Wykład 2, 10.10.2013 r.

Przykłady programów mutacyjno-selekcyjnych:

• wyselekcjonowano homoserynowe auksotrofy Corynobacterium glutamicum, które syntetyzują lizynę z 200-300 razy większą wydajnością niż szczep rodzicielski(poprzez wystąpienie jednej mutacji)

• doskonalenie szczepu Penicillium chrysogenum, który wytwarzał pierwszy w dziejach lecznictwa antybiotyk z wydajnością zaledwie 100 jednostek na 1 ml pożywki. Po latach intensywnej, wieloetapowej mutagenezy osiągnięto szczepy produkcyjne wytwarzające penicylinę w stężeniach ponad 85 000 jednostek na ml

Homoseryna pozwala na odcięcie szlaku syntezy lizyny, co pozwala na zwiększenie wydajności. Jest to przykład racjonalnego skriningu.

Selekcja mutantów regulacyjnych:

Selekcja mutantów regulacyjnych opiera się na mutacji w genie regulatorowym lub operonie, która powoduje zakłócenie szlaku regulatorowego i zachodzi nadprodukcja metabolitów np. aminokwasów

Technika selekcji mutantów opornych w stosunku do toksycznych analogów metabolitów pośrednich ma na celu ułatwienie wyizolowania mutantów regulatorowych, u których zakłócony lub wyeliminowany został system kontroli metabolicznej na zasadzie sprzężenia zwrotnego. (chodzi o uzyskanie szczepów nierozpoznających konkretnych inhibitorów przemian i wykazujących tym samym stałą de represję syntezy enzymów dalszego szlaku)

Cel ten może być osiągnięty przez prowadzenie skriningu mutantów w obecności toksycznych analogów, np. aminokwasów czy nukleotydów (pełniących rolę tych inhibitorów). Nabycie trwałej oporności w stosunku do tych analogów może stać się genetyczną przyczyną nadprodukcji określonych metabolitów pierwszorzędowych, np. aminokwasów ponieważ zniesienie systemu regulacji pociąga za sobą podwyższenie ilości lub katalitycznej aktywności odpowiednich enzymów.

• tą drogą uzyskiwano cenne mutanty regulatorowe, syntetyzujące zwiększone ilości aminokwasów

• mutanty Corynobacterium oporne na metioninę charakteryzowały się 18-krotnie wyższą produkcyjnością metioniny

• szczepy wytwarzające tryptofan selekcjonuje się w oparciu o ich oporność na jego toksyczny analog (metabolit) metylotryptofan. Po selekcji w kierunku oporności na 5-metylotryptofan uzyskane także u kukurydzy [zea mays] 200-krotnie zwiększoną zawartość tryptofanu

Ponadto selekcjonuje się liczne szczepy grzybów nitkowych i drożdży w kierunku ograniczenia represji katabolicznej. Jedną z najczęściej stosowanych metod selekcji tego typu mutantów jest hodowla populacji na pożywkach zawierających łatwo przyswajalne źródło węgla w dużych stężeniach i substrat dla danego enzymu (glukozę, względnie jej toksyczny analog 2-deoksy-D-glukozę. W przypadku szczepów opornych na metylaminę otrzymuje się mutanty oporne na represje azotową.

Selekcja mutantów wymaga indukcji, a po indukcji zostają wysiewane na podłoże.

Wyróżniamy 3 rodzaje represji:

węglanowa

azotowa

fosforanowa (ortobaran sodu, przyswajanie zw. fosforu)

Metody racjonalnego skriningu dzielimy na:

Selekcja bezpośrednia

sekcja bezpośrednia polegająca na określeniu produktywności szczepów (np. hodowle w warunkach chemostatu w warunkach ograniczających wydzielanie produktu)

Metody pośrednie

detekcji lub rewersji auksotrofii poszukiwaniu mutantów konstytutywnych (nie wymagają indukcji substratu) obniżeniu stopnia inhibicji produktem końcowym (mechanizm polega na odcięciu sprzężenia zwrotnego (sprzężenie jest potrzebne po to, by nie wytwarzać zbędnych metabolitów) obniżeniu poziomu katabolicznej represji zwiększeniu oporności w stosunku do toksyczności analogów produktów pośrednich metabolizmu obniżeniu wrażliwości w stosunku do wybranych składników pożywek lub prekursorów (fermentacje, powst toksyczne produkty, szczepy uzyskują większą wrażliwość) selekcji mutantów o zwiększonej przepuszczalności ściany komórkowej (uzyskanie większej ilości enzymu, np. wykorzystanie Tween 20)

Porównanie efektów skryningów pośredniego i bezpośredniego w procesie doskonalenia A. Niger

- szczep oporny na jeden rodzaj stresu, może być oporny na wiele innych rodzajów stresów

- wykorzystanie metabolitów wtórnych

- powst. szczepów opornych na wysoką temp

Rekombinacja genetyczna- Jest to proces, w wyniku którego powstają nowe układy genów. Stanowi ona bardziej racjonalny, w porównaniu z mutagenizacją, sposób doskonalenia szczepów przemysłowych.

