SEMINARIUM III - ENZYMOLOGIA___________________________________________________


enzymy - białka odpowiadające za przebieg prawie wszystkich reakcji chemicznych
zachodzących w żywych organizmach
- pełnią funkcję katalizatorów (biokatalizatorów), tzn. przyspieszają przebieg
reakcji, ale same nie ulegają zmianie

- dzięki możliwości równoczesnego łączenia kilku typów katalizy i wielu
mechanizmów katalitycznych w jednym oddziaływaniu enzymu z substratem,
enzymy dają przyspieszenie reakcji nawet do kilkunastu rzędów wielkości

1) Nomenklatura enzymów

miejsce aktywne - region enzymu, złożony z różnych aminokwasów
- tworzone przez trzecio i czwartorzędową strukturę enzymu
- zachodzi w nim kataliza

substrat - cząsteczka przetwarzana/modyfikowana przez enzym w jego miejscu
aktywnym

produkt - cząsteczka przetworzona/zmodyfikowana przez enzym w jego miejscu
aktywnym (po reakcji enzymatycznej)

kofaktor - cząsteczka organiczna lub nieorganiczna, wymagana przez niektóre
enzymy do osiągnięcia aktywności katalitycznej
- np. Mg2+, Fe2+, Zn2+, NAD+, koenzymA, witaminy

holoenzym - kompletny, aktywny katalitycznie enzym wraz ze wszystkimi kofaktorami

apoenzym - białkowa część holoenzymu, bez kofaktorów

grupa prostetyczna - koenzym związany kowalencyjnie z enzymem

cechy enzymów:

specyficzność - enzymy mogą katalizować tylko jeden typ reakcji

selektywność - enzymy mogą wiązać tylko jeden lub kilka zbliżonych do siebie
substratów








2) Hipoteza klucza i zamka

- dokładne dopasowanie pomiędzy miejscem aktywnym enzymu a substratem
- tworzenie tymczasowego kompleksu enzym-substrat
- utworzony produkt ma inny kształt niż substrat
- utworzony produkt zostaje uwolniony z kompleksu
- wolny enzym może ponownie połączyć się z kolejną cząsteczką substratu

3) Indukowane dopasowanie (dłoń i rękawiczka)

- niektóre z białek mogą zmieniać swoją konformację
- związanie substratu do enzymu indukuje zmianę konformacji enzymu
- miejsce aktywne tworzy działającą katalitycznie strukturę

4) Enzymy jako katalizatory

na funkcjonowanie enzymu może wpłynąć:

- temperatura
- pH
- stężenie enzymu/substratu
- kofaktory i koenzymy
- inhibitory

























5) Podstawowe jednostki aktywności enzymatycznej

katal (kat.) - ilość enzymu, która w optymalnych warunkach katalizuje przemianę
jednego mola substratu w czasie jednej sekundy
- jednostka zgodna z układem SI
- bardzo duża jednostka, najczęściej używa się podwielokrotności

jednostka międzynarodowa (IU) - ilość enzymu, która w optymalnych warunkach
katalizuje w czasie jednej minuty przemianę
jednego mikromola substratu

1 katal = 6 x 10⁷ IU

1 IU = 16,67 nkat. (nanokatala)

1 nkat. = 0,06 IU

względne stężenie enzymu (potocznie: aktywność) - stosunek ilości jednostek
aktywności enzymatycznej do
ilości roztworu lub materiału
biologicznego (np. IU/dm3,
nkat/g itp.)

bezwzględne stężenie enzymu - stosunek ilości białka enzymatycznego do ilości
roztworu lub materiału biologicznego

aktywność właściwa - ilość jednostek aktywności danego enzymu przypadającego
na jeden miligram białka danego materiału biologicznego

aktywność molekularna - ilość moli lub cząsteczek substratu przetworzona przez
jeden mol lub cząsteczkę enzymu w czasie jednej sekundy

- jeśli aktywność molekularną obliczamy dla pojedynczego centrum aktywnego
enzymu, wtedy ta wartość stanowi tzw. „liczbę obrotów”
- dla obliczenia aktywności molekularnej mosimy znać masę cząsteczkową enzymu
- dla obliczenia liczby obrotów musimy znać liczbę centrów aktywnych
przypadających na jedną cząsteczkę enzymu












6) Znaczenie niektórych parametrów kinetycznych

stała katalityczne (k_kat.) - jest stałą szybkości przechodzenia substratu przez stan
przejściowy
- limituje ona częstość cykli katalitycznych
- jednostką jest s⁻¹

przyspieszenie katalityczne - określa stosunek stałej szybkości reakcji katalizowanej
do reakcji niekatalizowanej k_kat./k

szybkość maksymalna (V_max) - jest prędkością reakcji enzymatycznej, osiąganą przy
pełnym wysyceniu centrów aktywnych enzymu
substratem
- jednostką jest M/s

sprawność katalityczna (stała specyficzności) - stała reakcji zachodzących przy
niskich zakresach stężeń substratu
- definiowana jako stosunek stałej
katalitycznej do stałej Michaelisa
(k_kat./K_m)
- określa względną szybkość reakcji
osiąganą przy niskich stężeniach
substratu
- wyrażana w s⁻¹M⁻¹

stała Michaelisa (K_m) - jest wielkością stałą charakteryzującą zarówno dany enzym
jak i dany substrat
- jest to takie stężenie substratu, przy którym połowa
cząsteczek enzymu jest wysycona substratem, a prędkość
osiąga połowę szybkości maksymalnej
- wartość tej stałej określa powinowactwo enzymu do
substratu
- im mniejsza wartość K_m, tym większe powinowactwo enzymu
do danego substratu













