Cell circadian cycle 2009-12-21 U ssaków rytm 24 godzinny jest zorganizowany jako biochemiczna sieć zegarów molekularnych, które działają we wszystkich tkankach, na czele z głównym zegarem położonym w jądrze nadskrzyżowaniowym podwzgórza (SCN).
Centralny stymulator (rozrusznik) tych zegarów składa się z samoregulujących transkrypcyjnych/posttranskrypcyjnych sprzężeń zwrotnych. Kilka linii wskazuje na istnienie relacji pomiędzy molekułami, które są odpowiedzialne za wytwarzanie rymu okołodobowego i cząsteczek, które kontrolują progresję cyklu komórkowego. Ponadto, wyspecjalizowane punkty kontrolne cyklu komórkowego zaangażowane w naprawę DNA po uszkodzeniu wskazują także na przynajmniej częściowe pośrednictwo białek zegarowych. Najnowsze badania podkreślają również prawdopodobne istnienie związku między zaburzeniami funkcji białek zegarowych a progresją nowotworową. Przegląd ten omawia szczegółowo relacje, które istnieją pomiędzy progresją cyklu komórkowego i elementami machinerii zegara okołodobowego.
WSTĘP
Organizmy żyjące na Ziemi rozwijały zegar okołodobowy jako wewnętrzny system pomiaru czasu, którego okres oscylacji wynosi około 24 godzin, w celu dostosowania się do zmian warunków środowiska. U ssaków, nadrzędny zegar okołodobowy, który generuje i podtrzymuje 24 godzinną częstotliwość jest zlokalizowany w jądrze nadskrzyżowaniowym (SCN) w obrębie przedniej części podwzgórza.
Wykazano, że obustronne uszkodzenie SCN znosi okołodobową rytmikę, a transplantacja SCN jest możliwością przywrócenia tego dziennego rytmu.
Każde jądro SCN składa się z tysięci oscylujących neuronów, każdy w zależności od autonomicznej akcji komórkowej określa fazę rytmu genów zegara okołodobowego.
Centralny zegar wytwarza rytmiczne sygnały wyjściowe, aby instruować liczne zegary obwodowe zlokalizowane w innych tkankach i narządach. Z kolei te obwodowe oscylatory stanowią podstawę rytmów fizjologicznych, metabolicznych i tych uzewnętrzniających się w zachowaniu. W tym przeglądzie najpierw zostanie podsumowana wiedza na temat komórkowych i molekularnych mechanizmów kontroli rytmu okołodobowego, następna część będzie zawierać sprawozdanie z molekularnych powiązań między machinerią zegarową a cyklem komórkowym i zwrócona zostanie uwaga na fakt, że dezorganizacja centralnych genów zegarowych wiąże się z większą podatnością na nowotwory.
KOMPONENTY MACHINERII CYKLU OKOŁODOBOWEO
Istnienie molekularnych mechanizmów podtrzymująch czas zostało po raz pierwszy stwierdzone u muszki owocowej Drosophila melanogaster w 1971 roku wraz z izolacją genu Period. Muszki mutanty genu Period wykazywały zaburzenia w rytmie zarówno w aktywnosci ruchowej jak i cyklu rozwojowym. Pierwszy ssaczy gen cyklu okołodobowego, Circadian locomotor output cycles kaput (Clock) został odkryty za pomocą testu ekranu mutagenezy etylonitrosourea. Myszy z tą mutacją wykazywały wolno przebiegający cykl – w przybliżeniu 25 h zamiast 24 h.
Do tej pory, czternaście centralnych homologów genów cyklu okołodobowego Drosophila zostało zidentyfikowanych u ssaków włączając: Clock; mózgową i mięśniową ARN-t podobne białko 1 (Bmal1); Neuronalne białko 2 z domeną PAS (Npas2); Period 1 (Per1), Period 2 (Per2) i Period 3 (Per3); Cryptochrom 1 (Cry1) i Cryptochrom 2 (Cry2); Zróżnicowanej ekspresji w chondrocycie 1 i 2 (Dec1) i (Dec2); REV-ERBα; Receptor α spokrewniony z receptorem kwasu retinowego (RORα); kinaza kazeinowa Iε (CKIε) i kinaza kazeinowa 1δ (CK1δ) i Timeless (TIM) (Tabela 1). Wymienione geny zegarowe kodują czynniki transkrypcyjne – basic Helix-Loop-Helix (bHLH) – podstawowe helisy-skręt-helisy, które wiążą regulacyjne DNA - główne sekwencje wzmacniacniające CANNTG. Większość z tych czynników (oprócz Dec1, Dec2, Cry1, Cry2), posiada również PAS (Period/Arnt/Single minded) – domenę dimeryzacyjną. bHLH i PAS są powszechymi elementami interakcji białko-białko i wspierają zdolność do dimeryzacji.
