Surowce i materiały w biotechnologii

1. Wymierne produkty procesów biotechnologii

• Biomasa organizmów

• Metabolit, np. aminokwas alfa-glutaminianowy

• Metabolit wtórny np. penicylina

• Transformacja – zamiana jednego substratu w drugi

1. Media hodowlane muszą zapewniać:

• Maksymalną wydajność biomasy i produktu

• Maxymalne stężenia produktu i biomasy

• Maxymalną szybkość wytworzenia produktu

• Minimum efektów ubocznych

• Taniość i dostępność przez cały rok

• Minimum trudności technologicznych

1. Składniki podłoża:

• Woda

- odpowiedni skład mineralny

- dostępność w dużych ilościach

- czystość chemiczna i mikrobiologiczna

• Źródła węgla i energii

- węglowodany – roczne zużycie jako składnika podłoża 30 mln ton – podstawowe źródło węgla

- glukoza – dobrze rozpuszczalna w wodzie, łatwo przyswajalna przez mikroorganizmy, czysty produkt końcowy, duża wydajność, powstaje podczas enzymatycznej lub kwasowej hydrolizy skrobi ziemniaczanej lub kukurydzianej, proszek, pasta albo syrop

- sacharoza – glukoza + fruktoza, jej źródłem jest melasa, wykorzystuje się w większości procesów

- melasa - produkt odpadowy w produkcji cukru z buraków cukrowych oraz trzciny, brązowy, gęsty syrop 50% to sacharoza, konsystencja i skład zależy od techniki produkcji cukru i jakości zbioru, mono- i disacharydy, przeważnie trzeba ją dostosować do konkretnego procesu, aby mogła być w podłożu, a to przez substancje niecukrowi, które zawiera, produkcja drożdży, kwasu cytrynowego, etanolu, azotu, aminokwasów, lotnych kwasów organicznych, związków wapnia, posiada właściwości buforujące, produkcja drożdży i etanolu – neutralizacja CaCO₃, gromadzenie w środowisku kwaśnym, zasadowym; oddzielenie osadu i fermentacja tego, co zostało. Kwas cytrynowy + cyjanek żelazo-potasowy, potem dodanie pirosiarczanów lub wodorosiarczanów, które redukują złe działanie cyjanków (fermentacja kwasu cytrynowego)

• Laktoza

• Musi być używana w dużych ilościach np.: serwatki

• Serwatka jako główne źródło laktozy

• Produkowana przez Bacillus subtilis (proteazy serynowe)

• Serwatka otrzymywana podczas produkcji serów z mleka (słodka pH=6) i twarogów (kwaśna pH=4)

• Stosowana do produkcji drożdży paszowych i etanolu

• Płynna, suszona, liofilizowana, odbiałczana

• Zwana cukrem mlecznym

• Laktoza jest słabo przyswajalna przez mikroorganizmy

• W serwatce: His, Val, Leu, Asp, Ala, Tre, wit A, cholina

• Maltoza

• Hydroliza skrobii I glikogenu

• Stanowi główny mechanizm napędowy drożdży w browarnictwie (słód, ekstrakt słodowy)

• Cukier słodowy

• Skrobia

• Stosowana w postaci czystej (proszku) lub składnika np. ziemniaka

• Polisacharyd

• Ziemniaki, zboże, syrop

• Wykorzystywana w produkcji etanolu, butanolu, acetonu.

• Stosuje się upłynnioną postać (po podgrzaniu), bo wyciągnięta z rośliny jest w formie granulek.

