Mikroby praktyczny:

1. GRONKOWCE:

Diagnostyka:

1. badanie mikroskopowe
2. hodowla:

- rosną szybko na podłożach wzbogaconych w warunkach tlenowych (w beztlenowych też)

- zdolność do wzrostu w warunkach hamujących wzrost innych bakterii (7,5% NaCl, 40% żółć)

- agar z krwią – przeznaczony do izolacji gronkowców z materiałów nie skażonych inną florą

- przy skażeniu materiału innymi bakteriami zalecane podłoża wybiórcze (czynnik warunkujący wybiórczość: 7-10 % NaCl, polimyksyna, 40% żółć)

- agar z solą i mannitolem jest wybiórczy i różnicujący dla poszczególnych gat. Staphylococcus

3. identyfikacja:
- test na koagulazę – enzym wytwarzany przez S. aureus, który aktywuje trombinę powodując natychmiastowe ścinanie kropli osocza
Leczenie:
- leczenie empiryczne: penicylinazooporne penicyliny (oksacylina, flukloksacylina) lub I generacja cefalosporyn
- wankomycyna – leczenie zakażeń MRSA
- u uczulonych na beta-laktamy – cefalosporyny, erytromycyna, klindamycyna
- większość szczepów oporna na penicylinę
Różnicowanie gronkowców:

Cecha	S. aureus	S. epidermidis	S. saprophyticus
Kolor kolonii	Żółty lub biały	biały	Biały lub bladopopielaty
Hemoliza	+	+/-	-
Wydzielanie koagulazy	tak	nie	nie
Fermentacja mannitolu	tak	nie	tak
Wrażliwość na bacytracynę	wrażliwy	wrażliwy	oporny

Rodzaje oporności na antybiotyki beta-laktamowe:

a) oporność enzymatyczna – beta-laktamazy

b) oporność receptorowa – zmiany w strukturze PBP prowadzące do zmniejszenia lub utraty powinowactwa antybiotyków beta-laktamowych

PBP – białka będące miejscem docelowym dla penicylin i innych beta-laktamów (są to m.in. enzymy uczestniczące w budowie ściany komórkowej)

Badanie lekooporności gronkowców:

1. oznaczanie wytwarzana penicylinaz:

a) test cefinazowy:

- krążek z nitrocefiną

b) metoda dyfuzyjno-krążkowa:

- krążek z penicyliną (10 IU)

- w związku z wysokim odsetkiem szczepów wytwarzających penicylinazy (w niektórych ośrodkach nawet 90%) można pominąć rutynowe oznaczanie wrażliwości na penicylinę

2. określanie metycylinooporności:

a) metoda dyfuzyjno-krążkowa

- krążek z cefoksytyną (30 ug) lub krążek z oksacyliną (1 ug)

b) metoda przeglądowa z oksacyliną (dla S. aureus):

- podłoże MHA z oksacyliną w stężeniu 6 ug/ml i dodatkiem 4% NaCl

c) testy polegające na wykrywaniu białka PBP 2a - produktu genu mecA, warunkującego oporność na metycylinę

d) metody genetyczne – wykrywanie genu mecA – pozostają „złotym standardem”

3. identyfikacja i interpretacja kliniczna fenotypów oporności na linkosamidy, makrolidy i streptograminy B

a) metoda dwóch krążków:

- nakładamy krążki z erytromycyną i klindamycyną w odległości 15-26 mm od krawędzi krążków

4. badanie wrażliwości na glikopeptydy:

a) metoda dyfuzyjno-krążkowa (krążek z wankomycyną) oraz metoda przeglądowa z wankomycyną (BHIA z 6 ug/ml VA)

b) oznaczanie wartości MIC oraz metoda przeglądowa z wankomycyną (BHIA z 6 ug/ml VA)

c) metody referencyjne:
- metoda mikrorozcieńczeń w bulionie
- metoda rozcieńczeń w agarze
- Etest

MRSA:- gronkowiec złocisty oporny na metycylinę

MSSA:- gronkowiec złocisty wrażliwy na metycylinę

MRCNS:- oporny na metycylinę gronkowiec koagulazo-ujemny

MSCNS:- wrażliwy na metycylinę gronkowiec koagulazo-ujemny

HA-MRSA:- szczepy MRSA izolowane z zakażeń szpitalnych

CA-MRSA:- szczepy MRSA izolowane z zakażeń pozaszpitalnych

Metycylinooporność:

- szczepy gronkowców oporne na metycylinę (MRSA, MRSNS) są oporne in vivo na wszystkie antybiotyki beta-laktamowe (tj. penicyliny, penicyliny skojarzone z inhibitorami beta-laktamaz, cefalosporyny, karbapenemy).

CA-MRSA:

- nowym problemem diagnostycznym i epidemiologicznym jest pojawianie się szczepów MRSA w środowisku pozaszpitalnym czyli CA-MRSA

- szczepy te charakteryzują się heterogennym poziomem oporności na antybiotyki beta-laktamowe, co niesie z sobą ryzyko nierozpoznania tego mechanizmu w rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej a co za tym idzie – niepowodzeń terapeutycznych

- szczepy CA-MRSA poza opornością na antybiotyki beta-laktamowe związaną z metycylinoopornością, są wrażliwe na różne antybiotyki innego typu, podczas gdy szczepy HA-MRSA są zwykle wielolekooporne

- w przeciwieństwie do HA-MRSA, większość szczepów CA-MRSA posiada gen leukocydyny Panton-Valentine (PVL – Panton-Valentine leucocidin)

- PVL należy do cytotoksyn powodujących martwicę tkanek i lizę leukocytów

- obecność w genomie CA-MRSA genów PVL uznaje się za marker informujący nas, że mamy do czynienia ze szczepem pozaszpitalnym odmiennym od klonów szpitalnych!!

MRSA:

- dobrze zaadaptowane do przeżycia w warunkach szpitalnych, są bardzo łatwo przekazywane z pacjenta na pacjenta w obrębie oddziałów szpitalnych oraz pomiędzy szpitalami

- kolonizują osoby w wieku podeszłym oraz poważnie chore

- HaMRSA - Pol1 - najczęstszy

- HaMRSA - Pol2

Glikopeptydy - są skuteczne w leczeniu MRSA; zaburzają one syntezę ściany komórkowej bakterii

- wiążą się z warstwą peptydoglikanu a następnie swoiście z końcową amino-acylo-D-alanylo-D-alaniną rosnącego peptydoglikanu

Metycylinooporność:

- homogenna - wszystkie komórki są niewrażliwe

- heterogenna - 2/3 komórek jest niewrażliwych, ale reszta jest wrażliwa

VRSA:- oporny na wankomycynę S. aureus

- mechanizm oporności polega na wytwarzaniu zmienionych prekursorów peptydoglikanu (D-Ala-...)