7) Badanie aktywności enzymów

płyny ustrojowe: - surowica lub osocze krwi
- płyn mózgowo-rdzeniowy
- mocz
- plazma nasienia

tkanki: - biopsja
- fragmenty operacyjnie pobranej tkanki


- enzymy występujące w surowicy/osoczu krwi są pochodzenia głównie tkankowego
- ze względów diagnostycznych można je podzielić na trzy grupy:

a. wydzielnicze (sekrecyjne) - są prawidłowo wydzielane do krwi i wykazują spadek
aktywności w surowicy krwi w uszkodzeniach komórki
wątrobowej
- ich niedobór świadczy o zaburzeniach syntezy
- do tej grupy zalicza się: - proteazy - czynn. krzepnięcia
krwi: II, V, VII, IX, X
- nieswoistą cholinoestrazę
(ChE)
- ceruloplazminę
- acylotransferazę lecytyna:
cholesterol (LCAT)

b. wskaźnikowe (indykatorowe) - są charakterystyczne dla poszczególnych struktur
komórkowych
- mogą być pochodzenia cytoplazmatycznego,
mitochondrialnego, lizosomalnego itp.
- fizjologicznie występują w surowicy w niewielkich
lub śladowych ilościach
- pojawiają się w dużych ilościach po uszkodzeniu
różnych narządów, wykazując niekiedy dużą
specyficzność
- aktualna zawartość enzymu wskaźnikowego w
surowicy zależy od stopnia uszkodzenia narządu,
stężenia enzymu w tym narządzie, rozmieszczenia
go w różnych strukturach subkomórkowych









c. wydalnicze (ekskrecyjne, obturacyjne) - pojawiają się w surowicy na skutek
przeszkody w normalnym odpływie
różnych wydzielin ustrojowych (żółci, śliny,
soku trzustkowego), co doprowadza do
ich zastoju i przejścia enzymu do
krwioobiegu
- należą tu:
- enzymy soku trzustkowego: amylaza,
lipaza, rybonukleazy
- enzymy żółci: fosfataza zasadowa,
gammaglutotransferaza,
aminopeptydaza leucynowa
- kwaśna fosfataza cieczy gruczołu
krokowego




8) Enzymy w diagnostyce

zdrowe osobniki mają poziom enzymów wewnątrzkomórkowych względnie stały, na stosunkowo niskim poziomie






FOSFATAZA ALKALICZNA (ALP)

- wartość referencyjna dla ludzi: 40-125 U/L
- wysokie stężenie ALP w: wątrobie, kościach, łożysku, nabłonku jelita

- fizjologicznie poziom ALP wzrasta w czasie ciąży (izoenzym z łożyska), oraz w
dzieciństwie (inzoenzym z kości)

stany patologiczne (wyraźnie podwyższony poziom, ponad 5 razy):

- nowotwory kości
- marskość wątroby
- problemy ze zrostem kości (po złamaniach)
- zapalenie szpiku
- nowotwory wątroby

AMINOTRANSFERAZY: ALANINOWA (AlAT) i APARAGINIANOWA (AspAT)

- wartość referecyjna dla ludzi: 5-30 IU/L AlAT; 8-40 IU/L dla AspAT

stany patologiczne:

- oba podwyższone w przypadku chorób wątroby (ale AlAT > AspAT)
- wyraźnie podwyższony poziom (100 do 1000 IU/L) = ostre zapalenie wątroby
- umiarkowany wzrost (do 100 IU/L) = marskość wątroby lub nowotwory wątroby

GGT

- wartość referencyjna dla ludzi: 6-45 IU/L mężczyźni, 5-30 IU/L kobiety

- wysokie stężenie GGT w: wątrobie, nerkach, trzustce, komórkach jelita

stany patologiczne:

- umiarkowany wzrost = zapalenie wątroby i nowotwory prostaty
- wyraźne podwyższenie w przypadku choroby alkoholowej i żółtaczki

AMYLAZA

- wartość referencyjna dla ludzi: 50-120 IU/L
- wysokie stężenie w trzustce i śliniankach

stany patologiczne:

- wartość podwyższona około 1000x = ostre zapalenie trzustki
- średni wzrost w surowicy krwi = chroniczne zapalenie trzustki


9) Metody oznaczania aktywności enzymów


1. Metody punktu końcowego

- czas inkubacji enzymu z materiałem biologicznym w optymalnych warunkach dla
działania enzymu, musi być zawarty w takim przedziale czasowym, w którym enzym
działa z szybkością stałą, w warunkach kinetyki serowego rzędu

- w tym czasie powinna nagromadzić się odpowiednia ilość produktów lub nastąpić
takie zmniejszenie stężenia substratu, które gwarantują ich ilościowe oznaczanie

- przerwanie reakcji enzymatycznej przez denaturację enzymu, albo zablokowanie
jego aktywności
- ilościowe oznaczenie ubytku substratu, albo powstałego produktu metodami
pośrednimi lub bezpośrednimi

- odpowiednie obliczenia aktywności z uwzględnieniem ilości materiału
biologicznego, rozcieńczeń, ilości inkubatu po przerwaniu reakcji pobranego do
analizy


2. Metody kinetyczne

- pomiary prowadzone są bezpośrednio w mieszaninie reakcyjnej (inkubacie), w
termostatowanym naczyńku pomiarowym w pierwszych minutach prabiegu reakcji
enzymatycznej
- bardzo często w tych metodach wykorzystuje się ciąg reakcji enzymatycznych
(w których produkt badanego enzymu (pierwszego) jest substratem dla drugiego
enzymu), z udziałem enzymów pomocniczych i enzymu wskaźnikowego