłoże pod warunkiem że zapewni wzrost jak największej liczby drobnoustrojów. Podłoża wyjaławia się przez 15min w temp.121^oC.

Ocena jakości podłoży – zbadanie pod kątem jałowości i przydatności do wzrostu drobnoustrojów każdej serii podłoży.

• Zbadanie jałowości – podłoża inkubujemy: 7 dni – tioglikolanowe w temp.30-35^oC, z hydrolizatem kazeiny i soi w temp.22-25^oC . jeżeli po tym czasie nie stwierdza się wzrostu drobnoustrojów, podłoża uważa się za jałowe

• Możliwości wzrostowe – równoległe posiewy odpowiednich drobnoustrojów testowych i inkubacja w warunkach przewidzianych dla jałowości nie dłużej niż 7 dni. Podłoże uważa się za odpowiednie, jeżeli w próbkach pojawia się intensywny wzrost drobnoustrojów.

  • Na podłoża tioglikolanowe posiewa się: Staphylococcus ureus, Clostridium sporogenes

  • Na podłoża z hydrolizatem kazeiny i soi posiewa się: S.aureus, Bacillus subtilitis, Candida albicans, Aspergillus Niger

Liczba prób pobieranych do badań

Liczba pojemników w serii	Minimalna liczba badanych pojemników
Nie więcej niż 100 100-500 Więcej niż 500	10% liczebności serii lub 4 pojemniki 10 pojemników 20 pojemników

Wybór metody badania – zależy od tego czy badane preparaty wykazują właściwości hamowania wzrostu drobnoustrojów. Jeżeli brak danych na ten temat wykonujemy próby testowe.

1. metodę bezpośredniego posiewu wykonuje się dla preparatów, które nie wykazują działania hamującego wzrost drobnoustrojów, jak również gdy możliwa jest inaktywacja czynników hamujących np. przez dodanie odpowiednich subst.inaktywujących lub przez rozcieńczenie próby.

2. metodę z użyciem sączków membranowych należy stosować zawsze, gdy bada się preparat hamujący wzrost drobnoustrojów oraz jeżeli pozwalają na to właściwości i postać leku ( preparaty płynne, rozpuszczalne w wodzie i innych rozpuszczalnikach). Metodę te należy stosować zawsze do badania leków pozajelitowych w pojemnikach powyżej 100ml badając całą zawartość. W razie potrzeby badaną próbkę rozcieńczyć do 100ml jałowych roztworem buforowych z peptonem o pH 7 lub solą fizjologiczną. Jest dokładniejsza.

Próby testowe – w celu ustalenia czy badany lek nie wykazuje zdolności hamowania wzrostu drobnoustrojów, należy dodać do podłoża odpowiednią ilość badanego preparatu i szczepy testowe. Równocześnie przygotować próbę kontrolną ze szczepami testowymi ale bez dodatku preparatu. Jeżeli po 48h inkubacji obserwuje się taki sam wzrost

W próbie badanej i kontrolnej to preparat można wyjaławiać w sposób bezpośredni.

Wykonanie badania metodą bezpośredniego posiewu – odpowiednio pobrane próbki należy wprowadzić od podłoża trioglikolanowego i podłoża z hydrolizatem kazeiny i soi oraz inkubować.

• W przypadku preparatu płynnego próbkę pobieramy za pomocą jałowej pipety lub strzykawki, po uprzednim odkażeniu pojemnika przed otwarciem lub nakłuciem

• W przypadku postaci stałej próbkę pobieramy odpowiednią ilość preparatu, rozpuszczamy lub zawieszamy w 10ml jałowego rozpuszczalniku i posiewamy na pożywkę

Objętość (ilość) leku w pojemniku	Objętość posiewana na jedno podłoże
Roztwory Do 2ml 2,1-20ml 21-100ml Substancje suche Do 50mg 51-200mg 200mg lub więcej	Cała zawartość pojemnika 2ml 10% zawartości pojemnika Cała zawartość pojemnika ½ zawartości pojemnika 100mg

Wielkośc próby w stosunku do objętości podłoża powinna wynosic:

• 1:10 dla preparatów płynnych

• 1:100 dla preparatów stałych

Po okresie inkubacji należy odczytać wyniki badań ( z wykorzystaniem lupy). W przypadku badania preparatów powodujących zmętnienie podłoża – wykonujemy ocenę mikroskopową i wykonujemy posiew na świeże podłoże.