VISA:- średnio wrażliwy na wankomycynę S. aureus

- polega na wiązaniu docelowego antybiotyku zanim osiągnie miejsce docelowego działania

hVISA:

- S. aureus średnio wrażliwy na wankomycynę, o heterogennej ekspresji oporności inaczej: S. aureus z obniżoną wrażliwością na wankomycynę

Zdarzają się pojedyncze przypadki VRSA u pacjentów z grup ryzyka (cukrzycą, niewydolnością nerek)

Nowe opcje terapeutyczne w leczeniu zalażeń o etiologii VRSA, VISA, VRSA :
- streptograminy (chinupristyna B, dalfopristyna A
- linezolid
- telitromycyna (ketolidy)
- tigecyklina (glicylcykliny – pochodne minocykliny)
- daptomycyna – nowy lek z grupy lipopeptydów, do stosowania parenteralnego

Wskazania:

- leczenie powikłanych zakażeń skóry i tkanek miękkich, bakteriemii i infekcyjnego zapalenia wsierdzia wywołanego przez Staphylococcus spp. i Streptococcus spp. z wyjątkiem S. pneumoniae!

Oksazolidynony:

- chemioterapeutyki

- przedstawiciele: linezolid, eprezolid

- działają bakteriostatycznie

- ich mechanizm działania polega na hamowaniu syntezy białka na bardzo wczesnym etapie (kompleks inicjatorowy translacji w rybosomach bakteryjnych)

Lipopeptydy, glikopeptydy, glikolipidy:

- powodują depolaryzację błony cytoplazmatycznej i ucieczkę jonów potasu

Identyfikacja i interpretacja kliniczna fenotypów oporności na linkosamidy, makrolidy i streptograminy B – schemat algorytmu:

1. Szczepy wrażliwe na erytromycynę mogą być:

a) wrażliwe na linkomycynę/klindamycynę – nie stanowią one wtedy dużego problemu klinicznego
b) oporne na linkomycynę i na klindamycynę:
- taką oporność warunkuje L-fenotyp, mechanizm związany z genem oporności lin(A)
- w zakażeniach szczepami z tego rodzaju opornością nie należy stosować linkomycyny i klindamycyny!!
- przy wyniku wskazującym na L-fenotyp zaleca się powtórzenia badania w celu wykluczenia błędu

2. Szczepy oporne na erytromycynę mogą być:
a) oporne na linkomycynę i klindamycynę:
- taki fenotyp oporności określamy jako MLS b konstytutywny!!
- mechanizm oporności związany jest z genem erm
- w takich przypadkach nie powinno się stosować żadnych makrolidów, linkozamidów i streptogramin z grupy B!!

b) wrażliwe na linkomycynę i klindamycynę ze spłaszczeniem strefy zahamowania wzrostu:
- taki fenotyp odporności określamy jako MLSb indkukcyjny!!
- mechanizm oporności również związany z genem erm
- tu również nie powinno się stosować żadnych makrolidów, linkozamidów ani streptogramin grupy B!!

c) wrażliwe na linkomycynę i klindamycynę przy braku spłaszczenia strefy zahamowania wzrostu:
- ten fenotyp odporności określamy jako MSb
- mechanizm związny jest z genem msr(A)
- w takich przypadkach nie powinno się stosować makrolidów 14- i 15-węglowych ani streptogramin grupy B

1. PACIORKOWCE

Typy hemolizy:

a) alfa-hemoliza - hemoliza niecałkowita, powoduje zielone zabarwienie hemoglobiny, dlatego paciorkowce tej grupy nazywane są zieleniejącymi
- większość paciorkowców tej grupy nie ma otoczek z wyjątkiem S. pneumoniae (który posiada 80 typów otoczkowych)

b) beta-hemoliza - hemoliza całkowita (pojawia się przezroczysta strefa na agarze)
- paciorkowce tej grupy odpowiedzialne są za większość chorób paciorkowcowych, chociaż nie wszystkie Streptococcus beta-hemolizujące są patogenne
- do beta-hemolizujących należą S. pyogenes i S. agalactiae!

c) gamma-hemoliza - inaczej brak hemolizy
- gamma-hemolizujące paciorkowce zwykle nie są chorobotwórcze

Tabela - różnicowanie paciorkowców beta-hemolizujących:

Gatunek	Grupa serologiczna	Wrażliwość na bacytracynę	Wrażliwość na ko-trimoksazol	Test CAMP	Rozkład hipuranu sodu	Test PYR
S. pyogenes	A	wrażliwe	oporne	-	-	+
S. agalactiae	B	oporne	oporne	+	+	-
S. equisimilis	C	oporne	wrażliwe	-	-	-
S. constelatus	F lub A	oporne	wrażliwe	-	-	-

Identyfikacja serologiczna:

- testy lateksowe (odczyn bierny odwrócony)
- w przypadku grup A i B określenie przynależności do grupy jest równoznaczne z identyfikacją gatunku (A - S. pyogenes, B - S. agalactiae)
- w przypadku innych grup przynależność gatunkowa określana jest przy użyciu testów biochemicznych
Leczenie S. pyogenes: penicylina, erytromycyna, cefalosporyny.

Lekowrażliwość paciorkowców grupy A:
- wrażliwe na: penicylina G (leczenie ok. 10 dni), u pacjentów uczulonych na penicylinę: erytromycyna lub cefalosporyny.
- celem leczenia jest nie wyleczenie pacjenta ze schorzenia tylko eradykacja bakterii!!

S. pyogenes - zakażenia szpitalne:
- sporadycznie spotykane na oddziałach położniczych i poporodowych (gorączka połogowa) oraz noworodkowych (zakażenia pępka)

CAMP - test wykrywający S. agalactiae (GBS)

Test CAMP:

- służy do wykrywania GBS (Streptococcus agalactiae)

- test wykorzystuje fakt, że GBS produkuje pewien rozpuszczalny czynnik (czynnik CAMP), który wspólnie z beta-lizyną (hemolizyną) produkowaną przez gronkowca złocistego powoduje całkowitą lizę erytrocytów w agarze.

Poniżej najbardziej popularny schemat testu CAMP (wynik pozytywny w górnej części):

Objaśnienia do krążka przedstawionego na zdjęciu:

• najdłuższa linia rozciągająca się przez całą średnicę krążka – S. aureus (źródło beta-lizyny)

Krótsze linie, prostopadłe do linii S. aureus – badane szczepy paciorkowców; w powyższym przykładzie są to:

• górna linia prostopadła do linii S. aureus – S. agalactiae

• dolna linia prostopadła do linii S. aureus – S. pyogenes

Na dodatni wynik wskazuje obecne w górnej linii przejaśnienie w kształcie grota strzałki – wniosek: szczep paciorkowca wysiany w górnej linii prostopadłej do linii S. aureus należy do S. agalactiae!!

Przejaśnienie w kształcie grota strzałki powstaje wskutek nasilonej lizy krwinek obecnych w agarze, za którą odpowiada czynnik uwalniany przez S. agalactiae „współpracujący” z beta-lizynami (hemolizynami) gronkowca.

