Katedra biotechnologii i biologii molekularnej

Pracownia Biochemii

Magdalena koszałkowska biotechnologia II gr. 2 25 XI,02 XII 2009

Właściwości chemiczne węglowodanów:

Cel ćwiczenia:

1. Zbadanie obecności cukrów w r-rze za pomocą próby Molisha.

2. Rozróżnienie ketozy i aldozy za pomocą próby Seliwanowa.

3. Zbadanie właściwości redukcyjnych węglowodanów za pomocą próby redukcyjnej z błękitem metylowym.

4. Zbadanie właściwości redukcyjnych węglowodanów za pomocą próby Benedicta.

5. Zbadanie wpływu zasad na cukry za pomocą próby Moor’a.

6. Zbadannie skrobi za pomocą reakcji dla niej charakterystycznych.

7. Zbadanie hydrolizy skrobi pod wpływem kwasów.

Obserwacje, wyniki:

1. Próba Molisha:

Cukier	Barwa roztworu
Maltoza	Jasno fioletowy pierścień
Glukoza	Ciemno fioletowy pierścień

1. Próba Seliwanowa:

Cukier	Czas [min]	Barwa roztworu
Glukoza	0,5	Bezbarwna
Fruktoza	0,5	Czerwona
Sacharoza	0,5	Pomarańczowa

1. Próba redukcyjna z błękitem metylowym:

UKIER

Cukier	Barwa roztworu
Glukoza	Żółta
Sacharoza	Bez zmian
Maltoza	Żółta
Woda	B/z

1. Próba Moora:

Cukier	Barwa roztworu
Glukoza	Żółta
Maltoza	Żółta
Sacharoza	Bezbarwna

1. Próba Benedicta:

Cukier	Barwa roztworu	Osad	Stężenie przybliżone [mmol/L]
Woda	Niebieska	-	0
Glukoza 1.	Zielona	+	28
2.	Oliwkowa	++	56
3.	Pomarańczowa	+++	83
4.	Czerwona	++++	100
5.	Intensywnie czerwona	+++++	>100

1. Reakcja charakterystyczna na skrobię:

	Barwa roztworu
Skrobia Z jonem	Przed ogrzaniem
	Niebieski
Skrobia Z jodem i NaOH	Przed dodaniem HCl
	Żółtawy

1. Hydroliza kwasowa skrobi:

Glukoza	Czas [min]	Barwa roztworu	Osad
1.	2	Granatowa	-
2.	3	Fioletowa	-
3.	5	Fiołkowa	-
4.	8	Czerwona	-
5.	10	Pomarańczowa	-
6.	15	Bezbarwna	-
Glukoza z NaOH i błękitem metylowym
1.	2	Żółtawa	-
2.	3	Jasno pomarańczowa	-
3.	5	Pomarańczowa	-/+
4.	8	Ciemno pomarańczowa	+
5.	10	Jasno czerwona	++
6.	15	Czerwona	+++

Wnioski:

1. Oba użyte przez nas związki maltoza i glukoza dały wynik pozytywny w reakcji Molisha z α-naftolem. Oznacza to, że są one cukrami. Glukoza jest monosacharydem uległa szybciej dehydratacji. Gdyż jest ona heksozą została przekształcona w 5-hydroksymetylenofurfural. W połączeniu z α-naftolem daje ciemny czerwono fioletowy pierścień. Maltoza jest disacharydem zbudowanym z dwóch cząsteczek glukozy, dlatego reakcja dehydratacji zachodziła wolniej, gdy jest ona złożoną reakcją a poprzedza ja hydroliza wiązania α-1,4 glikozydowego łączącego cząsteczki glukozy w maltozie. Dlatego powstało mniej barwnego połączenia triarylometanowego z
   α-naftolem a kolor roztworu był jasno fioletowy. Reakcja jest przeprowadzana w środowisku kwaśnym (zakwaszenie H₂SO₄) aby forma aldehydowa cukru uległa odwodnieniu i przeszła w formę cykliczną, dzięki jonom wodorowym jest też możliwe rozbicie wiązania glikozydowego.

2. Glukoza dała wynik próby ujemny natomiast fruktoza i sacharoza dały wyniki dodatnie, co znaczy, że glukoza należy do aldoz natomiast fruktoza należy do ketoz. Sacharoza dała wynik dodatni, ponieważ jest disacharydem składającym się z cząsteczki glukozy i fruktozy, czyli aldozy i ketozy. Dlatego też barwa roztworu sacharozy jest pomarańczowa a nie czerwona, gdyż po pierwsze jest to disacharyd, który przed dehydratacją musi ulec hydrolizie oraz po hydrolizie powstaje mieszanina glukozy (aldozy) i fruktozy (ketozy).

Aldozy dają negatywny wynik reakcji, gdyż w tak krótkim czasie ogrzewania jak 30 s nie ulegają one odwodnieniu i przejściu w postać cykliczną gdyż zawierają grupę aldehydową i muszą być ogrzewanie co najmniej przez 15 minut. Ketozy, które posiadają grupę ketonową szybciej ulegają odwodnieniu i tworzą formy cykliczne dzięki czemu szybciej kondensują z rezorcyna.

Fruktoza jest heksozą, więc produktem dehydratacji jest 5-hydroksymetylenofurfural

1. Kolor przy glukozie i maltozie odbarwił się na żółto gdyż zaszła redukcja błękitu metylenowego. Dzieje się tak dlatego, że w cząsteczkach glukozy obecne są wolne grupy karbonylowe. Aby doprowadzić do redukcji konieczne jest występowanie cząsteczki cukru w formie pierścieniowej dlatego alkalizujemy środowisko reakcji. Zarówno sacharoza jak i maltoza są disacharydami lecz sacharoza nie posiada właściwości redukcyjnych, dlatego, że w tworzeniu wiązania glikozydowego tego dwucukru biorą udział hydroksyle pólacetalowe obu partnerów (grupy hydroksylowe przy obu anomerycznych atomach węgla). Gdy przy tworzeniu tego wiązania grupy hydroksylowe pochodzą z jednego składnika to taki disacharyd posiada właściwości redukcyjne- przykładem jest maltoza.

