SYLWIA POPEK grupa PONIEDZIAŁEK godz. 8.00

Sprawozdanie z ćwiczenia nr 9

Znaczenie centralnego atomu metalu pierścienia porfirynowego cząsteczki chlorofilu.

Chlorofil to bardzo powszechny barwnik roślinny zlokalizowany w chloroplastach. Po za komórkami roślinnymi może także występować w fotosyntetyzujących bakteriach, glonach a nawet zwierzętach. Chlorofil jest kompleksem magnezu z czterema pierścieniami pirolowymi, połączonymi ze sobą w pozycjach 2 i 5 mostkami metinowymi (=CH-) tworzącymi układ porfiryny. Do czwartego pierścienia pirolowego dołączony jest fitol (alkohol). Wyróżniamy kilka rodzajów chlorofilu a, b, c, d oraz g, różnią się one podstawnikiem w bocznych pozycjach szkieletu porfirynowego. W roślinach wyższych występują jedynie chlorofil a (przy drugim pierścieniu pirolowym posiada grupę -CH₃) oraz chlorofil b (przy drugim pierścieniu pirolowym posiada grupę -CHO).

Chlorofile wykazują zdolność absorpcji światła widzialnego w zakresie 370-760 nm, a następnie wykorzystaniu tej energi co ma ogromne znaczenie w procesach fazy jasnej fotosyntezy. Każdy z chlorofili ma swoje widmo absorpcji z dwoma maksimami zlokalizowanymi odpowiednio w zakresie długości fali dla światła niebieskiego oraz czerwonego. Barwniki chlorofilowe charakteryzuje także zdolność emisji pochłoniętej energii w postaci fluorescencji.

Chlorofile bardzo łatwo ulegają rozpadowi pod wpływem działania kwasów oraz zasad. Stosunkowo łatwe jest podstawienie centralnego atomu magnezu innymi jonami metali dwuwartościowych. Prowadzi to do zmiany barwy cząsteczki a także zwiększenia jej stabilności. Zjawisko to zostało wykorzystane w przemyśle.

Przebieg doświadczenia, obserwacje oraz wnioski:

1. Przygotowanie ekstraktu barwników.

Rozdrobniony materiał roślinny utarto z 40 ml 100% acetonu. Otrzymaną masę przesączono przez watę umieszczoną w lejku. Odebrano 1ml roztworu do osobnej probówki i podpisano jako roztwórA (odstawiono w ciemne miejsce). Wniosek: Chlorofil ma zdolność do rozpuszczania w rozpuszczalnikach niepolarnych. Otrzymany roztwór to nic innego jak rozpuszczony w acetonie chlorofil.

1. Otrzymywanie feofityny

Pozostały przesącz otrzymany w punkcie 1 przeniesiono do zlewki i dodano 0.6ml stężonego HCl. Powstał brunatno brązowy roztwór. Odebrano 1 ml roztworu do nowej probówki i podpisano jako roztwór B który następie odstawiono w ciemne miejsce. Wniosek: Brunatno-brązowy roztwór to feofityna powstała na skutek wymiany jonu magnezu na dwa jony wodoru pochodzące z dodanego kwasu.

Określanie stężenia feofityny: Do suchej probówki wlano 2 ml 80% acetonu oraz dodano 200µl (0.2ml) feofityny. Następnie zmierzono absorbancję przy użyciu spektrofotometru:

- dł. fali 653 nm absorbancja 0.171

-dł. fali 665 nm absorbancja 0.344

Stężenie feofityny obliczono ze wzoru:

C_fec=(22.42*A₆₆₅ – 6.81*A₆₅₃ )*10 – po uwzględnieniu rozcieńczenia

C_fec=(22.42*0.344– 6.81*0.171 )*10= (7.712 – 1.164)*10= 65.5 µg/ml

Wniosek: Stężenie feofityny w badanym preparacie wynosi 65.5 µg/ml

1. Otrzymywanie Cu-porfiryn

Do zlewki z brunatnym roztworem feofityny dodano kroplami roztwór 0.2 M CuSO₄ do ponownego uzyskania zielonej barwy. Następnie roztwór przesączono przez sączek z bibuły, odebrano 1 ml substancji do osobnej probówki i podpisano jak roztwór C ( także został odstawiony w ciemne miejsce podobnie jak roztwór A i B). Wniosek: Ponownemu wystąpieniu zielonego zabarwienia roztworu towarzyszyło podstawienie atomu miedzi w centrum pierścienia porfirynowego feofityny.