Nazwa testu CAMP pochodzi od pierwszych liter nazwisk jego twórców (Christie, Atkinson, Munch Petersen)

S. Pneumoniae

Diagnostyka:
a) materiał:- krew, plwocina, punktaty zatok, wymazy z tylnej ściany gardła, PMR

b) hodowla:
- najlepiej rośnie przy podwyższonym stężeniu dwutlenku węgla
- szybko rośnie na agarze z krwią (który zawiera katalazę i pozwala na rozwój w warunkach tlenowych)
- kolonie są gładkie lub szorstkie w zależności od obecności otoczki

c) identyfikacja:
- wywołuje alfa-hemolizę,
- nie wytwarza katalazy
- wrażliwy na optochinę -> test wrażliwości na optochinę (inne alfa-hemolizujące nie są przez nią hamowane)
- S. pneumoniae rozpuszcza się w żółci - inne alfa-hemolizujące nie!
- testy serologiczne w tym reakcja pęcznienia otoczek (pęcznienie w następstwie związania przez otoczkę specyficznego przeciwciała pozwala na identyfikację serotypu)

Leczenie S. pneumoniae:
- zwykle odpowiada na penicyliny
- poważne zakażenia i szczepy oporne na penicylinę - wstępnie leczymy cefalosporynami III generacji
- wankomycyna stosowana w leczeniu zakażeń szczepami wysoce opornymi

Oporność S. pneumoniae na penicylinę:

a) szybkie narastanie oporności na penicylinę, której zwykle towarzyszy oporność na antybiotyki (chemioterapeutyki) innego rodzaju zwłaszcza:

- tetracykliny, makrolidy, chloramfenikol i ko-trimoksazo
b) jest to oporność na penicylinę typu receptorowego związana ze zmianami w białku PB
c) w zależności od rodzaju zmiany wyróżniamy wzory oporności:

1. PBP 1a, 2b, 2x - wysoka oporność na penicylinę i wszystkie cefalosporyny

2. PBP 1a, PBP 2x - wrażliwości bądź średnia wrażliwość na penicylinę, oporność na wszystkie cefalosporyny

3. PBP 2b - średnia wrażliwość na penicylinę, wrażliwość na cefalosporyny

Enterococci

Różnicowanie i identyfikacja:
a) nie wolno wydawać wyniku Enterococcus sp.!
b) różnicowanie do gatunku można przeprowadzić przy użyciu zestawu ID 32 Strep
c) w przypadku wątpliwości należy przeprowadzić testy wymienione w poniższej tabelce:

Gatunek	Ruch	Wzrost na podłożu TSA	Wzrost na podłożu TTA (z tellurynem potasu)	Krążki diagnostyczne TF
E. faecalis	-	biały	normalny	Równomierny wzrost na linii posiewu, kolor od różowego do ciemno-fioletowego
E. faecium	-	biały	metaliczny połysk	Brak zabarwienia kolonii
E. gallinarum	+	biały	normalny
E. casseiflavus	+	cytrynowo-żółty	normalny

Oporność enterokoków:

1. naturalna:
- cefalosporyny, linkozamidy, ko-trimoksazol
- niskie stężenia aminoglikozydów
-> tą naturalną oporność można przełamać stosując połączenie aminoglikozydu z beta-laktamem

2. nabyta:
- oporność na wysokie stężenia aminoglikozydów (HLAR)
- oporność na glikopeptydy (teikoplanina, wankomycyna)
- geny oporności VanA, VanB, VanC, VanD, VanE
- oporność na penicylinę G
- wytwarzanie beta-laktamazy (E. faecalis)
- nadprodukcja białka PBP o niskim powinowactwie do antybiotyku (E. faecium)

Oporność Enterokoków na wysokie stężenia aminoglikozydów (oznaczanie HLAR):

1. oznaczanie metodą krążkowo-dyfuzyjną:
- krążki z dużym stężeniem gentamycyny (Ge-120 ug) i streptomycyną (S-300 ug)
- oporność na takie stężenia tych dwóch antybiotyków określamy mianem HLAR
- oporność na gentamycynę oznacza oporność na wszystkie aminoglikozydy, nie zawsze jednak oznacza pełną oporność na streptomycynę (inny mechanizm)

2. szczepy oporne na gentamycynę ale wrażliwce na streptomycynę możemy leczyć streptomycyną w połączeniu z beta-laktamami (penicylina, ampicylina) oraz glikopeptydami!!

3. szczepy HLAR najczęściej są wrażliwe na inne antybiotyki: penicylinę, wankomycynę, teikoplaninę, ale mogą też wytwarzać beta-laktamazę co czyni je niewrażliwymi na beta-laktamy

Oporność enterokoków na glikopeptydy:

- naturalna odporność na wankomycynę w mechanizmie VanC występuje u niechorobotwórczych enterokoków
- zmiana miejsca receptorowego - zmiana drugiego aminokwasu w dipeptydzie (normalnie składa się on z: D-Ala-D-Ala)

3. Prątki, Listeria, błonica, różyca

1. prątki

Diagnostyka:

Pobieranie i transport materiałów do badania w kierunku prątka gruźlicy:

a) Materiały bogatoprątkowe
- plwocina - najczęściej pobierany materiał w gruźlicy (gdy chory odkrztusza oczywiście)

- powinna być dobrze odkrztuszona, rano, po uprzednim przepłukaniu jamy ustnej gotowaną wodą, do jałowego słoiczka z ciemnego szkła

- pobierana w dostatecznej ilości (min 10 ml)

b) materiały skąpoprątkowe
- popłuczyny żołądkow
- połuczyny oskrzelow
- wymazy krtaniowe

c) w przypadku gruźlicy pozapłucnej
- PM
- moc
- wycinki skór
- krew miesiączkow
- płyny wysiękowe i punktaty z opłucnej, otrzewnej i stawów

Diagnostyka mikrobiologiczna
- wszystkie materiały z wyjątkiem tych fizjologicznie jałowych (np. PMR) należy poddać dekontaminacji w celu usunięcia pozostałej flory oraz zagęszczeniu

Zasada homogenizacji materiału:

a) materiał od chorego wraz z równą objętością N-acetylocysteiny-NaOH-cytrynianu sodu:
- inkubować w temperaturze 37 C przez 20 min
- dodać 20 ml jałowej wody
- wirować 3000 obr/min
- osad zawiesić w ok. 2 ml buforu fosforanowego, jałowego 0,9% NaCl lub jałowej wody

Otrzymany materiał poddaje się badaniu:

a) metodą bakterioskopową - preparat bezpośredni, zagęszczony, barwiony metodą Ziehl-Neelsena
b) posiew na 2 podłoża Lowensteina-Jensena - okres obserwacji: 4-12 tyg.

Podłoże Lowensteina-Jensena:

1. pożywka Lowensteina-Jensena z glicerolem, bez zieleni malachitowej służy do identyfikacji ludzkich prątków gruźlicy
2. pożywka stosowana jest w teście niacynowym będącym metodą pomocniczą służącą do identyfikacji ludzkich prątków gruźlicy
3. pożywka ma postać skosu o zabarwieniu żółtym
4. otrzymywana jest z masy jajowej połączonej z wodnym roztworem soli i glicerolem
5. pożywki produkowane są w szczelnie zamkniętych probówkach

Szybka diagnostyka materiałów klinicznych w kierunku prątków gruźlicy:

- nowe szybkie systemy hodowli prątków kwasoopornych (nazwy handlowe, np. MB Redox, Sepil-Chek AFB)

Techniki biologii molekularnej:

a) Metody genetyczne - wykrywanie kwasów nukleinowych:
- hybrydyzacja z sondami genetycznymi (znakowane chemicznie lub radioaktywnie,
dostępne dla: M. tuberculosis i prątków niegruźliczych)
- PCR - pozwala na wykrycie prątkowego DNA bezpośrednio w materiale
- RFLP/DNA fingerprinting

Wykrywanie kwasów mykolowych - metoda HPLC (cieczowa chromatografia wysokociśnieniowa)

Oznaczanie lekowrażliwości:

