PRAKTYCZNY

Micrococcus luteus – pakietowiec (kostka) – Gram + - kolor fioletowy

Staphylococcus aureus (Gronkowiec złocisty )– gronkowiec – Gram + - kolor fioletowy

Staphylococcus epidermidis – gronkowiec – Gram +

Bacillus subtilis (laseczka sienna) – laseczki – Gram + - fioletowy

Escherichia coli (Pałeczka okrężnicy) – pałeczki – Gram - - kolor różowy

Pseudomonas Fluorescens – pałeczki – Gram - - różowe

Azotobacter chroococcum – pałeczki – Gram + - fioletowe

Bacillus mycoides (włochaty) – laseczki – Gram + - fioletowy

Jogurt – pałeczki i ziarniaki – Gram + - fioletowy

Mycobacterium phlei – prątki (proste lub nieznacznie zakrzywione) – kwasoodporne, słabo Gram oddatnia

saccharomyces cerevisiae – drożdże jednokomórkowe

Ćw.2

BARWIENIE PRZYŻYCIOWE drożdży (saccharomyces cerevisiae):

1. na odtłuszczone szkiełko nanosimy pipetą krople błękitu metylowego (rozcieńczonego) 1:10 000

2. Pobrać ezą bakterie (sacharomyces), rozetrzeć mieszając z błękitem metylowym, nakryć szkiełkiem i oglądać pod powiększeniem 40!

3. Podgrzewamy preparat nad palnikiem i oglądamy ponownie.

   Martwe: niebieskie

   Żywe: niewybarwione

• Po ogrzaniu więcej komórek niebieskich (uszkodzona błona kom. Barwnik wnika do wnętrza).

BARWIENIE PROSTE

1. Na odtłuszczone szkiełko nanosimy kroplę NaCl 0,85%

2. Pobrać materiał ezą i wykonać rozmaz w kropli soli fizjologiczej

3. preparat wysuszyć i utrwalić preparat w płomieniu palnika (x3)

4. Barwić błękitem metylowym 0, 3%, 2 min, spłukać wodą osuszyć i oglądać pod immersją.

• Laseczki

  BARWIENIE GRAMA:

  1. Wykonać rozmaz bakterii

2. wysuszyć , utrwalić preparat nad palnikiem i ostudzić

   3. BARWIMY

fioletem krystalicznym - 2 minuty,

- spłukać wodą,

- zalać preparat płynem Lugola - 1 minutę,

- spłukać wodą,

- odbarwić alkoholem etylowym - ok. 30 sekund (do odbarwienia),

- spłukać wodą,

- barwić fuksyną zasadową - 20-30 sekund,

- spłukać wodą,

1. Preparat osuszyć bibułą filtracyjną i oglądać pod immersją.

   GRAM DODATNIE: fioletowe

   GRAM UJEMNE: różowoczerwone

   ćw. 3

   BARWIENIE WOLUTYNY U DROŻDZY:

   hodowla 7-dniowa („stara”) S. cerevisiae

1. Na odtłuszczone szkiełko kropla soli fizjologicznej

2. Wykonac rozmaz

3. Utrwalić metanolem -3 krotnie nanieść i czekać do odparowania !

4. Barwimy błękitem toluidynowym 0,1%- 20 min w komorze wilgotnej.

5. Po 20 min zalewamy 1% roztworem kwasu siarkowego 1min.

6. Polać wodą, osuszyć w bibule filtracyjnej, oglądać pod immersją.

   Wolutyna zabarwi się na granatowo.

BARWIENIE TŁUSZCZU:

7-dniowa („stara”) S. cerevisiae na skosach brzeczkowych

1. Przygotować rozmaz w kropli soli fizjologicznej

2. Utrwalać 3-kotnie metanolem (jw.)

3. Bawić Sudanem III w komorze przez 30 min.

4. Po 30 min. Płukać 50% metanolem przez 30 s.

5. Przemyć wodą destylowana

6. Osuszyć w bibule i oglądać pod immersja

   Krople tłuszczu są wiśniowe.