1. Rekombination u grzybów: cykle seksualny i paraseksualny
2. Rekombinacja u bakterii: transformacja, transdukcja i koniugacja
3. Przegrupowanie czynników genetycznych przy użyciu transposonów
4. In vitro fuzja protoplastów
5. Techniki rekombinacji DNA In vitro

Rekombinacja genetyczna może być realizowana dwojako:

• przez hybrydyzację czyli krzyżowanie szczepów,

• przez konstruowanie sztucznych kombinacji genów In vitro i uzyskiwanie ekspresji zaprogramowanej informacji genetycznej w komórkach wybranego gospodarza

Cykl paraseksualny u A. niger

• W cyklu paraseksualnym poprawiono niektóre cechy grzybów przemysłowych, np. właściwości filtracyjne grzybni A. Niger.

• markerowe szczepy (gł. auksotroficzne) o różnych wymaganiach szczepi się na brzeżce, następnie ezą przenosimy materiał na płytkę z podłożem minimalnym; zrośnięte razem nie rosną (brak grzybni), rozwój grzybni daje pokrycie konidiami

• konsekwencją przemian zachodzących podczas cyklu paraseksualnego jest:

łączenie się jader haploidalnych heterokarionu

powstają konidia diploidalne

powstają diploidalne szczepy o stosunkowo znacznej trwałości

taki spontaniczny diploid może być łatwo izolowany z połączenia jader szczepów auksotroficznych o uzupełniających się wymaganiach odżywczych na podstawie zdolności do wzrostu na podłożu minimalnym.

• dwa szczepy doskonalone metodą klasyczną nie zawsze selekcja prowadzi do powstania form opornych, szczepy muszą wytwarzać dużą liczbę zarodników.

Strategie dla wykorzystania inżynierii genetycznej:

źródło DNA	Źródło DNA dla bakterii: 1. Chromosomalny DNA otrzymany w wyniku trawienia enzymami restrykcyjnymi 2. Komplementarny DNA (cDNA) z dodatkiem linkerów 3. Syntetyczny DNA
wektory	WEKTORY używane w inżynierii genetycznej bakterii oraz ich teoretyczne pojemności: • Plazmid >20 kb • Bakteriofag (lambda) do 22 kb • Bakteriofag P1 95 kb • Kosmity 35-43 kb • BAC 300 kb (sztuczny chromosom bakteryjny)
gospodarze	Bakterie jako gospodarze dla ekspresji informacji genetycznej: bakterie G (-) są zdolne do ekspresji genów bakterii G (+), jednakże w sytuacji odwrotnej nie zawsze jest to osiągalne niestabilność niektórych heterologicznych białek w komórkach gospodarza (proteazy) problemy z sekrecją: ciałka inkluzyjne niewłaściwe fałdowanie polipeptydu, co jest przyczyną powstawania nieaktywnych białek gromadzących się wewnątrz komórek w formie ciałek trudności w procesie post- translacyjnej modyfikacji białek, tj. glikozylacja, fosforylacja czy amidacja
inżynieria metaboliczna
biologia syntetyczna

Drobnoustroje eukariotyczne jako gospodarze dla ekspresji informacji genetycznej:

• Saccharomyces cerevisiae - bezpieczny, duża ilość informacji, łatwy i tani w hodowli w skali

przemysłowej, stosunkowo szybki wzrost oraz łatwy do genetycznej manipulacji/ wydajność

produktu stosunkowo nieska (1-5% całkowitej ilości białek)
• Metylotroficzne drożdże Pichia pasteris i Hansenula polymorpha (posiadają silne indukcyjne

parametry, oraz post-translacyjną modyfikację podobną do występującej w komórkach ludzkich,

jednakże nie wydzielają wielu własnych białek do podłoża)

Zastosowanie metod inżynierii genetycznej:

• stwarza perspektywy uzyskiwania drobnoustrojów produkujących o zupełnie nowych właściwościach. W procesach mutagenezy i rekombinacji genetycznej zakres możliwych modyfikacji jest ograniczony zasobem informacji genetycznej zawartej w genomie jednego organizmu, lub dwóch należących do tego samego gatunku.