MOLEKULARNE OSCYLATORY OKOŁODOBOWE
Mechanizmy oscylacji leżące u podstaw okołodobowego zegara są ściśle powiązane ujemnymi i dodatnimi pętlami sprzężeń zwrotnych. Dodatnie części sprzężeń są pod kontrolą BMAL1, CLOCK albo NPAS2. Heterodimery BMAL1:CLOCK albo BMAL1:NPAS2 wiążą się do Eboxów obecnych w promotorach genów Per, Cry, Rev-erbα, RORα, Dec1 i Dec2 i aktywują ich transkrypcję. Białka PER i CRY są komponentami ujemnych części sprzężeń, które w postaci heterodimerów przemieszczają się do jądra, gdzie inhibują aktywność heterodimerów BMAL1:CLOCK lub BMAL1:NPAS2, a tym samym hamują ich własną transkrypcję jak również transkrypcję Dec1 i Dec2, Rev-erbα i RORα. DEC1 i DEC2 mogą również tłumić swoją własną transkrypcję przez współzawodnictwo o wspólne miejsce wiązania z BMAL1:CLOCK albo BMAL1:NPAS2. Pomocnicze pętle regulacyjne angażują sieroce receptory jądrowe REV-ERBα i RORα, które działają poprzez sekwencje regulatorowe RORE obecne w promotorze Bmal1. REV-ERBα i RORα współzawodniczą o wiązanie z elementami RORE i hamują lub aktywują ekspresję Bmal1, odpowiednio. Jednakże to sprzężenie jest zbędne do generacji rytmu, natomiast przyczynia się do stabilności i charakteru przesunięcia fazy obwodów elektrycznych mechanizmu zegarowego.
Wszystkie molekularne oscylatory przechodzą różne posttranskrypcyjne i posttranslacyjne modyfikacje o kluczowym znaczeniu dla mechanizmu utrzymywania właściwego czasu okołodobowego w organiźmie, który generuje stabilne oscylacje molekularne o cyklu zbliżonym do 24 godzin. Kinazy białkowe CK1ε i CKIδ fosforylują elementy należące zarówno do ujemnych jak i do dodatnich części sprzężeń zwrotnych w SCN, poprzez modulowanie transportu nukleocytoplazmatycznego głównych elementów zegara i tym samym ich aktywności transkrypcyjnej. Modyfikacje chromatynowe poprzez acetylację, deacetylację i metylację histonów, w których obecne są regiony promotorowe centralnych genów zegara, biorą udział w regulacji oscylacji transkrypcyjnych. Gen Clock posiada wrodzoną aktywność acetylotransferazy, aktywacja głównych genów zegara poprzez heterodimery BMAL1:CLOCK jest rzeczywiście preferencyjnie sprzężona z acetylacją histamin. I odwrotnie, represja transkrypcji głównych genów zegarowych przez heterodimery PER:CRY jest związana z deacetylacją i metylacją. Ostatnio wykazano, że CLOCK także wywiera aktywność enzymatyczną na reszty lizyny obecne w jego partnerze – BMAL1. SUMOylacja i ubikwitynizacja stanowią poziom posttranslacyjnej kontroli głównych białek zegara okołodobowego.
GENY ZALEŻNE OD Clock poza SCN
Analizy profilu ekspresi genów zegarowych u ssaków wykazały, że wiele z odpowiadających im produktów mRNA gromadzi się podczas cyklu okołodobowego w wielu tkankach obwodowych łącznie z wątrobą, mięśniami, nerkami, płucami, błonami śluzowymi jamy ustnej i skórą. Ponadto, pokolenie transgenicznych myszy skrywające gen lucyferazy wstawiony do wewnętrz promotorów Per1, Per2 lub Bmal1, pokazuje że tkanki obwodowe w hodowli zachowują rytmikę okołodobową. Wyniki tych analiz wykazały, że SCN nie jest niezbędne do napędzania oscylacji obwodowych. Rzeczywiście gryzonie z uszkodzonym SCN zachowują obwodowe oscylacje mRNA genów zegarowych. Ekspresja okołodobowa wszystkich obwodowych genów jest opóźniona o 3-9 godzin w porównaniu do ich maksymalnej ekspresji w SCN, sugerując że SCN posiada rolę w synchronizacji obwodowych rytmów okołodobowych.