   Ćw.4

   BARWIENIE JĄDRA KOMÓRKOWEGO DROŻDZY:

   48-godzinna hodowla S. cerevisiae na skosie brzeczkowym

1. Wykonujemy rozmaz na soli fizjologicznej,

2. po wysuszeniu utrwalamy 3 krotnie metanolem do wyschnięcia

3. Potraktować 5 min HCL 1M w łaźni wodnej w temp w celu usunięcia RNA

4. Barwnik Giemsy w wilgotnej komorze 15 min temp !

5. Opłukać wodą, osuszyć, oglądać pod immersją

   Jądro: fioletowo niebieskie, komórka jaśniejsza

Ćw.5

BARWIENIE OTOCZEK METODĄ DORNERA:

1. kroplę zawiesiny Azotobacter chroococcum zmieszać z taką samą objętością tuszu

2. wykonać rozmaz szkiełkiem podstawowego

3. wysuszyć i utrwalić

4. fuksyną zasadową – 1 min

otoczka jest niewybarwiona- jasna na ciemnym tle, wnętrze zabarwione na czerwono komórki bakteryjne.

RUCH BAKTERII W KROPLI WISZĄCEJ

18 – 24 godz. hodowla szczepów bakterii urzęsionych, np. E.coli.

Szkiełka podstawowe z łezką, szkiełka nakrywkowe.

Wazelina.

• Na brzegi szkiełka nakrywkowego nanieść niewielką ilość wazeliny, a zawiesinę bakterii nanieść centralnie przy pomocy ezy.

• Szkiełko nakrywkowe nakryć szkiełkiem podstawowym tak, aby wgłębienie znajdowało się nad kroplą. Szkiełko nakrywkowe lekko docisnąć.

• Szybkim ruchem (ale delikatnie!) obrócić szkiełka i oglądać pod powiększeniem 10x40.

Ćw.6

Barwienie przetrwalników metodą Schaeffera

• wykonać rozmaz z 72-godzinnej hodowli Bacillus mycoides, preparat wysuszyć i utrwalić,

• preparat zalać zielenią malachitową na 5 minut, ogrzewać nad płomieniem palnika do ukazania się pary. Po ostygnięciu preparatu zabieg powtórzyć 2-krotnie,

• przemyć wodą,

• barwić fuksyną zasadową przez 1 minutę,

• przemyć wodą, wysuszyć w bibule filtracyjnej i oglądać pod powiększeniem 12,5x100 (imersja),

Wynik: komórki wybarwiają się na czerwono(różowo) , natomiast przetrwalniki na zielono.

Barwienie prątków metodą Ziehl-Neelsena:

• wykonać rozmaz z hodowli prątków kwasoopornych Mycobacterium phlei,

• preparat wysuszyć i utrwalić,

• preparat barwić roztworem fuksyny karbolowej, ogrzewać nad płomieniem palnika do ukazania się pary.

• po ostygnięciu preparatu zabieg powtórzyć jeszcze 2-krotnie,

• odbarwić alkoholem z dodatkiem kwasu solnego (1-2 minuty),

• zmyć wodą, a następnie zalać barwnikiem kontrastowym (3% wodny roztwór błękitu metylenowego) i barwić ok. 15 sekund

Podłoże mikrobiologiczne – środowisko zapewniające optymalne warunki do rozwoju mikroorganizmów. Musi być ono jałowe, przejrzyste i zawierać odpowiednie składniki – źródło węgla, azotu, energii (z reguły źródłem energii w podłożu jest węgiel).
Podłoże mikrobiologiczne musi być także wyposażone w odpowiednie pH, ciśnienie osmotyczne (NaCl) oraz potencjał redox.

Podział podłoży mikrobiologicznych:
a) stan skupienia:
- płynne – namnażanie bakterii,
- półpłynne – obserwacja ruchów bakterii + określanie cech biochemicznych,
- stałe – zwykle w formie tzw. ‘skosu’, stosowane w celu przechowywania bakterii.
b) zawartość składników odżywczych:
- minimalne (zawierają jedno źródło węgla, pochodzące głównie z rozkładu węglowodanów, np. podłoże M9 – z ropą naftową),
- pełne (wiele źródeł węgla, np. bulion odżywczy),
- wzbogacone (stosowane z reguły do posiewu bakterii chorobotwórczych; wzbogacone o krew, mleko, żółtko jaja, itp.).
c) pochodzenie:
- naturalne (np. bulion),
- półsyntetyczne (większość składników podłoża jest znanych, lecz nie wszystkie),
- syntetyczne (o konkretnie określonym składzie).
d) zastosowanie:
- z dodatkiem czynnika selekcyjnego (np. podłoże z antybiotykiem, metalem ciężkim, itp.),
- podłoże do namnażania,
- wybiórcze (podłoże, w przypadku którego składniki powodują wzrost jednej grupy mikroorganizmów, hamując jednocześnie rozwój drugiej; z reguły są to podłoża stałe),
- namnażająco-wybiórcze (hamowanie namnażania jednej biomasy, namnażanie drugiej),
- identyfikacyjne (wykrywanie konkretnego gatunku mikroorganizmów).

