Thermo Scientific Phire Animal Tissue Direct PCR Kit

producent: Thermo Scientific (wersja Dilution Protocol)

Reakcja Direct PCR polegała na badaniu wpływu stresu na gen receptor FSH u kury (Gallus Gallus).

Dilution protocol:

1. Pobrano 0,5 mm fragmentu tkanki z gruczołu skorupowego od osobników nie poddanych stresowi (stanowią one próbę kontrolną) oraz od osobników poddanych temu czynnikowi (głodzonych).

2. Fragmenty tkanki umieszczono probówkach eppendorf i dodano do nich 20 µl Dilution Buffer.

3. Dodano 0,5 µl DNA Release Additive. Wymieszano przez worteksowanie.

4. Probówki inkubowano przez 2-5 minut w temp. pokojowej, następnie umieszczono je w bloku grzejnym o temp. 98^oC na 2 minuty.

5. Przygotowane probówki poddano reakcji PCR. Dodano do eppendorfów z tkankami primer mix o następującym składzie:

- 10 µl buforu Phire Animal Tissue PCR

- 0,2 µl polimerazy Phire Hot Start II DNA

- 0,25 µl primera A

- 0,25 µl primera B

- 4,3 µl H₂O

Sekwencje primerów:

5’-AGA AGG CCA ACA ACC TCG TG-

5’-ACA GCA ATG GCT AGG ATA GGT-

1. Następnie próbki inkubowano z enzymem:

98^oC przez 5 min

98^oC przez 5 sek

62^oC przez 20 sek zaznaczone etapy powtórzono 40 razy

72^oC przez 1 min

72^oC przez 1 min

1. Po wymienionych okresach inkubacji próbki trzymano w temp. 4^oC

2. Na koniec dodano 100 µl DNA Release Additive i 1 ml Liquid Dye Gel. Próbki przeniesiono do studzienek wykonanych w żelu agarozowym i poddano reakcji elektroforezy.

Gen badany Receptor FSH (Gallus gallus): 521 pz

Gen referencyjny: 237 pz

Wyniki i wnioski:

Na podstawie wyników przeprowadzonej elektroforezy można wnioskować, że w studzience nr 14, 16 i 17 widoczny jest prążek odpowiadający prążkowi 521 pz (genu badanego Receptora FSH (Gallus gallus) – który jest odpowiedzialny za kodowanie hormonu folikulotropowego). Gen referencyjny o wielkości 237 pz może znajdować się w studzience nr 4. DNA w studzienkach 5-13 jest widocznie zdegradowane, nie można więc dokonać tutaj analizy materiału genetycznego. W takim przypadku producent zaleca modyfikację reakcji PCR przez zmianę profilu termicznego bądź dodanie jonów Mg²⁺.

Typowy profil termiczny dla reakcji PCR:

1. Denaturacja wstępna 5 minut 95°C

2. Denaturacja własciwa 30 sekund 95°C

3. Wiązanie primerów 30 sekund 60°C około 30 cykli

4. Elongacja 30 sekund 72°C

5. Końcowe wydłużanie 7 minut 72°C

produktu

6. Zakończenie reakcji 4°C

Na podstawie powyższego profilu można wysnuć wniosek, że zastosowany profil termiczny różni się od niego, więc może wpłynąć to na prawidłowość wyników.

Temperatura annealingu powinna być o 5°C niższa od temperatury topnienia primerów, co można obliczyć ze wzoru:

[2n (A + T) + 4n₂ (G + C)] – 5 [^oC]

n - liczba określonych nukleotydów

Temperatura topnienia starterów w danym doświadczeniu:

5’-AGA AGG CCA ACA ACC TCG TG-

[(7+2)*2 + (5+6)*4] - 5 = 18+44-5 = 57

5’-ACA GCA ATG GCT AGG ATA GGT-

[(7+4)*2 + (7+3)*4] - 5 = 22+40-5 = 57

Przyłączenie starterów przeprowadza się przez 0,5 – 2 min, a temperatura łączenia starterów wynosi 50°C - 60°C. Primery powinny zawierać 18 - 30 zasad, zawartość nukleotydów G - C powinna stanowić 20% - 60% w sekwencji primerów, a temperatura topnienia powinna być podobna.

W naszym przypadku temperatura annealingu powinna wynieść 57^oC, a nie 62^oC. Zastosowanie zbyt wysokiej temperatury (wyższej o 5^oC) spowodowało niezwiązanie się starterów z matrycą.