1. Rozdział barwników

Resztę przesączu z punktu 3 przeniesiono do rozdzielacza, dodano 2 ml benzyny, 1 ml wody destylowanej a następnie delikatnie wymieszano. Po kilku minutach od wymieszania utworzyła się górna warstwa benzynowa o ciemnozielonym zabarwieniu, którą poddano rozdziałowi chromatograficznemu na płytce powleczonej żelem krzemionkowym. Płytkę z naniesionym przesączem barwników wstawiono do kamery zawierającej rozwijacz ( benzyna-izopropanol-woda w stosunku 100:10:0.25). Rozwijacz został wlany w takiej ilości aby zwilżyć płytkę z żelem do wysokości 1 cm. Rozwijacz podsiąkając do góry pociągał za sobą poszczególne barwniki w kolejności od stopnia ich polarności. Rozdział został zakończony gdy pojawiły się wyraźnie rozdzielone poszczególne pasma barwników. Wniosek: Jako pierwsza (patrząc od góry płytki) wędrowała Cu-porfiryna a odpowiadająca chlorofilowi a pasmo niebieskozielone, druga w kolejności była Cu-porfiryna b odpowiadająca chlorofilowi b barwa żółtozielona.

1. Wykreślanie widm absorpcyjnych barwników.

Płytkę z rozdzielonymi pasmami barwników wysuszono przez kilka minut na stole. Pasma Cu-chlorofilu a oraz Cu-chlorofilu b zdrapano i wsypano do oddzielnych suchych probówek. Po całkowitym odparowaniu rozwijacza do każdej z nich dodano 4 ml 100% acetonu. Probówki wstrząsano aż do całkowitej ekstrakcji barwników. Zawiesinę przesączono przez sączek z bibuły filtracyjnej nasączonej rozpuszczalnikiem. Klarowne ekstrakty użyto do wykreślenia krzywych widm absorpcji barwników za pomocą spektrofotometru.

Wniosek: Cu-porfiryny podobnie jak chlorofile mają zdolność absorpcji promieniowania w zakresie światła widzialnego 370-760nm. Maksima absorpcji także obejmują pasmo światła niebieskiego 400-500nm oraz czerwonego 600-700nm. Różnią się jednak wartością dla maksimum absorpcji, i tak przy dł. fali ok. 400 nm (światło niebieskie) w przypadku Cu-porfiryny a wartość ta nie przekracza 0.5 kiedy w przypadku chlorofilu a wynosi ok.2. Podobnie w przypadku Cu-porfiryny b max absorpcji nie przekracza 0.1 kiedy chlorofilu b wynosi ok.0.6. Dla dł. fali ok. 700 (światło czerwone) max absorpcji Cu-porfiryny a nie przekracza 0.5, dla chlorofilu a wynosi ponad 1.5, analogiczną różnicę można zauważyć przy Cu-porfirynie b i chlorofilu b. Wynika z tego iż metaloporfiryny słabiej pochłaniają światło niż chlorofile.

1. Obserwacja fluorescencji barwników roślinnych.

Trzy ekstrakty otrzymane na różnych etapach doświadczenia obserwowano pod lampą UV.

Wniosek: Roztwór A zawierający chlorofil przy świetle UV wykazuje fluorescencję czerwoną podobnie jak roztwór B czyli feofityna która również przy UV świeci na czerwono. Inna sytuacja jest w przypadku roztworu C którym jest Cu-porfiryna, nie wykazuje ona fluorescencji w świetle UV. Dzieje się tak gdyż promienie z zakresu UV są przez tę substancję pochłaniane w niedostatecznej ilości (za mała ilość energii), potrzebnej do zajścia wzbudzenia i ponownego emitowania energii świetlnej w postaci fluorescencji.