Agar – policukier, wielocukier zawierający galaktozę, resztę siarczanową, jony magnezu i wapnia; otrzymywany z glonów - krasnorostów. Posiada gęstszą konsystencję niż żelatyna i ulega topnieniu w temp. powyżej 45° C. Jest rozkładany przez nieliczne bakterie; jego skuteczniejszość jest więc większa niż żelatyny.

Żelatyna – białko, będące hydrolizatem kolagenu, pozyskiwane z wieprzowiny z chrząstek. , do scalania podłoża, może być wykorzystywany przez mikroorganizmy

Bulion – wyciag z mięsa wzbogacony w składniki odrzywcze

Dezynfekcja – zabijanie tylko form przetrwalnikowych.

Sterylizacja – zabijanie form wegetatywnych i przetrwalnikowych mikroorganizmów.

Pasteryzacja – rodzaj sterylizacji, w którym przyjmowaną temperaturą jest 63-65° przez 30 min, 72° przez 15 min lub 90 ° C bez zatrzymywania w aparacie (WYJĄTEK! – pasteryzacja UHT – ciecz poddawana jest wysokiej temperaturze tylko na kilka sekund ).

Laminar – stanowisko pracy mikrobiologa, oddzielone od środowiska szybą, wyposażone w światło UV oraz przepływ sterylnego powietrza.

Autoklaw – pożywki, bufory, płyny fizjologiczne, woda destylowana - urządzenie, służące sterylizacji pożywek o składnikach odpornych na wysokie temperatury. Sterylizacja możliwa jest dzięki gorącemu (120 ° C) sprężonemu powietrzu, ciśnienie 1 atmosfery, czas 20 min; sterylizacja za pomocą pary wodnej pod zwiększonym cieśnieniem

Suszarki (sterylizacja szkła) – urządzenia, służące do sterylizacji szkła – suche powietrze . Sterylizacja w wysokiej temperaturze (160-180 ° C) przez 2h od momętu uzyskania odpowiedniej temperatury.

Aparat Kocha (tyndalizacja) – służy do sterylizacji podłoży w bierzącej parze wodnej. Jest to wielki kocioł, z podwójnym dnem. W dolnym rejonie kotła znajduje się gorąca woda, która przechodząc w parę wodną (temp. Ok 100 ° C), unosi się w wyższe rejony kotła i sterylizuje podłoża. Jest to metoda sterylizacji, w przypadku której formy przetrwalnikowe i niektóre wirusy nie ulegają degradacji. 3x po 30 min w odstępach 24h

Sterylizacja przez filtrację – pożywki z mocznikiem, surowice krwi - rodzaj sterylizacji, w przypadku którego używany jest specjalny zestaw filtrujący (lejek, kolba, pompka wytwarzająca podciśnienie, itp.). Wielkość porów w lejku zależy od filtrowanego materiału: 0,22 mikrometrów – dla bakterii, 0,45 mikrometrów – dla wirusów.; pożywki, bufory, płyny ustrojowe, i roztwory

Sterylizacja promienieniami UV ( powierzchniowa)– ta metoda sterylizacji używana jest głównie do wyjaławiania pomieszczeń. Zakres długości fali świetlnych: 230 – 270 nanometrów (długość fali zabójcza dla bakterii: 260 nm).
Traktowanie bakterii falą o długości 260 nm powoduje tworzenie dimerów:
a) tyminy – DNA staje się niestabilne, co prowadzi do śmierci bakterii,
b) cytozyny – efekt mutagenny.

TYNDALIZACJA – 3-krotna sterylizacja podłoża (powodowanie kiełkowania form przetrwalnikowych, a następnie sterylizacja. Czynności te przeprowadza się 3 razy). – aparat kocha

DEKOKTACJA – sterylizacja przez gotowanie.

WYŻARZANIE – opalanie sprzętu laboratoryjnego (ezów).

FOTOREAKTYWACJA – naprawa DNA u bakterii. Polega ona na rozszczepianiu dimerów przez odpowiedni enzym (fotoliazę).

Sanityzacja – działania, zapobiegające zakażeniom oraz ograniczające rozwój bakterii (traktowanie detergentami, środkami chemicznymi).

Aseptyka - postępowanie mające na celu dążenie do jałowości pomieszczeń, narzędzi, materiałów opatrunkowych i innych przedmiotów w celu niedopuszczenia drobnoustrojów do określonego środowiska, np. otwartej rany.

