Sylwia Mróz
TŻ, gr V
Sprawozdanie nr 1
Ćwiczenie 1.
Zapoznanie się ze sprzętem laboratoryjnym i zasadami bezpieczeństwa pracy w laboratorium mikrobiologicznym.
Posiew bakterii metodą odciskową i analiza wzrostu kolonii.
Cel ćwiczenia:
Opisanie cech kolonii bakteryjnych powstałych po posiewie na szalce Petriego.
Wykonanie:
Na szalce Petriego zawierającej pożywkę z agaru odciśnięto palce. Posiew został wykonany w warunkach sterylnych. Tak przygotowaną szalkę pozostawiono na okres 7 dni w warunkach dobranych dla wzrostu bakterii (32®C). Po upływie tego czasu dokonano obserwacji.
Obserwacje:
Wielkość koloni: 3mm
Kształt: okrągłe, regularne
Barwa: blado-żółte
Wnioski:
Bakterie wyizolowane z naskórka doskonale rozwijają się na pożywce z agaru. Umieszczone w sterylnych warunkach, w temperaturze 32®C tworzą kolonie widoczne gołym okiem. Mają określone cechy diagnostyczne charakterystyczne dla danego rodzaju bakterii.
Ćwiczenie 2.
Budowa mikroskopu i jego parametry.
Cel ćwiczenia:
Zapoznanie się z techniką korzystania z mikroskopu świetlnego.
Obliczenie powiększenia mikroskopu.
Powiększenie okularu: 10x
Powiększenie obiektywu: 100x
10x · 100x = 1000x
Powiększenie podczas korzystania z takiego zestawu wynosi 1000x.
Barwienie ziarniaków metodą pozytywową i negatywną.
Cel ćwiczenia:
Obserwacja barwionych preparatów bakterii micrococcus i ich analiza.
Wykonanie:
W sterylnych warunkach, na odtłuczone szkiełko podstawowe naniesiono wodę destylowaną. Pobrano materiał biologiczny z wcześniej przygotowanego posiewu i wykonano rozmaz na szkiełku. Po wysuszeniu i utrwaleniu preparatu w płomieniu palnika naniesiono fiolet krystaliczny. Barwiono przez minutę. Następnie spłukano barwnik i obserwowano pod immersją. Drugi preparat przygotowano w następujący sposób: Na odtłuszczone szkiełko naniesiono kroplę niebieskiego atramentu. Wykonano rozmaz i pozostawiono do wyschnięcia na okres 7 dni. Po tym czasie obserwowano pod immersją.
Obserwacje:
Barwienie proste pozytywowe:
Barwienie proste negatywne:
Wnioski:
Barwienie proste pozwala na określenie kształtu i budowy komórek bakteryjnych. W tym przypadku są to formy kuliste (ziarniaki) występujące pojedynczo oraz kilka form skupiskowych tj, dwoinki, formy łańcuszkowe (3-5) oraz nieregularne. Bakterie na które podziałano fioletem krystalicznym są koloru fioletowego.
Barwienie proste negatywne nie zabarwia komórek bakterii. Barwnik skupia się wokół komórek.
Ćwiczenie 3.
Izolacja pałeczek Bacillus z gleby. Barwienie metodą Grama i Shaeffera-Fultona.
Cel ćwiczenia:
Określenie rodzaju bakterii wyizolowanych z gleby oraz zbadanie obecności form przetrwalnikowych.
Wykonanie:
W sterylnych warunkach pobrano ok. 2g gleby i dodano ją do płynnej pożywki. Probówke umieszczono w łaźni wodnej na czas 10 minut i pozostawiono na tydzień do wzrostu. Po upłynięciu 7 dniu wyżarzoną ezą pobrano materiał biologiczny i wykonano posiew redukcyjny na pożywkę z agarem. Posiew pozostawiono na okres 7 dni. Po tygodniu wykonano dwa rozmazy.
Jeden z utrwalonych preparatów barwiono metodą Grama. Na początku zadziałano fioletem krystalicznym przez minutę, spłukano barwnik a następnie polano preparat płynem Lugola i pozostawiono na minutę. Barwnik dokładnie spłukano alkoholem przez 20 sekund. Przerwano jego działanie wodą destylowaną. Następnie zadziałano safraniną przez 45 sekund. Po spłukaniu i osuszeniu preparatu oglądano pod immersją.
Drugi preparat po wcześniejszym utrwaleniu polano zielenią malachitową. Ogrzano nad płomieniem palnika do tzw. „trzeciej pary”. Barwnik spłukano a następnie działano safraniną przez 45 sekund. Spłukany i wysuszony preparat oglądano pod immersją.