• Insulina

• Substancja zapasowa np..: cykoria, Jeruzalem atrychotem (16% całości materiału zapasowego)

• Liniowy polimer fruktozy i glukozy (80:20)

• Rozpuszczalna w wodzie

• Nie daje niebieskiego zabarwienia z jodem

• Właściwości redukujące

• Produkcja etanolu (frakcja)

• Musi być proces wspomagany enzymatycznie – hydroliza enzymatyczna, przez insulinazę (powstaje lewulina + fruktoza =>fermentacja drożdży)

• Celuloza

• Odpady przemysłowe, rolne, np.: papier, słoma, łodygi, odpady rolne niewykorzystywane

• Zbudowana z reszt glukozy (wiązanie beta-1,4-glikozydowe)

• Występuje w ścianie komórkowej roślin

• Celuloza – ligniny + hemicelulozy (to lignina stanowi problem wykorzystaniem odpadów)

• Polisacharydy otrzymane z wodorostów morskich – karaginiany, alginiany, agary. Nie stanowią źródła węgla.

b. źródła niesacharydowe

• Alkohole (etanol, metanol)

• Do produkcji białka paszowego przez Methylophilis methylitropus

• Produkowany z gazu naturalnego i nafty (czystość 99,8%)

• Inni producenci SCP (białka z pojedynczej komórki, np.: drożdże)

• Biosynteza B12 (Pseudomonas), alfa-seryna (Altobacter globiformis), L-Leu, Val (Alkaligenes eutrofen)

• Glicerol

• Bezbarwna, oleista ciecz

• Łatwo miesza się z wodą

• Produkowany przez hydrolizę tłuszczy lub z polipropylenu z ropy naftowej (syntetycznie)

• Wykorzystywany do produkcji erytromycyny (Artrobacter), steroidów (Mycobacterium), dihydroksyacetonu (Acetobacter)

• Tłuszcze

• Synteza antybiotyków i sterydów

• Olej bądź mąka (Soypan, Nurupan)

• Produkcja lipazy, amylazy, proteazy

• Standaryzowana ilość lecytyny (60-65%)

• Jako samodzielne źródło węgla bądź dodatek do sacharydów.

• Węglowodory

• Metan jest zawsze zanieczyszczony siarką

• Szczepy Methylomonas – otrzymywanie SCP jako białka paszowego

• N-butan, jego utlenienie powoduje powstanie mieszaniny estrów, ketonów, aldehydów i kwasów, kwas cytrynowy, Candida, Saccharomyces, SCP

• Substancje gazowe

• CO, CO2, H2 – białka paszowe, źródła różnych pierwiastków

• Kwasy karboksylowe

• Produkcja alfa-Lys, alfa-Glu, alfa-Ile, Thr (Bredibacterium, Corynebacterium, Micrococus)

• Białko paszowe (Candida utilis), kwas octowy + alkohol syntetyczny

• Alfa-Glu – glukoza + kwas teinowy, linolenowy

• Prodigiozyna – kwas oleinowy

• Kwas octowy + glukoza + melasa + hydrolizat białkowy = produkcja tych aminokwasów

c. źródła azotu – ważniejsza funkcja niż źródło węgla (regulacja pH pożywki)

- sole amonowe (grzyby niższe) NH4SO4, NH4OH, NH3 – regulacja pH

- azotany, azot atmosferyczny

- mocznik – wrażliwy na temperaturę

- lepszy azot organiczny niż nieorganiczny

- mąki:

• Sojowa – dużo Glu, mało Met, Cys, synteza streptomycyny przez Streptomyces griseus, inne antybiotyki, sterydy, podpuszczka mikroorganizmów

• Bawełniana – Pharmamedia, Profila, składni – gassypol – antyutleniacz, eliminuje złe działanie utlenionych kwasów tłuszczowych (pieniacze), zwiększenie wydajności

• Kukurydziana – biosynteza chlorotetracykliny, biomy cyny, amylazy glukonowej, proteaz (C i N).

- preparaty białek ziemniaka – produkcja enzymów i antybiotyków, Alburex – proces ekstrakcji skrobi, stosowany w produkcji antybiotyków i enzymów, gdzie zastępują mąkę sojową.