- do podłoża Lowensteina-Jensena dodaje się izoniazyd, streptomycynę, rifampicynę, etambutol i inne

- ocenę wrażliwości badanego szczepu na leki tuberkulostatyczne przeprowadza się porównując wzrost na podłożach z określonymi stężeniami leków ze wzrostem na podłożach kontrolnych

Leczenie:

- coraz częściej pojawiają się prątki oporne na leki, co stanowi jeden z głównych problemów w leczeniu gruźlicy
- w 1994 WHO wspólnie z Międzynarodową Unią Przeciwgruźliczą rozpoczęło ewidencję badań epiemiologicznych nad częstośćią występowania gruźlicy lekoopornej
- Polska przystąpiła do programu w 1997 r. i na podstawie wyników badń została zaliczona do krajów o niskim odsetku gruźlicy lekoopornej u chorych nowowykrytych (3,6%) jak i leczonych (17%)

WHO wyróżnia:
- lekooporność pierwotną występującą u chorych nigdy nie leczonych lub u chorych, u których włączono leczenie, ale nie trwało ono dłużej niż 1 miesiąc
- lekooporność nabytą prątków gruźlicy wyhodowanych od chorych już wcześniej leczonych; Oporność ta dotyczy dwóch najważniejszych leków przeciwgruźliczych: izoniazydu i ryfampicyny.

Szczepienia przeciw gruźlicy:

- szczepionka BCG - zawiera żywy atenuowany (odzjadliwiony) szczep prątka bydlęcego
- jednorazowe szczepienie BCG - tylko u noworodków
- szczepienie to jest skuteczne w wieku dziecięcym i zapobiega jedynie ciężkim, pozapłucnym zakażeniom gruźliczym (przede wszystkim gruźliczemu ZOMR w okresie noworodkowym)

-> szczepienie przeciw gruźlicy w przypadku noworodków urodzonych przedwcześnie wykonuje się po osiągnięciu przez nie masy ciała powyżej 2000 g. Odstępuje się od oceny wielkości blizny poszczepiennej oraz obowiązkowej rewakcynacji dzieci i młodzieży. Z tego względu w 12 miesiącu życia konieczna jest kontrola wykonania szczepienia przeciw gruźlicy przy urodzeniu na podstawie dokumentacji medycznej pacjenta. Dzieci które nie były szczepione po urodzeniu powinny otrzymać szczepionkę do ukończenia 1 roku życia.

-> szczepienie BCG nie zapobiega gruźlicy płucnej u nastolatków ani u osób dorosłych

b) maczugowiec błonicy

Diagnostyka:

- diagnostyka laboratoryjna prowadzona jest w celu potwierdzenia diagnozy klinicznej lub w celach epidemiologicznych

- wymazy (z gardła, nosa, ucha) są posiewane na podłoże Loefflera, bardziej specyficzne podłoże Clauberga oraz na agar z krwią

- na agarze z krwią oceniana jest obecność hemolizy, co pozwala ocenić zjadliwość szczepów (na tym podłożu wyrastają też inne podłoża, w tym flora fizjologiczna, więc jego zastosowanie jest ograniczone)

- po wyhodowaniu kolonii należy ocenić toksyczność bakterii za pomocą testu Eleka

Leczenie:

- leczenie swoiste polega na podaniu surowicy (antytoksyny - surowica przeciwbłonicza obcogatunkowa) w celu jej zablokowania; ilość antytoksyny zależy od ciężkości i dnia choroby

- zachodzi konieczność wykonania próby uczuleniowej

- w przypadku dodatniego wyniku reakcji uczuleniowej należy zastosować odczulanie

- leczenie antybiotykami (erytromycyna, penicylina) ma znaczenie drugorzędne; kurację antybiotykową stosuje się tylko przy równoczesnym występowaniu innego zakażenia gardła (np. Streptococcus)

- w błonicy krtani oprócz podania surowicy konieczna jest też intubacja lub tracheotomia - konieczne jest leczenie szpitalne

- zgon następuje szybko, jeśli surowica nie zostanie podana

Di-Per-Te:

Skojarzona szczepionka przeciwko
- błonicy (Diphtheria)
- krztuścowi (Pertussis)
- tężcowi (Tetanus)

Jej składowe to:
- anatoksyna błonicza
- zabite, otoczkowe bakterie B. pertussis
- anatoksyna tężcowa

Szczepionka bez składnika krztuścowego oznaczana jest DiTe.

4. Bakterie kapnofilne, mikroaerofilne, badanie PMR

1. H. Influenza

Podłoża:

- agar czekoladowy - krew dodaje się do płynnego agaru w temp. 80 C i utrzymuje w temp. 50 C przez 15 minut
- agar krwawy z wysianym S. aureus - alfa-hemolizyny produkowane przez S. aureus powodują lizę krwinek i uwolnienie NAD, który H. Influenzae wykorzystuje do wzrostu - jest to zjawisko satelityzmu

Diagnostyka:
- metoda krążkowa (krążki BVX, BV, BX)
Szybki test biochemiczny - API NH (Neisseria - Haemophilus)
Badanie lekowrażliwości – test cefinazowy (wykrywanie beta-laktamaz)

Leczenie:
- ampicylina, amoksycylina
- cefalosporyna III generacji
- chloramfenikol

b) brucella

Rozpoznanie - serologia:

- przeciwciała IgM - narastają w pierwszym tygodniu ostrej choroby osiągając szczyt w 3 miesiącu jej trwania; mogą być obecne również w fazie przewlekłej (u niewielkiego procenta chorych nawet do 2 lat!!)

- przeciwciała IgG - zaczynają rosnąć ok. 3 tygodnia osiągając szczyt po 6-8 tygodniach, w fazie przewlekłej pozostają w wysokich mianach

- przeciwciała IgA - ich stężenie zmienia się równolegle z IgG

Rozpoznanie - testy:
- odczyn Wrighta
- OWD
- ELISA
- IF pośrednia
- odczyn antyglobulinowy Coombsa
- OHB - odczyn hemaglutynacji biernej

(2 ostatnie szczególnie przydatne do wykrywania przewlekłej brucellozy)

Szczepionka:
-> osoby narażone na kontakt z chorobą mogą być zaszczepione następującymi szczepionkami:
- szczepionka atenuowana
- szczepionka z frakcji antygenowych

Leczenie:
- tetracyklina

c) Neisseria

Leczenie ostrej posocznicy meningokokowej - powinno być natychmiastowe!!

- jak najszybsza antybiotykoterapia po pobraniu odpowiedniego materiału (krew, PMR, płyn stawowy, materiał wybroczynowy)

- podanie właściwego antybiotyku w ciągu 0,5-1 h!

- szczepy N. meningitidis są wrażliwe na penicylinę G!