Barwienie Bacillus metodą Grama:
Barwienie Bacillus metodą Shaeffera-Fultona:
Wnioski:
Bakterie Bacillus są komórkami Gram-dodatnimi. Ich błony komórkowe barwią się na kolor fioletowy przy zastosowaniu metody Grama. Niektóre obserwowane laseczki posiadały niewybarwione zgrubienie. Są to przetrwalniki, które laseczki tworzą
Barwienie metodą Shaeffera-Fultona pozwala zaobserwować formy przetrwalnikowe laseczek. Komórki barwią się na kolor blado-czerwony, natomiast formy przetrwalnikowe obserwowane są w kolorze zielonym.
Ćwiczenie 4.
Test na katalaze.
Cel ćwiczenia:
Określenie czy wyizolowano Bacillus czy Clostridium. Określenie czy laseczki są katalazo „+” czy katalazo „-”.
Wykonanie:
W jałowych warunkach na szkiełko podstawowe naniesiono kroplę 3% wody utlenionej. W kropli zawieszono wyizolowane laseczki.
Obserwacje:
Brak.
Wnioski:
Brak pienienia się zawiesiny laseczek wykazuje, że bakterie te nie produkują enzymu – katalazy, czyli są katalazo ujemne. Wynika z tego fakt, że wyizolowane laseczki są rodzajem Clostridium.
Bakterie katalazo dodatnie rozkładają nadtlenek wodoru do wody i tlenu.
2H2O2 2H2O + O2↑
Ćwiczenie 5.
Posiew laseczek na podłoże z azotanem(V).
Cel ćwiczenia:
Wykrywanie mikroorganizmów redukujących azotany.
Wykonanie:
W jałowych warunkach zawieszono bakterie w płynnej hodowli zawierającej azotany(V). Probówkę pozostawiono na tydzień. Po upłynięciu 7 dni do probówki dodano ok. 0.3 ml odczynnika Grissa.
Obserwacje:
Po dodaniu odczynnika Grissa zawartość probówki zabarwiła się na różowo.
Wnioski:
Wyizolowane z gleby bakterie posiadają zdolność redukcji azotanów (V) do azotanów (III).
Ćwiczenie 6.
Barwienie Escherichia Coli oraz Acetobacteraceae metodą Grama.
Cel ćwiczenia:
Określenie przynależności bakterii E.Coli i Acetobacter do bakterii gram dodatnich lub gram ujemnych.
Wykonanie:
W jałowych warunkach z hodowli E.Coli i Acetobacter wykonano rozmazy. Obydwa preparaty barwiono metodą Grama. Po wysuszeniu oglądano pod immersją.
Obserwacja E.Coli:
Obserwacja Acetobacter:
Wnioski:
Barwienie metodą Grama wykazało, że te bakterie są gram ujemne. Zabarwiły się na kolor różowy. Barwnik podstawowy został wypłukany przez alkohol, gdyż ściana komórkowa o małej ilości mureiny a dużej lipidów nie były w stanie zatrzymać barwnika. Bakterie przyjęły kolor safraniny – barwnika kontrastowego.
Ćwiczenie 6.
Barwienie promieniowców metodą Grama i metodą Ziehl – Nielsena.
Cel ćwiczenia:
Określenie czy promieniowce są gram dodatnie czy gram ujemne. Zbadanie kwasoodporności komórek promieniowców.
Wykonanie:
W jałowych warunkach wykonano dwa rozmazy z wcześniej przygotowanych hodowli promieniowców. Jeden z rozmazów barwiono metodą Grama a drugi metodą Ziehl – Nielsena.
Metoda Ziehl – Nielsena:
Na preparat z rozmazem naniesiono fuksynę fenolową i ogrzewano nad płomieniem palnika do trzeciej pary. Barwnik spłukano wodą destylowaną a następnie działano alkoholem z dodatkiem HCl przez ok. 30 sekund. Spłukano wodą destylowaną a następnie naniesiono błękit metylowy na ok. 2 minuty. Całość dokładnie spłukano wodą a po dokładnym osuszeniu oglądano pod immersją.
Obserwacje, barwienie metodą Grama:
Obserwacje, Barwienie metodą Ziehl – Nielsena
Wnioski:
Promieniowce są gram dodatnie, gdyż barwią się na kolor fioletowy.
Metoda Ziehl – Nielsena dowodzi, że większość komórek promieniowców jest niekwasoodporna, gdyż wybarwiają się na kolor fioletowo-niebieski.