Wykonanie badania metodą sączków membranowych – używa się sączków o wielkości porów nie większych niż 0,45µm, o średnicy dostosowanej do konstrukcji używanego aparatu do sączenia, zwykle 50mm. Przed sączeniem sączek zwilżyć jałowym rozcieńczalnikiem np .roztworem buforowym z peptonem o pH 7,0 lub solą fizjologiczną. Cała aparatura musi być jałowa. Objętość sączonego r-ru nie może być mniejsza niż 100ml, a całkowita objętość sączona przez jeden sączek nie może być większa niż 1000ml. Natychmiast po zaprzestaniu sączenia sączki należy przenieść, z zachowaniem aseptyki, do odpowiednich podłoży i inkubować.

Preparaty o małej lepkości należy sączyć bezpośrednio przez saczek, nie używając rozcieńczalnika.

Po przesączeniu badanego preparatu sączek należy przemyć 3-krotnie, po 100ml, odpowiednik jałowym r-rem, np.r-rem buforowym z peptonem o pH 7,0 lub izotonicznym roztworem NaCl z dodatkiem III^o(p-oktylofenoksy)-polioksyetanolu lub 1% polisorbatu 80 albo innego czynnika emulgującego.

Ocena wyników

• jeżeli po inkubacji nie stwierdza się wzrostu drobnoustrojów, preparaty ocenia się jako jałowe

• W przypadku obserwowanego wzrostu powinno się dokonać izolacji i identyfikacji drobnoustrojów. Następnie należy wykonać powtórnie badanie z taką samą ilością preparatu, co w badaniu pierwszym.

• Jeżeli po inkubacji nie stwierdzi się wzrostu drobnoustrojów-preparat jałowy. W przypadku wzrostu drobnoustrojów w badaniu powtórnym-izolacja i identyfikacja.

• Przy stwierdzeniu tych samych zanieczyszczeń w badaniu 1 i 2-preparat niejałowy. Gdy w badaniu 1 i 2 izoluje się różne drobnoustroje-badanie powtarza się po raz 3 z podwójną ilością próbki. Brak wzrostu-jałowy, wzrost-niejałowy.

1. BADANIA OBECNOŚCI SUBSTANCJI GORĄCZKOTÓRCZYCH

Metoda biologiczna na królikach – najczęściej stosowana.

Wymagania:

• Tylko na zdrowych zwierzętach

• Masa ciała powyżej 1,5kg

• Najlepiej na samcach jednej rasy

• Zwierzęta żywione pełnowartościową karmą nie zawierającą antybiotyków

• Zwierze poddaje się 7-14 dniowej obserwacji

Króliki mogą być wykorzystane powtórnie:

- po 3 dniach jeśli nie wykryto pirogenów

- po 14 dniach jeśli w poprzednim badaniu stwierdzono obecność pirogenów

Dalsza selekcja:

• Ustalenie fizjologicznej temp. ciała: pomiar tem. w odstępach 1-3dni, do badań wybiera się króliki, których temp. ciała mieści się w granicach 38-39,8^oC.

• Ustalenie wrażliwości na wstrzyknięcia: podanie każdemu królikowi do żyły brzeżnej ucha pirogennego izotonicznego roztworu NaCl, a następnie sprawdza temp.2-krotnie co 30min. Różnica temp. nie powinna być większa niż 0,2^oC

Sprzęt powinien być jałowy.

Do pomiaru temp wykorzystuje się termometr elektryczny lub rtęciowy.

Wykorzystuje się 3 króliki, badany r-ór ogrzany do temp 37+-2^oC, należy wstrzyknąć do żyły brzeżnej ucha w czasie do 4 min. Temp. ciała należy mierzyc po 60, 90, 120, 150, 180min od chwili podania roztworu w celu ustalenia max wzrostu temp.

Preparat uważa się za wolny od subst.apirogennych jeżeli suma max przyrostów temp.ciała 3 królików nie przekracza 1,4^oC i u żadnego z nich nie stwierdza się wzrostu temp. Ciała o 0,6^oC i więcej.

Przekroczenie tych wartości – powtórzyć badania na 5 następnych królikach. Preparat uważa się za wolny od subst. gorączk. jeśli suma max przyrostów T ciała 8 królików nie przekracza 3,7^oC i nie więcej niż 3 z 8 królików wykazują wzrost T ciała o 0,6^oC lub więcej.