Antyseptyka - postępowanie odkażające, mające na celu niszczenie drobnoustrojów na skórze, błonach śluzowych, w zakażonych ranach. W przeciwieństwie do dezynfekcji, antyseptyka nie dotyczy odkażania przedmiotów.

Eza – sterylizacja nad ogniem

Głaszczka , szczypce, penseta – alkohol + płomień



ĆWICZENIE 2

Rodzaje mikroskopów:
a) Mikroskop akustyczny - przyrząd wykorzystujący fale ultradźwiękowe (o częst. do kilku GHz) do otrzymywania powiększonego obrazu elementów struktury ośrodka sprężystego,
b) Mikroskop elektronowy zbudowano według idei mikroskopu optycznego ale w miejsce promieni świetlnych używa się wiązki elektronów,
c) Mikroskop fluorescencyjny to mikroskop świetlny używany w badaniach substancji organicznych i nieorganicznych, którego działanie oparte jest na zjawisku fluorescencji i fosforescencji, zamiast, lub razem ze zjawiskami odbicia i absorpcji światła (co jest wykorzystane w klasycznym mikroskopie optycznym). Pozwala na wyznakowanie interesujących elementów komórki (np. białek, czy organelli), fluoforami o zadanych właściwościach (np. barwie emisji),
d) Mikroskop holograficzny to mikroskop pozwalający uzyskać bardzo dużą głębię ostrości i szybką rejestrację obrazów 3D, dzięki pomiarowi natężenia i fazy promieniowania rozproszonego przez obiekt. W m.h. soczewkowym najpierw otrzymuje się zarejestrowany na płycie fot. obraz interferencyjny, a następnie, po jego wywołaniu, odtwarza z niego holograficzny obraz pozorny obserwowany za pomocą okularu,
e) Mikroskopia jonowa - bardziej poprawnie zwana mikroskopią pola jonowego Field ion microscopy (FIM) to technika analityczna stosowana w nauce o materiałach. Za pomocą tej techniki można oglądać atomy na powierzchni specjalnie spreparowanych, gładkich i twardych metalowych odkuwek,
f) Mikroskop konfokalny – nowoczesna odmiana mikroskopu świetlnego, w którym źródłem światła jest laser. Mikroskop ten umożliwia dokonywanie tzw przekrojów optycznych preparatu, analizuje bowiem światło pochodzące z jednej jego płaszczyzny, eliminując światło docierające z warstw położonych wyżej lub niżej,
g) Mikroskop optyczny to urządzenie do silnego powiększania obrazu, wykorzystujące do generowania tego obrazu światło przechodzące przez specjalny układ optyczny składający się zazwyczaj z zestawu kilku-kilkunastu soczewek optycznych. Mikroskop optyczny może wykorzystywać zwykłe światło dzienne, dostarczane do układu optycznego przez specjalne lusterko, lub wykorzystywać sztuczne światło, którego źródło znajduje się zazwyczaj pod analizowaną próbką.  Mikroskop optyczny używany do badań obiektów anizotropowych w świetle spolaryzowanym. Stosowany jest m.in. do badania: kruszców, minerałów, preparatów biologicznych, struktury komórek i tkanek, w matalografii, w przemyśle szklarskim i włókienniczym,


h) Mikroskop stereoskopowy (binokular) - mikroskop optyczny z oddzielną optyką dla obu oczu pozwalający na przestrzenne widzenie obrazu powiększanego.

Budowa mikroskopu optycznego:



Zdolność rozdzielcza mikroskopu – najmniejsza odległość między dwoma punktami, które dostrzegalne są jeszcze oddzielnie.
Zastosowanie olejku immersyjnego powoduje zwiększenie zdolności rozdzielczej mikroskopu.
Wzór:
d = 2A/ lambda A – apertura numeryczna, lambda – dł.fali świetlnej.


Barwienie mikroorganizmów:
- barwienie proste – barwienie preparatu tylko jednym barwnikiem przez 1-2 minut, np. barwienie drożdży fioletem metylenowym,
- barwienie złożone – barwienie preparatu kilkoma barwnikami wg ściśle określonej kolejności lub znajdujących się w mieszaninie. (Barwienie metodą Gramma, Neissera, Ziehl-Neelsena),
- barwienie pozytywne – polega na zabarwieniu w preparacie komórek (dobrze wybarwiony obiekt na jasnym tle),
- barwienie negatywne – uniewidocznienie otoczenia (tło wybarwione, natomiast komórki jasne, niewybarwione). Metoda stosowana przede wszystkim do barwienia krętków i otoczek bakterii,
- barwienie przyżyciowe – działanie na nieutrwalony preparat żywych drobnoustrojów barwnikiem w dużym rozcieńczeniu, nie niszcząc komórek.