- mamok – nalot kukurydziany – zależy od ilości kukurydzy i technologii ekstrakcji skrobi kukurydzianej. Zawiera aminokwasy, witaminy, sole mineralne. Produkt uboczny otrzymywania w procesie ekstrakcji skrobi kukurydzianej. Może mieć małą jakość Solulys alfa. Wykorzystywany do produkcji izomerazy glukonowej przez Etinoflamens. Wada: różnica składu w zależności od technologii.

- autolizaty drożdżowe i suszone – źródło witamin z grupy B i N

- hydrolizaty białek zwierzęcych i roślinnych – proszki, roztwory, np.: hydrolizat kazeiny ze sterydów, antybiotyków.

- żelatyna – zawiera dużo Gly, Ala, a Małoty, Phe, nie zawiera Trp, wykorzystywana do produkcji żelatynazy i kalogenazy.

d. inne makroelementy

- tlen – sterylny : powietrze, u beztlenowców wystarcza to co jest w źródle C.

- fosfor – sole nieorganiczne (fosforan potasu, amonu, Mg, NH4, fosforan glicerolu). Zapotrzebowanie rośnie w miarę fermentacji

- siarka – SO₄^2- , siarczan amonu

- potas – K2SO4, K2HPO4, KH2PO4

- magnez – MgSO4 * 7H2O

e. mikroelementy

- Mn²⁺, Zn²⁺, Fe3+, wyjątek Lactobacillus

- Cu, Co, Mo, Na, Cl, Ni, Se – zależy od środowiska

f. stymulatory wzrostu

- witaminy z grupy B (biotyna, tiamina)

- alfa-aminokwasy

- związki purynowe i pirymidynowe

g. detergenty

polepszenie wydajności biomasy z n-alkanów, aminokwasów, kwasów organicznych.

h. odpieniacze

- pożądane cechy dobrego odpieniacza:

• Szybkie rozbicie piany

• Zabezpieczenie przed ponownym powrotem piany

• Aktywność w małych stężeniach

• Nietoksyczność

• Łatwy w stosowaniu

• Niepolarny

• Nielotny

• Niska cena

Naturalne: olej słonecznikowy, kwas olejowy, tran

Syntetyczne: silikony, polipropyleny

Dla bakterii – silikon

Dla grzybów – lepsze naturalne

1. Substancje stałe – śruta rzepakowa, otręby pszenne, słoma, sieczka, wylot ki jabłkowe, suszony rozdrobniony chleb razowy

j. antyseptyki – formalina, furozolidyna

k. substancje buforujące – amoniak, wodorotlenek amonu

l. inne – prekursory (kwas fenylooctowy), inhibitory, chelatory (EDTA)

4. ważność pH Klebsiclla aerogenes – własności buforujące

pH 5 – glikol butylenowy

pH 6 – glikol butylenowy + etanol

pH 7 – glikol butylenowy + etanol + mleczan

pH 8 – glikol butylenowy + etanol + mleczan + octan + mrówczan

przez to zmienia się wydajność produkcji

pH powinno wypierać

5. rodzaje pożywek i optymalizacja ich składu

Pożywki mikrobiologiczne:

1. Stan skupienia

• Stałe

• Ciekłe

• Roztwory rzeczywiste

• Emulsje

• Koloidy

• Zawiesiny

1. Skład

• Nieorganiczne

• Organiczne

• Naturalne

• Syntetyczne

Ciekłe: naturalne i płynne serwatki, melasa, alkany, mleka, ścieki przemysłowe, naturalne płyny ustrojowe, wyciągi wodne z surowców naturalnych, wyciąg z mąki sojowej, bulion

Stałe: plewy, opady stałe, rozdrobnione ziemniaki przeważnie suplementowane pożywką ciekłą.

6. opracowywanie składu pożywki jest zasadniczą fazą w uzyskaniu współczynnika wydajności komórki.

W warunkach wzrostu tlenowego masę źródła węgla oblicza się z:

W = sucha masa komórkowa (g/dm³) / zastosowany substrat węglowy (g/dm³)

W­_glukozy­ = 0,5 dla bakterii z 1 grama glukozy otrzymujemy o.5 grama suchej masy komórkowej.