GENY ZALEŻNE OD Clock REGULUJĄ TRANSKRYPCJĘ GENÓW CYKLU KOMÓRKOWEGO
Przejścia między różnymi fazami cyklu komórkowego (G1, S, G2, M) są regulowane przez aktywność cyklin, kinaz zależnych od cyklin (CDKs) i inhibitorów CDK (CKIs), wliczając rodziny cip/kip i INK4.
Istnieją istotne dowody, że progresja w ramach cyklu komórkowego pojawia się o określonych porach dnia i nocy cyklu, sugerując że funkcją systemu zegara okołodobowego jest kontrolowanie tego podstawowego procesu. Rzeczywiście, analizy mikromacierzy wykazały, że kluczowe elementy machinerii cyklu komórkowego włączając cyklinę D1, cyklinę B1, cyklinę E, cyklinę A, P53, Wee1, c-myc, Mdm2 i Gadd45 wykazują ekspresję zależną od cyklu okołodobowego.
Fazy G1/S. p21 regulują negatywnie progresję G1/S i rytmiczną ekspresję w licznych organach obwodowych.
Region promotorowy p21 posiada dwa konserwatywne elementy RORE, zatem ekspresja okołodobowa p21 bezpośrednio wynika z alternatywnej aktywacji albo represji za pośrednictwem RORα i REV-ERBα, odpowiednio (Rys. 2A). Aktywacja p21 przez RORα prowadzi następnie do inhibicji progresji fazy G1. I na odwrót: REV-ERBα bezpośrednio wiążąc hamuje p21, które promuje progresję fazy G1.
Cykliny D1 są także pod kontrol rytmu okołodobowego. Ekspresja cykliny D1 jest znacznie podwyższona u myszy mutanta genów Per1 -/- Per Brdm1 prowadzi do skrócenia cyklu komórkowego i do wzrostu proliferacji komórek. W tym kontekście, geny Per1 i Per2 bezpośrednio promują ekspresję cyklin D1 przez inaktywowanie transkrypcji c-myc (Rys. 2B). Promotor c-myc zawiera wielokrotne sekwencje Ebox i może być kontrolowany przez czynniki transkrypcyjne zegara okołodobowego. U myszy mutatnta Per 1 -/- i Per 2 Brdm1, represja ekspresji c-myc jest kasowana, w wyniku tego następuje podwyższenie ekspresji cykliny D1 i wzrost proliferacji. Natomiast wykazano, w warunkach in vitro, że nadekspresja PER2 prowadzi do zatrzymania przebiegu cyklu komórkowego.
Fazy G2/M. Wee1 jest kinazą tyrozynową, która fosforyluje CDK1 i przez to inaktywuje kompleks CDK1:Cyklina B będący kluczem regulatora przejścia G2/M. Promotor Wee1 zawiera trzy Eboxy, które są aktywowane przez heterodimery BMAL1:CLOCK lub BMAL1:NPAS2 i hamowane przez CRY (Rys. 2C). W ten sposób wysokie poziomy heterodimerów BMAL1:CLOCK lub BMAL1:NPAS2 aktywują ekspresję Wee1, która w konsekwencji fosforyluje kompleks CDK1:Cyklina B i inhibuje przejście C2 -> M cyklu komórkowego. Zakłócenia ekspresji genów okołodobowych mają bezpośredni wpływ na ekspresję Wee1. Zarówno myszy pozbawione Cry1 jak i Cry2 wykazują wysokie poziomy WEE1, prowadzące do upośledzenia proliferacji komórek. Natomiast u myszy z niedoborem Clock, poziom mRNA Wee1 obniża się znacznie. Na podstawie tych danych możemy wnioskować, że funkcjonowanie zegara okołodobowego jest niezbędne do sprawnej proliferacji in vivo.
Odpowiedź na uszkodzenia DNA. W warunkach stresu, uszkodzone DNA u ssaków powoduje aktywację punktów kontrolnych cyklu komórkowego, która prowadzi do zatrzymania cyklu komórkowego, zapewniając czas na zreperowanie uszkodzeń. Białka czujnikowe, które wykrywają uszkodzenia DNA składają się z dwóch członków rodziny białek kinazowych fosfatydyloinozytolu seryny/treoniny: Ataxia Telangiectasia Mutated (ATM) i ATM and Rad3-related (ATR). Aktywacja ATR i ATM przekazuje sygnał uszkodzenia DNA poprzez fosforylację odpowiednio kinazy punktu kontrolnego 1 – Checkpoint kinase 1 (Chk1) lub Checkpoint kinase 2. (Chk2). Zarówno Chk1 jak i Chk2 są z koli odpowiedzialne za zatrzymywanie cyklu komórkowego przez inaktywację CDKów.