- po 24 h ryzyko zgonu wynosi 40%

Chemioprofilaktyka:

• zalecana dla osób, które przez 7 dni poprzedzających zachorowanie miały kontakt z chorą osobą

• ceftriakson (pojedyncza dawka domięśniowo), ciprofloksacyna (jednorazowo doustnie) lub rifampicyna (doustnie przez 2 dni)

Szczepionka przeciwko meningokokom grupy C:

a) Neis-Vac-C:

- zawiera polisacharyd otoczki (de-O-acetylowy) N. meningitidis grupy C sprzężony z anatoksyną tężcową adsorbowaną na wodorotlenku glinu

- jest zalecana dla młodszych dzieci

b) szczepionka otrzymana z otoczek serotypów A, C, W-135 oraz Y czyli 4-walentna, niekoniugowana, przeznaczona dla dzieci powyżej 2 roku życia, młodzieży i dorosłych

c) brak dotąd skutecznej szczepionki na meningokoki grupy B!!

d) szczepionka przeciwko grupie C zabezpiecza z 50% skutecznością! odporność utrzymuje się przez 9 lat

Grupy ryzyka wśród dorosłych - pensjonariusze zakładów dziennej opieki, skoszarowane wojsko.

d) Campylobacter

Materiały do badań:
- kał - na podłożu wybiórczym, inkubacja przez 3 dni
- krew - podłoża rutynowo stosowane
- optymalne warunki do wzrostu: 5% O2 i 10% CO2, temperatura 42 C dla ⁰C. jejuni, 35 ⁰C dla C. fetus

Leczenie:

- C. jejuni - erytromycyna, ciprofloksacyna
- C. fetus – aminoglikozyd (lub imipenem)

e) H.pylori

Diagnostyka H. pylori:

a) metody inwazyjne polegające na ocenie błony śluzowej pobranej podczas gastroskopii:
- test ureazowy - CLO-test - test wykrywający ureazę w próbce z gastroskopii (uwaga: enzym ten posiada też Proteus)
- ocena histopatologiczna

- badanie bakteriologiczne:
-> posiew na podłoża: agar z krwią baranią oraz czekoladowy
-> inkubacja trwa 6 dni lub dłużej w temperaturze 37⁰ C i warunkach mikroaerofilnych

Identyfikacja:
-> morfologia kolonii i typowy wygląd komórek w preparacie barwionym metodą Grama
-> dodatni wynik testów na: katalazę i oksydazę oraz urazę!!!
Oznaczenie lekowrażliwości E-testem, w którym badamy wrażliwość na 5 leków

- metody genetyczne - obecność genów warunkujących zjadliwość (CagA, VacA)

b) metody nieinwazyjne:

• test oddechowy: polega na wypiciu roztworu mocznika znakowanego izotopami węgla (C13, C14) i pomiarze zawartości tych izotopów w wydychanym dwutlenku węgla (wydychany CO₂ wiązany jest w naczyniu pomiarowym, następnie dodaje się do niego płynu scyntylacyjnego, po czym dokonuje odczytu na podstawie emisji cząstek beta)

• nowy test wykrywający antygen H. pylori w kale

Leczenie - trwa 14 dni, podaje się:
- jeden z inhibitorów pompy protonowej
- 2 antybiotyki spośród następującej grupy: amoksycylina, klarytromycyna, tetracyklina, metronidazol
- często zdarzają się szczepy oporne na klarytromycynę i metronidazol!!

f) borrelia

Leczenie:

- amoksycylina, doksycyklina, cefuroksym lub azytromycyna

Badanie PMR oraz zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych

Schemat badania PMR:

a) płyn mózgowo-rdzeniowy wirujemy przez 15 min z prędkością 1500 obr/min

• otrzymujemy w ten sposób osad i supernatant

b) otrzymany drogą wirowania supernatant posłuży nam do testów aglutynacji lateksowej

c) otrzymany drogą wirowania osad posłuży do wykonania:

• preparatu bezpośredniego barwionego metodą Grama

• posiewu na 3 podłoża:

  • agar krwawy - inkubacja w temp. 37⁰C, w warunkach wzbogaconych 5-10% CO₂

  • agar czekoladowy - inkubacja w temp. 37⁰C, również w atmosferze 5-10% CO₂

  • agar krwawy – inkubacja w temp. 37⁰C w warunkach tlenowych

Etiologia zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych:

Wcześniaki, noworodki i niemowlęta do 2 miesiąca życia	Dzieci od 2 miesiąca do 5 roku życia	Osoby dorosłe
Streptococcus agalactiae (GBS), E. coli (K1), Listeria monocytogenes, Enterococcus	Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae typu B, Streptococcus pneumoniae	Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis
Do zakażenia dochodzi najczęściej podczas porodu lub w czasie pobytu w szpitalu jako tzw. zakażenie szpitalne	Zakażenia rozwijają się drogą krwionośną z nosogardzieli lub bezpośrednio przez ciągłość z ogniska	Wrotami zakażenia jest zwykle nosogardziel

Charakterystyka płynu mózgowo-rdzeniowego w zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych w zależności od jego etiologii:

Badana cecha	Typ zapalenia
	Bakteryjne
Leukocytoza	Segmentowane (wielojądrzaste), polimorficzne = neutrofile
Liczba komórek	Od kilkuset do 60 tys. lub więcej (500-20 000)
Stężenie glukozy	Bardzo niskie: 0,28-1,1 mmol/l (<5-20 mg%)
Stężenie białka	Podwyższone (100-500 mg%, czasem >1000)
Preparat barwiony	Zwykle widoczne bakterie (Gram)

Normy dla składników PMR (dla dorosłych! Dla dzieci obowiązują inne wartości):

• kolor, przejrzystość: bezbarwny, wodojasny, klarowny

• leukocyty: prawidłowo do 5 białych krwinek (jednojądrowych) w 1 mm³ (u dzieci do 20/mm³)

• białko: 15-45 mg/dl (=15-45 mg%)

• glukoza: 50-80 mg/dl (=50-80 mg%) - ok. 2/3 stężenia w surowicy

4. Układ pokarmowy

1. Salmonella

Materiałem do badań na obecność pałeczek może być:
- krew (1 tydzień szczególnie)
- kał – 2-3 tydzień (pałeczki z żółcią dostają się do jelita)
- mocz
- szpik kostny

Diagnostyka duru – w dalszej części opracowania.

Leczenie duru:

• ampicylina, ko-trimoksazol (trimetoprim-sulfametoksazol), ciprofloksacyna

• chloramfenikol był tradycyjnie lekiem z wyboru

• likwidowanie nosicielstwa: chinolony (niegdyś ampicylina)

1. Shigella

Diagnostyka:

• materiałem jest kał i wymazy odbytnicze z owrzodzeń śluzówki pobrane podczas sigmoideoskopii

• barwienie błękitem metylenowym leukocytów w kale – wskazuje na inwazję błony śluzowej, ale nieswoiste

• test Sereny'ego – kropla zawiesiny inwazyjnego szczepu nakładana na rogówkę świnki morskiej lub królika – pojawienie się ciężkiego zapalenia wskazuje na inwazyjne właściwości szczepu

Leczenie:

- chinolony lub ko-trimoksazol

c) E. coli

Szczepy E. coli wywołujące biegunki:

a) EPEC:

• szczepy enteropatogenne

• wywołuje biegunkę ze śluzem, bez krwi, najczęściej u dzieci do 2 r.ż., z gorączką

• zakażenia u dorosłych zdarzają się sporadycznie

• szczepy te ściśle przylegają do powierzchni komórek niszcząc mikrokosmki bez jawnej inwazji

b) ETEC:

• szczepy enterotoksyczne

• wywołują biegunkę podróżnych, bezkrwawą, wodnistą, z wymiotami i wysoką gorączką