• umożliwia łączenie fragmentów genomów pochodzących z dowolnych organizmow dzięki enzymom restrykcyjnym wykazującym szczególną właściwość rozpoznawania określonych sekwencji nukleotydów w łańcuchu DNA i przecinaniu cząsteczki kwasu nukleinowego w idealny sposób, niezależnie od źródła pochodzenia DNA.

• metody inżynierii genetycznej weszły do praktyki przemysłowej w przemyśle farmaceutycznym. Zrekombinowane mikroorganizmy produkują ludzką insulinę (wprowadzona na rynek europejski i USA w 1982 r.) i ludzki hormon wzrostu (wprowadzony na rynek amerykański w 1985 r.). Ważnym osiągnięciem polskiej biotechnologii jest opracowanie i wdrożenie technologii produkcji insuliny ludzkiej Gensulin (w 2000 r.), która jest pierwszym całkowicie polskim lekiem wytwarzanym przez rekombinowane drożdże. Jest to jeden z kilku zarejestrowanych na świecie preparatów ludzkiej insuliny.

• opracowano i stosuje się w procesach produkcyjnych zrekombinowane mikroorganizmy do wytwarzania wielu innych leków, które przechodzą mniej lub bardziej zaawansowane próby kliniczne, takich jak:

ludzki interferon α, β i ᵧ,

aktywatory plazminogenu,

czynniki białkowe krwi stosowane w leczeniu hemofilii,

nowotworowy czynnik nekrotyczny (TNF),

inhibitor interleukiny 1,

limfokiny,

prostoglandyny i ich pochodne,

szczepionki przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby, pryszczycy,

zestawy diagnostyczne w endokrynologii,

nowe środki antykoncepcyjne,

genetyczne sondy diagnostyczne do identyfikacji wielu chorób dziedzicznych i

zakaźnych

Ich droga na rynek, tzn. do pacjenta, przedłuża się ze względu na konieczność przeprowadzenia długotrwałych badań kontrolnych.

Cechy istotne z punktu widzenia inżynierii bioprocesowej:

• w komórkach Saccharomyces sp. udało się sklonować i uzyskać aktywną ekspresję genów typu ”killer”, kodujących białka odpowiedzialne za toksyczność w stosunku do innych grup mikroorganizmów

• wyizolowanie hipertermofilnej β-glukozydazy z bakterii Sulfolobus sulfataricus bytującej w kraterze wulkanu oraz termo stabilnych proteinaz z Pyrococcus i Thermococcus umożliwiło sklonowanie genu tego ostatniego gatunku bakterii w B. subtilis, co pozwoliło na syntezę białka enzymatycznego aktywnego w temp. 110°C

• delecja sekwencji inercyjnych (IS) z genomu E.coli pozwoliła na uzyskanie szczepu o zwiększonej stabilności

Genetyczne problemy z użyciem drobnoustrojów zawierających rRNA:

Głównym problemem jest niestabilność

• struktura zrekombinowanego DNA

• segregacja plazmidu – wektora

• przechowywanie klonów

• warunki hodowli

Czynniki warunkujące wydajność ekspresji sklonowanej informacji genetycznej:

• Struktura wektora i liczba jego kopii

• Indywidualna charakterystyka promotora

• Stabilność mRNA

• Rodzaj lidera i mikroorganizmu

• Regulacja transkrypcji i translacji

• Integracja i rekombinacja z genomem gospodarza

• Replikacja autonomiczna

Inżynieria metaboliczna

Inżynieria metaboliczna- Interdyscyplinarna dziedzina wykorzystująca zasady inżynierii reakcji chemicznych, technik obliczeń numerycznych, biochemii i biologii molekularnej dla zmiany szlaków metabolicznych. Inżynieria metaboliczna posługuje się racjonalną, tzn. wykorzystującą ilościowe, matematyczne metody opisu przemian wewnątrzkomórkowych, analizą efektów zmian genetycznych.

Obejmuje ona trzy zasadnicze etapy:
1. Syntezę tzn. tworzenie zrekombinowanych komórek o zmienionych właściwościach
2. Analizę właściwości uzyskanych komórek
3. Projektowanie dalszych zmian genetycznych

Główne obszary zastosowań inżynierii metabolicznej to:
1. Polepszenie wydajności i produkcyjności natywnych produktów biosyntezy
2. Rozszerzenie zakresu substratów asymilowanych przez drobnoustroje
3. Wytwarzanie produktów nowych dla komórki dla komórki ( białka , biopolimery)
4. Poprawienie ogólnych cech komórki (np. dostosowanie do warunkow hodowli, zmiana szlaków asymilacji azotu, zapobieganie nadprodukcji niepożądanych substancji)
5. Wytwarzanie związków chiralnych jako produktów pośrednich dla farmacji
6. Zastosowanie medyczne: analiza metabolizmu całych organów i tkanek, identyfikacja mechanizmów rozwoju chorób i ich kontroli, sprawdzanie efektywności terapii.