Ostatnie badania sugerują, że główne białka cyklu okołodobowego – PER1 i TIM są niezbędne do aktywacji Chk1 i Chk2. Zależna od ATM fosforylacja Chk2 jest zaburzana w komórkach ze specyficzną inhibicją ekspresji Per1. Podobnie regulacja oddolna TIM powoduje zmniejszenie fosforylacji Chk1 przez ATR, w rezultacie powodując nienormalną progresję cyklu komórkowego. PER1 i TIM mogą funkcjonować jako kofaktory do aktywacji ATM albo ATR odpowiednio, albo jako białka adaptorowe do naboru ATM lub ATR. Ta demonstracja bezpośrednich interakcji między genami rytmu okołodobowego i białkami punktów kontrolnych cyklu komórkowego stanowi podstawę do zaangażowania białek cyklu okołodobowego w odpowiedzi na stres.
ZAKŁÓCENIA GŁÓWNYCH GENÓW ZEGAROWYCH PROWADZĄ DO ZABURZEŃ CYKLU KOMÓRKOWEGO.
Istnieją niezbite dowody, że zakłócenie aktywności zegara okołodobowego jest związane z rozwojem nowotworów (Tabela 2). Dodatkowe dysfunkcje cyklu okołodobowego spowodowane przez obustronne odjęcie SCN przyśpiesza tempo wzrostu wszczepionych guzów. Te rezultaty, w połączeniu z badaniami klinicznymi i epidemiologicznymi podkreślają związek pomiędzy zakłóceniem funkcjonowania zegara okołodobowego w nocnej pracy a ryzykiem nowotworzenia, sugerują że dezorganizacja koordynacji rytmu okołodobowego znacznie przyśpiesza rozwój nowotworów złośliwych.
Transformacja zdrowej tkanki w nowotwór złośliwy zwykle występuje w rezultacie zakłócenia ekspresji genów zegara okołodobowego. Fu i in. byli pierwszymi, którzy wykazali, ze brak genu zegarowego (tzn. Per 2) czyni myszy bardziej podatnymi na raka po naświetlaniu promieniowaniem γ. Nadekspresja genów rytmów okołodobowych Per1 lub Per2 w linii komórek nowotworowych, doprowadza do hamowania ich wzrostu. Te badania sugerują, że do funkcji genu Per2 zalicza się supresję nowotworową. Efekt Per2 wydaje siębyć, przynajmniej częściowo, zależny od aktywności transkrypcyjnej β-kateniny. Wzrost aktywności β-kateniny, a w konsekwencji akumulacji swojej docelowej cyklazy D, która występuje u myszy mutanta Per2 Brdm1,przyśpiesza proliferację komórek rakowych. Podobnie, nadekspresja Per2 obniża aktywność β-kateniny.
CKIε jest główną kinazą, która fosforyluje i degraduje PER2 poprzez proteosom. CKIε ulega nadekspresji w nowotworze i inhibicja CKIε powoduje spadek ekspresji cykliny B i cyklin A powodując zahamowanie wzrostu. W związku z tym jest prawdopodobne, że CKIε wywiera działanie onkogenne przez inhibicję funkcji supresji nowotworowej Per2.
Z drugiej strony, myszy mutanty Clock i Bmal1 nie wykazują skłonności do spontanicznego powstawania nowotworów nawet po naświetlaniu promieniowaniem γ, jednak wykazują wysoki stopień apoptozy i niski stopień proliferacji. Zaskakująco, zakłócenie genów Cry1 i Cry2 nie predysponują myszy do spontanicznego lub indukowanego promieniowaniem jonizującym powstawania nowotworu.
WNIOSKI
Geny zegara okołodobowego wykazujące ekspresję w SCN i w tkankach obwodowcyh posiadają wyraźnie znaczenie w kontroli cyklu komórkowego i supresji nowotworowej. Te wyniki teraz niosą ze sobą nowe pytania, które stanowią jeszcze większe wyzwanie, którym jest identyfikacja szczegółowych mechanizmów przez które geny zegara okołodobowego są związane z proliferacją komórek, nowotworzeniem i apoptozą w celu opracowania nowych, kierowanych terapi przezwyciężenia tych chorób.