Wykład 5

Prymaza syntetyzuje startery

SSB – zabezpiecza pojedynczą nić

Jak biegnie synteza?

Na nici prowadzącej musi powstać produkt (1000 – 2000 par zasad), później tworzony jest starter i po tym samym druga nić. U E. coli syntetyzuje je ten sam enzym, tzn. polimeraza DNA III.

Synteza jest prowadzona jednocześnie przez jeden kompleks polimerazy DNA III ( w którym jest zdublowana polimeraza – dimer polimerazy DNA III). Kompleks ten syntezuje obie nici.

Na matrycy nici opóźnionej formowana jest pętla.

W dimerze szczególną funkcję spełnia γ, która nadaje asymetrię dimeru.

P – lokuje silnie kompleks w cząsteczce DNA.

Co dalej dzieje się z fragmentami Okazaki?

Łączenie fragmentów Okazaki w komórce prokariotycznej

1. Synteza nici ciągłej z fragmentami Okazaki wymaga 2 procesów:

- usunięcia startera (luka musi być uzupełniona)

- dwa fragmenty nici DNA muszą być połączone

Polimeraza DNA III po dojściu do fragmentu Okazaki oddysocjowuje. Polimeraza jest procesywna.

Enzymem o niskiej procesywności jest polimeraza DNA I (syntezuje krótkie odcinki)

Polimeraza DNA I ma 3 aktywności:

- polimerazowa – tworzy wiązania fosfodiestrowe

- korekcyjna (3’⟶5’) – sprawdza czy dołączany nukleotyd jest komplementarny – jeśli nie to jest usuwany

- egzonukleazowa (5’⟶3’)

Z matrycą wiąże się polimeraza DNA I, degraduje starter, jednocześnie syntetyzuje nową nić DNA, po czym oddsycjowuje od cząsteczki DNA.

Brakujące wiązania fosfodiestrowe uzupełnia ligaza DNA (uzupełnia lukę)

Łączenie 2 nici może być wykonane, gdy na 5’ końcu znajduje się reszta kwasu fosforowego. Ligaza wykorzystywana jest do łączenia rekombinowanych nici DNA.

Widełki replikacyjne – Eucaryota

Elongacja, która zachodzi u Eucaryota i Procaryota jest bardzo podobna.

U Eucaryota tempo zależne jest od helikazy. Białko, które zabezpiecza przed asocjacją to RPA.

Różnica między nimi wiąże się z rozpoczęciem replikacji DNA.

Aktywność primazy jest ściśle zasocjowana z polimerazą α.

Polimeraza α ma niską procesywność – krótko związana z nicią – po zsyntezowaniu krótkiej nici opuszcza ją.

Polimerazy, które kopiują nie są dimerami jak u Procaryota. Tutaj synteza jednej i drugiej nici jest przeprowadzana oddzielnie.

Jedną α, a drugą 𝛔.

W proces syntezy nici opóźnionej zaangażowany jest kompleks RFC, który kontroluje przyłączanie i odłączanie polimerazy 𝛔.

Aktywność 5’⟶3’ u eukariotycznych polimeraz nie została jeszcze zsyntezowana, zatem nie ma starterów (nie są usuwane).

Jak to się dzieje, że w ogóle są usuwane?

Nukleaza FEN1 MF1 usuwa starter u Eucaryota poprzez asocjację z replikacyjnym kompleksem nukleazy na 5’ końcu Okazaki.

Problem - FEN1 nie może wprost zdegradować tego końca, bo zawierają 3 reszty kwasu fosforowego.

Modele obejścia problemu:

1. Medel RNAzy H

Jest to nukleaza, jako substrat ma nić RNA, ale również nić występująca w kompleksie z DNA. Ten starter jest dobrym substratem dla RNAzy. RNAza H degraduje starter. Kolejne reszty są odbudowywane do momentu zostania ostatniej reszty. FEN1 usuwa ostatni nukleotyd oraz niektóre fragmenty DNA, które są korzystne. Ligaza łączy oba fragmenty. Model ten ma jedną wadę – wymagana jest obecność RNAzy H.

1. Model Flap – trzepoczący

W tym modelu RNAza H jest nieobecna, ale istotną rolę pełni polimeraza DNA (Δ lub ε) i helikaza. Polimeraza i helikaza przesuwają się w kierunku 3’. Polimeraza syntezuje nową nić, a helikaza degraduje wiązania wodorowe. Tak przygotowany substrat (odwinięty) jest gotowy do działania FEN1. Odcinany jest cały odstający fragment od matrycy. Brakujący fragment jest uzupełniany przez ligazę.

W komórkach eukariotycznych nie zaobserwowano obecności replisomu bakteryjnego. Natomiast tworzą się wewnątrzkomórkowe struktury.

Maszyneria replikacyjna jest przymocowana na stałe, zaś nić DNA przesuwa się (Eucaryota)

Struktury wewnątrzkomórkowe (immobilizowane) nazywane są fabrykami replikacyjnymi.

Takie struktury zostały zsyntezowane w niektórych komórkach eukariotycznych.

Terminacja bakteryjna

Startują w miejscu startu replikacji i przesuwają się w dwóch kierunkach. Niekoniecznie spotykają się po przeciwnej stronie.

Szybkość syntezy przewyższa 5-krotnie szybkość transkrypcji.

Widełki replikacyjne gdy napotykają na transkrypcję wówczas zwalniają.

Transkrypcja spowalnia replikację.

Germinacja transkrypcji ma miejsce w pewnym obszarze.

W jaki sposób dobierane jest miejsce terminacji?

Za to zjawisko odpowiedzialnych jest 6 sekwencji terminatorowych. Są to sekwencje DNA, które są wiązane przez specyficzne białko.

Białko TUS

Występuje w dwóch różnych orientacjach. Widełki replikacyjne mogą pokonać granicę białka TUS w których zachodzi replikacja.

U Eucaryota nie odnaleziono sekwencji terminatorowych. Może zachodzić w przypadkowych miejscach.

Cząsteczki DNA u Eucaryota nie ulegają splątaniu.

Kohenyzy tworzą kompleks z nowo zsyntezowaną nicią.