Dla drożdży: Teoria Fiska – w procesie namnażanie biomasy 1/3 węgla w pożywce jest zużywana na procesy energetyczne, a 2/3 na przyrost biomasy.

Stosunek zawartości C:N:P 6:1:0.2

Źródło azotu i węgla – od tego rozpoczyna się obliczenia

7. sterylizacja

- uzyskanie czystej kultury do szczepienia fermentatora produkcyjnego

- sterylizacja pożywek oraz wszystkich składników dodawanych do fermentatora podczas hodowli

- sterylizacja fermentatora

- utrzymywanie aseptycznych warunków podczas kontroli

Rodzaje:

- sterylizacja termiczna ciągła lub okresowa (gorąca para) – fermentatory

- sterylizacja radiacyjna (promienie UV) – pomieszczenia

- sterylizacja chemiczna (gazy) – pokoje, przewody, np..: H2O2 działa na formy wegetatywne i generatywne, wykorzystywany w przemyśle spożywczym.

- sterylizacja „żywą parą”

- sterylizacja przez filtrację

Nie ma czegoś bardziej lub mniej sterylnego. Coś jest sterylne lub nie.

8. metody prowadzenia procesów

Hodowle:

- okresowe

- ciągłe

- okresowe z ciągłym dozowaniem pożywki

a. hodowle okresowe

• Statyczne lub wstrząsane (umożliwia wymianę gazową, rozrost organizmów jednorodnych)

• Fazy hodowli

• Bakterie: wzrost populacji (liczba kom./cm³*h)

• Promieniowce i grzyby – stężenie biomasy (stężenie suchej masy (g/dm³*h))

• Badania precyzyjne – stężenie składników komórek związanych ze wzrostem lub ich rozmnażaniem (azot komórkowy, białko, DNA)

Krzywa wzrostu w hodowli okresowej:

- kształt sigmoidalny

- na początku brak hamowania metabolitami i dostępność substratu.

Najszybciej komórki powstają w fazie logarytmicznej, ale dopiero w fazie stacjonarnej komórek jest najwięcej.

Parametry:

1. Przyrost biomasy

X –różnica biomasy w danym czasie

X = Xmax – X0 [X]=[g]

1. Wydajność wzrostu – Y – charakterystyka zależności między stężeniem biomasy, a stężeniem substratu.

Y = sucha masa [g] / masa substratu [g]

Molowy współczynnik wydajności Ym=sucha masa/mol

Z niego wynika współczynnik energetyczny Y_ATP.

Jest on zależny od sposobu metabolizowania substratu i od tego, ile energii przetworzą komórki

Y_ATP = informuje ile gram biomasy otrzymujemy z 1 mola ATP.

1. Właściwa szybkość wzrostu μ – stosunek przyrostu biomasy w przeliczeniu na jednostkę czasu i jednostkę biomasy, która już istnieje, a także odniesieniu do liczby komórek.

μ = 1/x * dx/dT lub μ= 1/N * dN/dT

μ = (log x_t – log_x0 ) / log (t-t₀)

T_d= ln2/μ T_d – czas podwojenia biomasy

1. Hodowle ciągłe

• Stosowana do produkcji biomasy (np. drożdży) lub w przemyśle farmaceutycznym do biologicznej produkcji związków chemicznych

• Stałe zasilanie fermentorów świeżą ilością pożywki i jednoczesny odbiór tej samej objętości płynu hodowlanego

• Zasada chemostatu (stała szybkość rozcieńczenia) lub turbidostatu (stałe stężenie biomasy)

• Szybkość rozcieńczania hodowli (wielkość stała)

D [1/h] D = F/ν F – natężenie objętościowego przepływu pożywki

W chemostacie μD = Dx

- jeśli przekracza D = biomasa gromadzi się w reaktorze

- jeśli jest mniejsze od D – biomasa wyrywana z reaktora

• Stan ustalony – składniki chemiczne, stężenie biomasy i parametry od których zależy stan fizjologiczny komórki = const. Wzrost ma charakter ograniczony. Limitowany tylko natężeniem substratu.