• kolonizują jelitu dzięku posiadanym CFA-I oraz CFA-II

• nadmierne wydzielanie wody i elektrolitów prowadzące do biegunki spowodowane jest przez enterotoksyny: ST i/lub LT

c) EIEC:

• szczepy enteroinwazyjne

• powoduje krwawą biegunkę przypominającą czerwonkę (przypominają Shigella, ale nie wydzielają toksyny)

d) EHEC, VTEC O157:

• szczepy enterokrwotoczne

• powoduje krwotoczne zapalenie jelita grubego, zespół hemolityczno-mocznicowy (ostra niewydolność nerek, trombocytopenia i mikroangiopatyczna niedokrwistość hemolityczna) oraz zakrzepową plamicę małopłytkową

• najważniejszą grupą serologiczną jest tu O157

• serotyp O157:H7 jest przyczyną najgroźniejszych form choroby, wytwarza toksynę podobną do toksyny Shiga, określaną jako verotoksyna (verocytotoksyna – ponieważ jest cytotoksyczna w stosunku do hodowli komórek linii Vero)

e) EaggEC:

• szczepy enteroagregujące

• wywołują biegunkę bez krwi i leukocytów

• posiadają specjalny typ fimbrii pozwalający im przyczepiać się do śluzówki jelita

Leczenie zakażenia E. coli:

- antybiotykoterapia nie jest zalecana, ponieważ powoduje wzrost uwalniania toksyn

- nie zaleca się też podawania środków zmniejszających motorykę przewodu pokarmowego

- zaleca się tylko leczenie objawowe (płyny podawane dożylnie, nie podawać do ustnie, ponieważ podane w ten sposób mogą nasilać bóle brzucha)

Diagnostyka duru brzusznego:

Materiałem do badań na obecność pałeczek duru brzusznego może być
- krew - szczególnie 1 tydzień choroby
- kał – 2-3 tydzień (pałeczki z żółcią dostają się do jelita)
- mocz
- szpik kostny
- żółć

Diagnostyka serologiczna duru brzusznego:
- odczyn Widala
- odczyn hemaglutynacji biernej z antygenem O S. typhi
- odczyn hemaglutynacji biernej z antygenem O jest ujemny w przypadku nosicielstwa
- odczyn hemaglutynacji biernej z antygenem AgVi S. typhi

Odczyn Widala:

• antygen O oraz H – zawiesiny bakteryjne do aglutynacji

• poszczególne rodzaje przeciwciał wykrywane w durze brzusznym:

  • anty-O – wykrywane ok. 8 dnia choroby (miano 1:100 tych przeciwciał jest podstawą do podejrzenie zakażenia)

  • anty-H – wykrywane ok. 10-12 dnia choroby (miano 1:50 jest podstawą do podejrzenia zakażenia)

W przypadku odczynu Widala wykonanego we wczesnym okresie choorby miana przeciwciał: antyH > 1:100 i antyO > 1:200 → wskazują na toczący się proces chorobowy!!

• w czasie choroby miana przeciwciał narastają równocześnie, przy czym miano przeciwciał anty-H jest zawsze wyższe

• antybiotyki w większym stopniu wpływają na miano przeciwciał anty-H

• z uwagi na podobieństwo antygenowe zwykle obecne są równocześnie aglutyniny dla S. typhi, S. enteridis oraz S. paratyphi Ai B (przy tym miano współaglutynacyjne jest niższe od miana odczynu głównego)

4. Chlamydie, mykoplazmy

1. Chlamydie

Diagnostyka zakażeń:

- hodowla na liniach komórkowych – kosztowna, ale najbardziej czuła i swoista! Hodowle barwi się następnie przeciwciałami fluoryzującymi lub jodyną (barwi C. trachomatis). Identyfikacja polega na wykryciu ciałek wtrętowych (jeśli barwią się p.ciałami przeciwko Chlamydia oraz przeciwko C. trachomatis → rozpoznanie: C. trachomatis; jeśli barwią się tylko p.ciałami przeciwko rodzajowi Chlamydia → rozponanie: C. psittaci lub C. pneumoniae)

- wykrywanie antygenów chlamydii bezpośrednio w badanym materiale np. metodą immunofluorescencji bezpośredniej, również testy EIA (wykrywające LPS)

- metody biologii molekularnej – hybrydyzacja DNA

b) mikoplazmy

Diagnostyka:

• hodowla - inkubacja do 3 tygodni

• serodiagnostyka - wykrywanie antygenów M. pneumoniae

• wykrywanie przeciwciał

• wykrywanie zimnych aglutynin (przy użyciu krwinek 0⁺)

• odczyny klasyczne

• poziom przeciwciał określany zwykle odczynem wiązania dopełniacza

• testy na swoiste przeciwciała IgM przeciwko M. pneumoniae

Leczenie:

• lekami z wyboru – tetracykliny i erytromycyna (albo lepiej: makrolidy drugiej generecji) oraz chinolony drugiej generacji

• leki skracają czas trwania choroby

• beta-laktamy są nieskuteczne (brak ściany komórkowej)

Mykoplazmy urogenitalne mogą być przyczyną:

- NGU - nierzeżączkowe zapalenie cewki moczowej

- PID - zapalenie narządów miednicy małej

Diagnostyka zakażeń mykoplazmam urogenitalnymi:

- hodowla

- metody biologii molekularnej

Leczenie zakażeń mykoplazmami urogenitalnymi:

• makrolidy, tetracykliny

4. Bakterie Gram Ujemne

Podłoże McConkeya:
- wybiórcze – uniemożliwia wzrost bakteriom Gram(+) -> ponieważ zawiera fiolet krystaliczny i sole źółciowe
- różnicujące -> laktoza (różnicowanie laktozo-ujemnych i laktozo-dodatnich)
Podłoże zawiera barwnik (zwykle obojętny barwnik czerwony) barwiący kolonie fermentujące laktozę na różowo.
W preparacie mikroskopowym wszystkie Gram(-) wyglądają identycznie!
Antygen somatyczny stanowią łańcuchy polisacharydowe.

Diagnostyka:
- posiew
- różnicowanie biochemiczne
- różnicowanie serologiczne – Salmonella, Shigella, szczepy E. coli
- serodiagnostyka – odczyn Widala

Mechanizmy oporności na antybiotyki:

1. ESBL:

- są to β-laktamazy o rozszerzonym spektrum działania (extended spectrum β-lactamases)

- warunkują oporność na penicyliny, cefalosporyny I-IV generacji (wyjątek - cefamycyny!) oraz na monobaktamy (aztreonam)

- są wrażliwe na inhibitory β-laktamaz, choć często efekt ten nie wystarcza, by szczepy były wrażliwe na połączenie beta-laktam+inhibitor

- geny tych enzymów znajdują się na plazmidach

- występują głównie u fermentujących, najczęściej u Klebsiella pneumoniae

- wywodzą się od β-laktamaz o szerokim spektrum, które dodatkowo poszerzone zostało o II-IV generację cefalosporyn (są wtórnymi beta-laktamazami)

- bakterie posiadające ESBL są wrażliwe na: karbapenemy, cefamycyny oraz na beta-laktamy w połączeniu z inhibitorami beta-laktamaz!