- barwienie utrwalone – barwienie nieżyjących drobnoustrojów, prowadzące do uszkodzenia komórek.

Barwniki – związki chem., zdolne do adsorbowania się na lub rozpuszczania się w barwionych substancjach, dając trwałe, barwne połączenia. W cząst. Tych związków wyróżniamy grupę chromoformową (barwną, grupy azo-, nitrozo-, azoksy-, itp.). i grupę auksochromową, zdolną do tworzenia soli z barwionym substratem.

Rodzaje barwników:
- kwaśne – często używane do barwienia tła preparatu, np. eozyna, fuksyna kwaśna, nigrozyna,
- zasadowe – najczęściej stosowane w roztworach alkoholowych lub wodnych, np. błękit metylenowy, fiolet krystaliczny, fiolet goryczkowy, fuksyna zasadowa.

BARWIENIE METODĄ GRAMA:
- zastosowanie: podział bakterii na Gram-dodatnie i Gram-ujemne,
- wykonanie rozmazu zawiesiny drobnoustrojów,
- utrwalenie w płomieniu palnika,
- barwienie: (wszystkie etapy barwienia przedziela się przemywaniem preparatu wodą)
a) r-r fioletu krystalicznego (2-3 min),
b) utrwalenie płynem Lugola (1,5-2 min),
c) odbarwienie etanolem (z dodatkiem acetonu, 30 sek.),
d) odbarwienie barwnikiem kontrastowym (np. safranina, 20 sek).
Drobnoustroje barwiące się na fioletowo są określane jako Gram-dodatnie, Gram-ujemne to natomiast te, które barwią się na różowy(czerwony)

Mechanizm:

1. Komórki bakteryjne, zarówno gramdodatnie, jak i gramujemne, zabarwiają się fioletem krystalicznym.

2. Dodanie płynu Lugola powoduje, że fiolet reaguje z jodem, w wyniku czego tworzą się stosunkowo duże kompleksy złożone z barwnika i jodu. Na tym etapie obydwa typy komórek mają zabarwienie fioletowe.

3. Płukanie w alkoholu powoduje, że w komórkach Gram-dodatnich następuje zmniejszenie pustej przestrzeni w wielowarstwowych ścianach komórkowych, mających wygląd wielu (ok. 50) nałożonych na siebie siatek. W rezultacie kompleksy fioletu krystalicznego z jodem nie mogą ulec wypłukaniu, co w przypadku 1–2 warstw u bakterii Gram-ujemnych nie jest przeszkodą i alkohol świetnie wypłukuje barwnik. Możliwe też, że kompleks fiolet-jod łączy się trwale z kompleksem rybonukleinianu magnezu (niedobór magnezu może powodować barwienie na czerwono bakterii zasadniczo Gram-dodatnich) i zasadowego białka, które są obecne w ścianie bakterii Gram-dodatnich w dużych ilościach^[1] lub bardziej ujemnie naładowana (inny punkt izoelektryczny) ściana Gram-dodatnich silniej wiąże zasadowy fiolet^[1].

4. Po zakończonym płukaniu komórki Gram-dodatnie są fioletowe, zaś Gram-ujemne – bezbarwne.

5. Dodatkowy barwnik (np. safranina, fuksyna) barwi komórki Gram-ujemne na różowo, nie zmieniając barwy komórek Gram-dodatnich.

BUDOWA ŚCIAN KOMÓRKOWYCH

Gram +	Gram -
- zbudowana z wielu warstw peptydoglukanu, który odwodniony etanolem zostaje uszczelniony, - alkohol powoduje wytrącanie się szkieletu cukrowego oraz denaturację peptydów, - efektem tego jest trwałe zamknięcie porów między warstwami mureiny i zatrzymanie barwnika w komórce. -barwią się na fioletowo (brązowe – dobarwiane)	- 1-3 warstw peptydoglukanu, (mureiny) - potraktowanie alkoholem tak cienkiej warstwy nie jest wystarczające by zamknąć pory komórkowe, -Ściana kom. jest cieńsza, zawiera mniej peptydoglikanu - barwnik więc zostaje wymywany, a komórka przybiera kolor różowy.