μ = μ_max *S / K_s + S

K_s – stała półnasycenia – takie stężenie substratu, przy którym μ osiąga połowę swojej wartości.

• Wady: możliwość degradacji szczepów, selekcja osobników o gorszych cechach, biotechnologiczne problemy z czystością mikrobiologiczną, wzrost kłaczkowy mikroorganizmów.

• Procesy produkowane ciągle: białko paszowe, etanol, butanol, aceton, kwas organiczny, antybiotyki, oczyszczanie ścieków metodą osadu czynnego.

9. hodowle synchronizowane

• Do specjalnych celów, np.: w laboratorium

• Komórki w populacji znajdują się zawsze w takiej samej fazie rozwoju osobniczego

• Synchronizacja podziałów komórkowych – wydzielenie osobników o jednakowych np.: wymiarach komórek (wirowanie lub sączenie) będących w tym samym stanie fizjologicznym lub morfologicznym (szok cieplny w przetrwalnikach)

10. fermentory = bioreaktory

• Służą do hodowli mikroorganizmów

• Czasem bioreaktor to reaktor enzymatyczny

• Musi tworzyć odpowiednie środowisko (chroni przed zanieczyszczeniami zewnętrznymi), ale także nie może wytwarzać zanieczyszczeń do środowiska

11. bioreaktory do hodowli wgłębnych

• Hodowla beztlenowa

• Stworzenie środowiska beztlenowego właściwego dla danej hodowli

• Mieszanie nie jest konieczne (jeśli występuje to po to, żeby cząsteczki się nie osadzały)

• Prosta budowa

• Nie ma problemu piany, dlatego podłoża nie muszą być suplementowane odpieniaczami

• Fermentacja etanolowa

• Browarnictwo

• Hodowla tlenowa

• Wyposażone w elementy umożliwiające odprowadzenie gazu i jego rozproszenie w fazie ciekłej

• Odpowiedni materiał fermentora – stal kwasoodporna polerowana – odporna na korozję i częste sterylizacje

• Podział ze względu na sposób dostarczania energii, fermentory o mieszaniu mechanicznym, mieszanie cieczą (woda – muszą posiadać specjalną pompę, trudna sterylizacja), gazem

• Istotna rola – koszt napowietrzania

• Kontrola parametrów fizycznych i fizykochemicznych

• Kontrola natężenia przepływu pożywki – hodowle ciągłe i okresowe z dozownikiem pożywki

• Sterowanie: temperatura, pH, stężenie tlenu

• Modelowanie procesów bioreaktorowych – relacje pomiędzy różnymi zmiennymi procesowymi i efektem procesu takim jak wydajność czy produktywność

• Model wzrostu – formalne równanie podające zależność szybkości przyrostu biomasy od stężenia jednego lub kilku kluczowych substancji oraz warunków hodowli – model bardzo uproszczony

• Ujęcie korelacyjne – sztuczne sieci neuronowe – podają wydajność od nieznanych warunków hodowli