- należą do klasy AID

- powstały i powstają na nowo z beta-laktamaz o szerokim spektrum substratowym: TEM-1, TEM-2, SHV-1; w wyniku mutacji punktowych dochodzi do poszerzenia spektrum substratowego enzymów

- wspomniane enzymy (beta-laktamazy) o szerokim spektrum nadają oporność na aminopenicyliny, karboksypenicyliny, również (w dużych ilościach): ureidopenicyliny, cefalosporyny I generacji i cefoperazon; (w przypadku ESBL spektrum dodatkowo rozszerzone o II-IV generacja cefalosporyn)

- ok. 150 wariantów ESBL należących do 10 rodzin: TEM, SHV, CTX-M itd. - najczęściej występują u Klebsiella pneumoniae i E. coli

- poszczególne enzymy mają różną selektywność, aktywność -> preferencje substratowe

- poszczególne enzymy różnią się też aktywnością enzymatyczną i poziomem produkcji

- często szczepy produkujące ESBL pozostają wrażliwe in vivo na niektóre beta-laktamy należące do spektrum ESBL

- znane są gatunki Enterobacteriaceae u których gatunkowo specyficzne beta-laktamazy spełniają kryteria ESBL

Leczenie zakażeń szczepami produkującymi ESBL:

- nie stosować penicylin, cefalosporyn I-IV generacji (wyjątek - cefamycyny), monobaktamów

- w terapii stosujemy połączenia penicyliny z inhibitorami beta-laktamaz oraz antybiotyki innych grup (aminoglikozydy, fluorochinolony, karbapenemy)

Wykrywanie ESBL:

a) test dwóch krążków:

• krążki:

  • CAZ - ceftazidym – najlepszy wskaźnik ESBL wywodzących się z klas TEM i SHV, które są wobec niego bardzo aktywne

  • CTX - (cefotaxym – najlepszy wskaźnik ESBL wywodzących się z klasy CTX-M, które są wobec niego bardziej aktywne niż inne ESBL),

  • AMC (amoksycylina-klawulonian - w centrum)

Krążki ułożone są w odległości 2 cm (25-30 mm) od siebie.

• wynik odczytujemy jako dodatni (obecne ESBL), jeśli strefa zahamowania wzrostu wokół krążka z ceftazidymem (lub cefotaksymem) rozszerza się też na rejon wokół krążka z połączeniem penicyliny i inhibitora (AMC – amoksycylina+klawulonian) – synergizm inhibicyjny

Rys. - test dwóch krążków:

- po lewej cefotaxym (30 mg), w środku – co-amoxyclav (amoksycylina + klawulonian, 20+10 mg), po prawej cetazydym (30 mg), krążki oddalone od siebie o 25-30 mm

- wynik: wysiany szczep wytwarza ESBL z klasy TEM, która jest bardzo aktywna wobec ceftazydymu, dlatego wokół krążka z ceftazydymem (po prawej) jest tylko niewielka strefa zahamowania wzrostu (w zasadzie tylko tam gdzie penetrował klawulonian ze środkowego krążka)

b) metoda :krążków kombinowanych” (combined disc method):

• porównuje się strefę zahamowania wzrostu wokół krążka z połączeniem cefalosporyny i inhibitora beta-laktamaz (kwas klawulanowy; jest to tzw. krążek „kombinowany”) ze strefą zahamowania wzrostu wokół krążka z samą cefalosporyną (bez inhibitora)

Powyższe metody mają największe znaczenie w detekcji ESBL u E. coli oraz Klebsiella spp. Nie są one natomiast miarodajne dla Enterobacter, Citrobacter ani Serratia, które są wyposażone w indukowalne beta-laktamazy AmpC, które mogą zostać indukowane przez kwas klawulanowy i całkowicie zaburzyć wynik testu.

2. β-laktamazy AmpC:

- gatunkowo specyficzne, występują u szczepów: Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Morganella, niektóre szczepy E. coli

- enzymy o bardzo szerokim spektrum: warunkują oporność na: aminopenicyliny, ureidopenicyliny, piperazynopenicyliny, cefalosporyny I-III generacji, monobaktamy, cefalosporyny o szerokim spektrum działania (cefamycyny)

- są niewrażliwe na działanie inhibitorów β-laktamaz

- geny tych enzymów znajdują się na chromosomie bakteryjnym – genoforze

- istnieją mutanty konstytutywnie wytwarzające β-laktamazy AmpC – określane są mianem szczepów zdereprymowanych

- leczenie: imipenem, meropenem

3. MBL – metalo β-laktamazy czyli karpapenemazy:

- metalozależne – kofaktorem jest przede wszystkim cynk

- są elementem naturalnej oporności na antybiotyki u Stenotrophomonas maltophila

- u Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter oraz Enterobacteriaceae (Serratia, Shigella, Klebsiella, Citrobacter itd.) są elementem oporności nabytej

- występują głównie u pałeczek niefermentujących

Wykrywanie MBL:

- CAZ, kwas 2-merkaptopropionowy

- IMP, EDTA (imipenem + EDTA)

- E-test

Kwas 2-merkaptopropionowy i EDTA są inhibitorami MBL, dlatego:

- pojawia się strefa przejaśnienia wokół krążka z ceftazidimem lub imipenemem od strony krążka zawierającego inhibitor

4. inne mechanizmy oporności

- mutacje

- aktywny efflux

4. bakterie beztlenowe

Podłoża do hodowli beztlenowców:

PRAS - preredukowane, wyjałowione w warunkach beztlenowych podłoża

Brucella

Columbia

Schaedler

(0,6% lub 2% agar)

Podłoża wzbogacane krwią, heminą, witaminą K, żółtkiem.

Podłoża wybiórcze: antybiotyki, żółć itd.

- mogą być płynne, półpłynne lub stałe

- antybiotykiem różnicującym jest aminoglikozyd (nieaktywne wobec beztlenowców) lub gentamycyna

Materiał do badań w kierunku obecności bakterii beztlenowych:
- krew
- PMR
- ropa (pobrana drogą aspiracji bezpośredniej)
- fragmenty tkanek
- próbka z punkcji płucnej
- mocz (z punkcji nadłonowej)
- kał (tylko w kierunku Clostridium difficile lub ETBF - enterotoksynotwórczy B. subtilis)
- w kale znajduje się 10¹² beztlenowców; w jelicie znajduje się 1000 razy więcej bakterii beztlenowych niż tlenowych

Materiał nie nadający się do badań w kierunku beztlenowców:
- plwocina odkrztuszana
- próbki po bronchoskopii, (BAL – popłuczyny oskrelikowo-pęcherzykowe)
- próbki pobrane przez sklepienie pochwy
- mocz oddany

a) Clostridium

Odwrócony test CAMP do wykrywania Clostridium perfringens:

• służy do identyfikacji C. perfringens przy użyciu S. agalactiae!