Wady metody:

• Kosztowność

• Pracochłonność

• Możliwość popełnienia błędów

• Duży nakład pracy – wstępna selekcja

• Ograniczenia : pierwiastki promieniotwórcze, leki powodujące hipo- lub hipertermię

Metoda z użyciem lizatu amebocytów skrzypłocza – wykorzystano zjawisko krzepnięcia hemofiliny skrzypłocza pod wpływem endotoksyn bakteryjnych. Ilośc powstałego żelu jest proporcjonalna do ilości endotoksyn. [przebieg reakcji zależy od obecności jonów wapnia i magnezu, odpowiedniego pH (6-7,5), a także od T. metoda ta stosowana jest do:

• Monitorowania procesów otrzymywania wody

• Oceny leków pozajelitowych

• Ocena radiofarmaceutyków

• Ocena materiałów medycznych

Wyróżniamy 4 podstawowe metody oznaczeń:

1. Metoda żel-skrzep. Uzyskanie trwałego skrzepu w probówkach zawierających endotoksyny.

2. Metoda zmętnieniowa. Stężenie koagulogenu w lizacie jest tak dobrane, że pozwala na powstanie wyłącznie zmętnienia. Intensywność zmętnienia jest proporcjonalna so stężenia endotoksyny.

3. Metoda kolorymetryczna. Wywołanie odpowiedniego zmętnienia, a po odwirowaniu precypitatu oznaczeniu w nim białka. Zawartość białka jest wprost proporcjonalna do stężenia endotoksyn.

4. Metoda chromogenowa. Koagulogen jest częściowo lub całkowicie zastąpiony barwnym substratem. Natężenie barwy jest wprost proporcjonalne do zawartości endotoksyn.

Endotoksyna

Proenzymy krzepnięcia zaktywowany enzym

Krzepnięcia

Koagulogen koagulina żel

Sprzęt używany powinien być jałowy i pozbawiony pirogenów. Do oznaczeń potrzebne są wzorce i odczynniki:

• Wzorzec endotoksyny mianowany w jednostkach międzynarodowych

• Liza amebocytów – przygotować bezpośrednio przed użyciem

• Woda LAL – woda do wstrzyknięć, która w warunkach ustalonych dla oznaczeń endotoksyn daje wynik ujemny. Można ją otrzymać np. przez 3-krotną destylację w ukł. zamkniętym.

• 0,1 mol/l r-ór HCl o 0,1 mol/l r-ór NaOH

Technika oznaczeń

Wszystkie roztwory należy wykonywać przy użyciu wody LAL. Przygotowany sprzęt należy ogrzać do 37oC. Po dodaniu preparatu, próby natychmiast delikatnie wymieszać i inkubować 60min w temp.37oC, zabezpieczając przed wstrząsami i parowaniem. Za wynik dodatni uznaje się powstanie swoistego żelu, który nie rozrywa się i nie deformuje, gdy próbka jest powoli odwracana do pozycji pionowej. Brak takiego żelu – wynik ujemny.

Badanie obecności endotoksyn w preparacie.

Wszystkie oznaczenia przeprowadzamy w dwóch powtórzeniach. Preparat badamy w największym dopuszczalnym rozcieńczeniu. Poza tym wykonujemy próbę kontrolną z wodą LAL i 2 próby dodatnie z endotoksyną wzorcową. Jedna z prób dodatnich powinna zawierać dodatkowo preparat w największym dopuszczalnym rozcieńczeniu, a druga wodę LAL.

-Preparat odpowiada wymaganiom testu, jeżeli obie próby dały wynik dodatni.

-Preparat nie spełnia wymagań-obie próby dały wynik ujemny.

Jeżeli jedna próba daje wynik ujemny a druga dodatni należy powtórzyć badanie. (Interpretacja jak wyżej)

Jest to metoda czulsza niż na królikach. Wyniki odznaczają się dużą powtarzalnością ( na królikach stwierdza się rozbieżności-r.anafilaktyczna). Jest to metoda szybsza w wykonaniu. Jest metodą ilościową. Obecnie jest powszechnie obowiązującą metodą.

Wykrywanie zanieczyszczeń:

-met wizualna: do 50 mikrometrów czułość oka, czarne białe matowe ekrany, w świetle ze świetlówki

-met mikroskopowa:

Ocena ilościowa, charakteru, identyfikacja – nawet w emulsjach dożylnych. Sprzęt przygotować wodą przesączoną przez sączek 0,2 mikrometra, w badaniu stos się sączki 0,45 mikrometra w kratkę. Oznaczamy 5 pojemników, 25x odwrócić butelkę, pobrać 5 ml, przesączyć lekkim podciśnieniem. Sączek na szalkę petriego, suszyć w loży pod częściowym przykryciem. Oglądamy sączek w świetle odbitym, przy powiększeniu 100x, liczymy cząstki o wielkości 10 mikrom i większe. Wykonac próbę kontrolną z wodą użytą do przygotowania sprzętu.