12. bioreaktory do hodowli na podłożu stałym

• Aparaty o działaniu okresowym

• Do produkcji kwasu cytrynowego

• Komora ze stałymi warunkami

• Jest tam system tac i system odprowadzający powietrze

• Odbiera ciepło od komórki, a dostarcza tlen

• Na tace wlewa się pożywki z bakteriami, które produkują kwas cytrynowy

• Czynnik limitujący – wymiana ciepła i masy między złożem a powietrzem

• Cienka warstwa podłoża

• Reaktor z grubą warstwą podłoża

• W komorze panują odpowiednie warunki

• Ruszt z podłożem o grubości 1 metra

• Co pewien czas złoże jest wstrząsane, aby nie powstały bryły mikroorganizmów

• Powietrze idzie pod ruszt

• Reaktor węglowy

• Pożywka sypka

• Reaktor się obraca, aby nie rozgrzewały się dolne warstwy pożywki

13. bioreaktor z unieruchomionym materiałem biologicznym

• Reaktory ze złożem nieruchomym lub cyrkulującym

• Dobór metody immobilizacji do typu fermentora

• Działanie okresowe lub ciągłe

14. bioreaktory membranowe

• Różna wielkość porów

• Funkcje membrany, oddzielenie biomasy, wydzielenie produktów, unieruchomienie materiału biologicznego, oddzielenie przestrzeni reakcyjnej

• Reaktory mikrobiologiczne lub enzymatyczne

• Proces fermentacji mlekowej

15. wydzielenie i oczyszczenie produktów fermentacji

- produkt procesu biotechnologicznego – biomasa lub produkty metabolizmu

- oddzielenie biomasy drobnoustrojów od płynu pohodowlanego, wydzielenie i oczyszczenie produktu

- dobór metody – tak, aby nie doprowadzić do obniżenia aktywności produktów.

16. wydzielanie biomasy

• Nie każda substancja daje się wydzielić w ten sam sposób

• Flokulacja i sedymentacja

• Sedymentacja to metoda rozdzielania zawiesiny

• Wstępna obróbka zawiesiny – aglomeracja komórek

• Flokulacja odwracalna – neutralizacja ładunku na powierzchni komórki (dodatek elektrolitu)

• Flokulacja nieodwracalna – efekt powstania wiązań pomiędzy mikroorganizmami

• Flokulacja zależy od temperatury, pH, siły jonowej, właściwości komórek i ich stanu fizjologicznego

• Czynniki flokulacyjne – sole nieorganiczne, hydrokoloidy mineralne, organiczne polielektrolity, białka

• Flotacja – rozproszenie pęcherzyków gazu i na ich powierzchni absorbują się mikroorganizmy.

• Filtracja

• Zależy od tego, co obrabiamy (bakterie czy grzyby)

• plackowa – cząsteczki stałe zatrzymują się na placku filtracyjnym, który jest wytworzony na przegrodzie filtracyjnej. Wykorzystuje się prasy filtracyjne, próżniowe, filtry obrotowe, filtry taśmowe. Stosowane do wydzielenia grzybni, bakterii poddanych flokulacji (większych)

• objętościowa – przebiega podczas przepływu płynu (gazu) przez przegrodę filtracyjną (typu włókniowego). Stosowana do jałowienia powietrza oraz klasyfikacji zawiesin dobnych.

• Dynamiczna – dzięki odpowiedniemu ukształtowaniu przepływu zawiesiny cząsteczek odpowiednio dużych rozmiarów nie przechodzą przez przegrodę filtracyjną, tylko zostają w środku

Wirowanie

17. dezintegracja komórek

Cel: zniszczenie struktury komórki oraz wydobycie substancji

Dezintegracja:

• Metoda mechaniczna

• W fazie ciekłej

• Ultradźwięki

• Ciśnienie

• Mieszanie

• W fazie stałej

• Rozcieranie

• Metody niemechaniczne

• Odwadnianie

• Suszenie powietrza

• Suszenie próżniowe

• Rozpuszczalnik

• Liza

• Fizyczna

• Chemiczna

• Enzymatyczna

• Biologiczna

18. zagęszczanie roztworów

• Zagęszczanie termiczne – krótki czas kontroli, aparaty próżniowe

• Ekstrakcja

• Ultrafiltracja – różnica ciśnień po obu stronach membrany

• Odwrócona osmoza – mała masa składników

19. oczyszczanie substancji biologicznej

• Krystalizacja

• Metody membranowe

• Chromatografia

20. suszenie

• Podstawowa metoda uzyskania stabilnej formy bioproduktu

• Suszenie rozpyłowe (próżniowe, liofilizacja)