• toksyny produkowane przez C. perfringens (głównie toksyna alfa) wspólnie z czynnikiem CAMP produkowanym przez GBS powoduję intensywną hemolizę widoczną jako sporej wielkości przejaśnienia w agarze z krwinkami (na poniższym zdjęciu przejaśnienia te mają formę półksiężyców)

• test nazywamy odwróconym, ponieważ badany drobnoustrój znajduje się tu w najdłuższej linii (na przebiegu średnicy krążka) w przeciwieństwie do testu CAMP wykrywającego S. agalactiae

Objaśnienia do powyższego krążka:

• w najdłuższej linii (leżącej w średnicy krążka) znajduje się C. perfringens

• w krótszych liniach, prostopadłych do średnicy znajduje się S. agalactiae

• rozległe przejaśnienia w formie półksiężyców świadczą o rozległej hemolizie zachodzącej dzięki synergii między działaniem toksyn hemolitycznych C. perfringens a czynnikiem CAMP produkowanym przez GBS → wynik testu dodatni (z uwagi na przejaśnienia), więc badanym ustrojem jest C. perfringens

Leczenie C. difficile:

• lekami z wyboru: metronidazol i wankomycyna - podawane pulsacyjnie (co 2-3 dni);

• w przypadku oporności skuteczność wykazują sinercid i linezolid

• nigdy nie dochodzi do pełnego wyleczenia, ponieważ zawsze przetrwają spory, dlatego może dochodzić do nawrotów zakażenia tym samym szczepem (jeśli lekiem zastosowanym najpierw był metronidazol w leczeniu nawrotu prawdopodobnie skuteczniejsza będzie wankomycyna)

BBE agar:

• podłoże agarowe z dodatkiem żółci i eskuliny oraz gentamycyny

• pozwala wykryć zhydrolizowaną eskulinę.

• uwolniony składnik reaguje z solami żelaza, w wyniku czego pojawia się łatwo wykrywalne czarne zabarwienie kolonii B. fragilis

Agar Schaedlera +5% krwinki barana:

• podłoże szczególnie przydatne do hodowli beztlenowców

• dodatek czynników wzrostowych, jak ekstrakt drożdżowy, hemina, witamina K₃ oraz dodatek krwinek barana pozwala na wzrost drobnoustrojów o wysokich wymaganiach pokarmowych

CCCA – Clostridium difficile agar:

• podłoże do hodowli C. difficile

• Columbia agar wzbogacony 5% krwią barana

• właściwości selekcyjne uzyskuje się przez wprowadzenie cykloseryny, cefoksytyny i amfoterycyny B

• wymienione zastosowane antybiotyki uniemożliwiają wzrost większości drobnoustrojów obecnych w kale (pałeczek jelitowych, paciorkowców, gronkowców, beztlenowców oraz drożdżaków)

4. Antybiotyki

Antybiotyki - podział:

1. naturalne:
- penicylina benzylowa
- glikopeptydy
- aminoglikozydy
- makrolidy
- cefalosporyny

2. półsyntetyczne:
- penicyliny półsyntetyczne
- cafalosporyny
- aminoglikozydy
- makrolidy

3. syntetyczne:
- aztreonam
- chloramfenikol

Chemioterapeutyki – syntetyczne
- chinolony
- sulfonamidy
- trimetoprim

Miejsca docelowego działania leków przeciwbakteryjnych:

1. sulfonamidy - zaburzają syntezę puryn w komórce bakteryjnej

2. antybiotyki beta-laktamowe (penicyliny, cefalosporyny, karbapenemy, monobaktamy) i glikopeptydy - zaburzają syntezę ściany komórkowej;

- beta-laktamy działają poprzez białko wiążące penicylinę - PBP, glikopeptydy hamują syntezę ściany komórkowej na etapie transportu substancji.

3. kolistyna, polimyksyna, amfoterycyna B - zaburzają strukturę błony komórkowej

4. Rifampicyna - hamuje aktywność polimerazy RNA

5. chinolony - blokują aktywność gyrazy DNA

6. Chloramfenikol, tetracykliny, aminoglikozydy i makrolidy - działają na polirybosomy bakteryjne

Miejsca docelowego działania leków przeciwbakteryjnych:
a) blokowanie syntezy ściany komórkowej:
- beta-laktamy,
- glikopeptydy

b) uszkadzanie błony cytoplazmatycznej:
- polimyksyny

c) blokowanie syntezy białka:
- chloramfenikol
- tetracykliny
- makrolidy
- aminoglikozydy
- kwas fusydowy

d) blokowanie syntezy DNA:
- ko-trimoksazol
- chinolony
- nitrofurany
- rifamycyny
- metronidazol

Ze względu na sposób działania wyróżniamy antybiotyki:

1. bakteriobójcze:
- beta-laktamy
- aminoglikozydy
- chinolony
- glikopeptydy
- ko-trimoksazol

2. bakteriostatyczne (stosować szczególnie wtedy, gdy bakterie produkują toksyny):
- makrolidy
- linkozamidy
- tetracykliny
- chloramfenikol
- trimetoprim, sulfonamidy

Podział antybiotyków w oparciu o skuteczność przeciwko określonym grupom drobnoustrojów:

1. Skuteczne przeciwko bakteriom Gram(+):
- penicylina G
- glikopeptydy
- linkozamidy
- makrolidy
- kwas fusydowy

2. Skuteczne przeciw bakteriom Gram(-):
- aztreonam

3. Skuteczne przeciw bakteriom zarówno Gram(+) jak i (-)
- penicyliny o szerokim spektrum działania
- cefalosporyny
- aminoglikozydy
- chinolony
- tetracykliny
- ko-trimoksazol

4. Skuteczne przeciwko bakteriom beztlenowym:
- linkozamidy
- metronidazol
- chloramfenikol
- penicyliny z inhibitorami beta-laktamaz
- cefoksytyna

5. Skuteczne przeciwko bakteriom atypowym:
- makrolidy
- tetracykliny
- rifampicyna
- ko-trimoksazol
- chinolony

MIC (minimum inhibitory concentration) - najmniejsze stężenie leku wyrażone w mg/l, określane w warunkach in vitro, hamujące wzrost bakterii przy określonej gęstości inokulum w określonym czasie.

MBC – minimalne stężenie leku wyrażone w mg/l, określone w warunkach in vitro, przy którym ginie 99,9% bakterii, przy określonej gęstości inokulum w określonym czasie.

Tolerancja – jest wynikiem braku aktywacji enzymów autolitycznych przez antybiotyk beta-laktamowy, który wykazuje spadek lub brak działania bakteriobójczego bez utraty działania hamującego (nie zmienia się wartość MIC!); przyjęta definicja tolerancji oznacza stosunek MBC/MIC większy lub równy od 32!

Zakres badań lekowrażliwości:

a) antybiogram podstawowy - obejmuje o antybiotyki stosowane jako leki pierwszego rzutu

- antybiogram podstawowy dla szczepów uzyskanych z moczu obejmuje antybiotyki stosowane jako leki pierwszego rzutu wobec szczepów izolowanych w zakażeniach układu moczowego

b) antybiogram rozszerzony - zawiera rozszerzoną listę antybiotyków stosowanych wobec drobnoustrojów (również dla szczepów izolowanych w zakażeniach układu moczowego) wieloopornych i/lub izolowanych w ciężkich zakażeniach.

E-test:

• pełna nazwa: Epsilometer test

• służy do oznaczania wartości MIC

• na krążek z agarem, na który wysiano bakterię nakładany jest nasączony antybiotykiem pasek z narysowaną skalą

• antybiotyk dyfunduje tworząc gradient stężenia w agarze (najczęściej agar MH - Muellera-Hintona)

• powstaje eliptyczna strefa zahamowania wzrostu

• punkt w którym granica strefy zahamowania wzrostu przetnie się z paskiem wyznacza wartość MIC dla badanego szczepu

Przykład E-testu (eliptyczne przejaśnienie – strefa zahamowania wzrostu):