W 1 ml poniżej 25 cząsteczek o wielkości 10 mikrom, i nie więcej niż 3 cząstki o wielkości 25 mikrom, brak cząstek powyżej 50 mikrom.

-met. Instrumentalna:

Aparat dz na zasadzie zaciemnienia światła, np. na lini produkcyjnej. Przepływ płynu przez kapilarę, która jest na drodze światła padającego na fotokom. Notowane są zmiany natężenia padającego światła na fotokom (przez zanieczyszczenia).

5 pojemników, pobrać 5x płyn (minimum 5ml) do aparatu.

Pojemniki o poj ponad 100ml – max 25 cząst o wielkości 10 mikrom, i max 3 cząst o wielkości 25 mikrom – w 1 ml.

Pojemniki mniejsze niż 100 ml – max 6000 cząst o wielkości 10 mikrom, a max 600 cząst o wielk 25 mikrom.

Proszek do spoż r-ru infuzyjnego do 100 ml- max 10000 cząst o wielk 10 mikrom i max 1000 cząst wielk 25 mikrom.

Oznaczanie ciśnienie osm i pH

Osmometr, pomiar obniżenia temp zamarzania badanego r-ru. Doprowadzenie do stanu przechłodzenia, krzepnięcie wody, ciepło uwolnione podnosi temp r-ru do temp zamarzania. Odczyt – na skali aparatu w miliosmolach. Kalibracja za pomocą wzorcowego r-ru NaCl. Podniesienie stężenia – zwiększenie interakcji międzycząsteczkowych – wtedy wartość rzeczywista jest mniejsza niż teoretyczna.

PH- potencjometrycznie, po otwarciu pojemnika, bezpośrednio. Pomiar glukozy – dodać nasyconego r-ru KCl (łatwiejszy i dokładniejszy pomiar)

Oznaczenie subst leczn i jednolitości zawart

Jak w monografiach szczegółowych, jeśli zaw SL w pojemniku wynosi max 2 mg lub max 2% - badamy zaw subst w każdej z 10 wybranych losowo pojemników, dopuszczalne odchylenie 15%. Proszki – jeśli zaw w 1 pojemniku wynosi max 40 mg, bada się na jednolitość zawartości, a pozostałe bada się na jednolitość masy. Masa w każdym z 10 wybranych – 90-110% deklarowanej.

Obj płynu uzyskanego z pojemnika

Wstrząsnąć (emulsja) lub podgrzać (r-ry olejowe).

-Pojemniki do 5 ml: pobór strzykawką, zważenie w wytarowanym pojemniku, z gęstości i masy liczymy V (nie może być mniejsza niż deklarowana i nie więcej niż 115%)

-Pojemniki 5 ml i większej: pobór strzykawką do cylindra miarowego z podziałką 0,1 ml. V nie mniej niż deklarowana, nie więcej niż 110%.

-Pojemniki z płynem infuz: cylindrem miarowym, V nie mniej niż deklarowana i nie większa niż 105%.

Oznaczenie aktywności hemolitycznej

Nie są rutynowymi badaniami, wykonywane są przy opracowaniu składu preparatu. Miarą obojętności fizjologicznej jest ocena ich wł hemol, nie badanie fiz. Potrzebne są:

-r-r podstawowy – zbuforowany r-r NaCl, który odpowiada 10% r-rowi NaCl. Ph=7,4. Szczelnie przechowywany.

-r-r pomocniczy – rozcieńczony w stos 1:10 r-r podstawowy. Przygotowany świeżo.

-r-ry wzorcow NaCl po 100 ml – stężenia w zakresie 0,85-0,10%

-krew świeżo pobrana z żyły – do probówki z heparyną pobór

Wzorce do probówek wirówkowych, do kolejnych badany roztwór. Do każdej prob – krew z heparyną i inkubacja (37 st, 30 min). Zmieszać, odwirować, oznaczyć A płynu znad osadu wobec 0,85% r-ru NaCl. Stopień hemolizy liczymy ze wzoru i porównanie z wartościami tabelarnymi.