Etapy:

1. Generowanie modyfikacji transgenicznych (np. transformacja) = synteza zrekombinowanych komórek

2. Analiza metabolitów wytwarzanych przez drobnoustroje (analiza ekspresji DNA, produkcja białek)

3. Interpretacja i sugestia dla dalszych badań

4. Planowanie i dalsze modyfikacje (projektowanie)

Kontrola przepływu informacji genetycznej na różnych poziomach:

Aktywna sieć metaboliczna jest uwarunkowana przez poziom syntetycznych enzymów tj. proteome. Przepływy metabolitów są bezpośrednie, a także kontrolowane na poziomie transkrypcji i translacji. W związku z tym jest kilka poziomów kontroli na poziomie:

• transkrypcji

• degradacji mRNA

• translacji

• aktywacji i inaktywacji białek

• allosterycznej kontroli aktywności enzymów (przez zmianę struktury przestrzennej)

Z powodu tej hierarchicznej kontroli trudno jest przewidzieć konsekwencje. Zmiany te mogą dotyczyć zróżnicowania poziomów enzymów i przez to zmienić koncentracje metabolitów jak i wpływać na poziom białek regulowanych, co prowadzi do wtórnego efektu na poziomie transkrypcji i translacji. W rezultacie enzymy katalizujące reakcje biochemiczne warunkują poziom metabolitów – metabolom, który wpływa na ich sprzężenie zwrotne bezpośrednio lub pośrednio.

Przykłady prostych szlaków metabolicznych

W celu podwyższenia produktywności określonego metabolitu istnieje konieczność uwarunkowania przepływy węgla z substratu w kierunku interesujących nas produktów w wysokich stężeniach. To wymaga inżynieryjnego przemodelowania centralnego metabolizmu węgla, co jest trudne ze względu na ścisłą regulację metabolizmu.

Szlak A: wydajność jest stała i wzrost w przepływie J w szlaku wpływa na wzrost produktywności i wydajności produktu. Taki szlak jest mało realny.

Szlak B: bardzo reprezentatywny, substrat przekształcony w oczekiwany produkt lub produkt uboczny, wydajność uzależniona od stosunku J2 do J1. Wydajność jest stała, gdy przepływ kluczowego metabolitu jest stały. Poziom kluczowego met6abolitu jest uwarunkowany do powinowactwa enzymów kontrolujących ten sam metabolizm i jego koncentracji.

Oba enzymy są nasycone substratem, to wzrost przepływu J2 nie będzie wpływał na wydajność produktu. Wzrost przepływu J2 przez nadekspresję enzymów Ej może obniżyć stężenie J poniżej Km enz. Ej i Ek. Trudno jest zaplanować właściwą strategię wzrostu produktywności i wydajności bez wiedzy o kinetyce enzymów i stężeniu metabolitów. Skomplikownie przy inhibicji przez sprzężenie zwrotne © Strategia poprawy wydajności zależy od typu inhibicji

W przypadku takiej inhibicji jest wzrost przepływów metabolitów, za inhibicującym metabolitem(np. produkcja lizyny)przez nadekspresję enzymu warunkującego sekrecję lizyny.

Regulacja genów w sieci metabolicznej:

Szlak metaboliczny prowadzący do biosyntezy związków aromatycznych jest złożony i rozpoczyna się od kondensacji PEP i E4P

Szlak syntezy aminokwasów aromatycznych u E. coli produktem wyjściowym do syntezy aminokwasów aromatycznych jest DAHP.

Mutacje w tym szlaku prowadza do:

• delecji kinaz pyk A i pyk F

• nadprodukcji transketolazy (tkt A)

• nadekspresji transaldolazy (tal)

Modyfikacje szlaku metabolicznego na przykładzie S. cerevisiae regulacja potencjału redox przez ekspresję genu kodującego dehydrogenazę 3-fosfoglicerynową zależną od NADH z L. lactis w wyniku czego obniżony został poziom wewnątrzkomórkowego NADH (5-krotnie) oraz stosunek NADH/NAD (6-krotnie) – skutek: redystrybucja przepływu metabolitówi spadek produkcji etanolu, gliceroli, bursztynianu, a nadekspresja octanu, aldehydu octowego i acetoinów.