Po wstrząśnięciu kolor roztworu cukrów redukujących zmienia się na zielonkawo-niebieski i zależy od intensywności wstrząsania. Świadczy to, ze w obecności tlenu atmosferycznego błękit metylenowy ulega ponownemu utlenianiu.

1. Miedź ulega redukcji w roztworze glukozy ze stopnia utlenienia +2 do +1. W zależności od stężenia glukozy w roztworze przyjmuje on różne zabarwienia. Gdy stężenie to jest małe barwa odczynnika łączy się z barwą powstałej zawiesiny, która jest pomarańczowa i powstaje kolor zielony i oliwkowy. Kolor pomarańczowy i czerwony obserwujemy przy dużych stężeniach glukozy. Gdy pozostawimy probówki do opadnięcia osadu zauważymy czerwony nierozpuszczalny tlenek miedzi Cu₂O. Ilość tego osadu również rośnie wraz z stężeniem użytej glukozy. Dzięki tak szerokiej gamie kolorów jesteśmy w stanie określić stężenie użytego cukru. Szacunkowe stężenie użytej glukozy zostały dołączone do wyników.

Do tej próby aby zalkalizować środowisko używamy Na₂CO₃ gdyż pozwala on na otworzenie form pierścieniowych cukrów bez dużego wzrostu wartości pH, co powoduje, że próba ta jest swoista dla cukrów gdyż w takim pH kreatynina i kwas moczowy nie wykazują jeszcze właściwości redukujących.

1. Cukry takie jak glukoza i maltoza dały wynik dodatni, natomiast sacharoza ujemny. Dzieje się tak dlatego, że cukry, które mają właściwości redukcyjne ulegają enolizacji. Pierścień ulega otwarciu a grupa aldehydowa zostaje uwolniona i może reagować z wodorem sąsiedniej grupy alkoholowej. Dzięki temu w odczynie zasadowym występuje przejściowa forma en-diolowa, gdzie zanika asymetria przez C2 i dzięki temu może zajść przekształcenie heksoz np. w naszym doświadczeniu glukozy w mannozę i odwrotnie (przemiana epimeryczna) jak i również może dojść do przemiany izomerycznej aldozy w ketozę (tu glukozy w fruktozę). Dzieje się tak dlatego że zarówno fruktoza jak i mannoza różnią się od glukozy konfiguracja przy węglach C1,2. Wiązanie enolowe może się przemieszczać i ulegać rozerwaniu z cukrów mogą powstawać różne pochodne, mogą one też polimeryzować.

Przy tych reakcjach czuć było zapach karmelu, przypalonego cukru.

Sacharoza dała wynik ujemny, gdyż jako dwucukier nie redukujący ma ona wiązanie glikozydowe oporne na działanie zasad.

1. Cząsteczka skrobi składa się z dwóch homologów są nimi: amyloza i amylopektyna. W doświadczeniu po dodaniu do pierwszej próbówki roztworu jodu w KI otrzymaliśmy zabarwienie niebieskie co świadczy o dużym stężeniu amylozy. Aby możliwa była reakcja polisacharydu z jodem musi on posiadać konfigurację helisy (na jedną cząsteczkę jodu przypada jeden skręt) gdyż pozwala to na regularne ułożenie cząsteczki jodu. W przypadku gdy mamy do czynienia z wielocukrami o konfiguracji liniowej nie uzyskujemy charakterystycznego zabarwienia roztworu (nie powstaje kompleks z jodem). Charakterystyczna barwa jest związana z faktem iż drobiny jodu tworzą łańcuch wzdłuż którego mogą się poruszać elektrony to zjawisko powoduje pochłanianie fal świetlnych (powstaje charakterystyczna barwa). Pod wpływem podwyższonej temperatury kompleks ulega rozpadowi dlatego roztwór się odbarwia. W probówce nr 2 gdzie do skrobi dodamy został roztwór NaOH po wprowadzeniu jodu nie utworzył się charakterystyczne zabarwienie. Jest to spowodowane faktem że jod wykazuje większe powinowactwo do sodu iż do polisacharydu (w środowisku alkaicznym nie utworzył się kompleks z wielocukrem). Po zakwaszeniu środowiska tzn. po obniżeniu pH cząsteczki jodu odłączyły się od Na co w konsekwencji doprowadziło do powstania kompleksu o charakterystycznej barwie.

2. W obecności kwasów skrobia ulega stopniowej hydrolizie (rozkładowi) przez dekstryny do maltozy i niewielkiej zawartości glukozy. W pierwszym szeregu gdzie dodaliśmy roztwór jodu w KI otrzymaliśmy następujące wyniki: 1 próbówka kolor granatowy świadczy to o że mamy do w roztworze w głównej mierze znajduje się amyloza. W próbówce nr 2 otrzymaliśmy kolor fioletowy który informuje nas że w tym Momocie hydrolizy skrobi mamy do czynienia z amylodekstrynami. Próbówka nr 3 posiada roztwór o barwie pomarańczowej. Takie zabarwienie oznacza że w owym preparacie znajduje się kolejny produkt pośredni hydrolizy a dokładniej erytrodekstryna. W pozostałych próbówkach nr 4, 5 i 6 roztwór był bezbarwny dlatego że wielocukry w nim występujące posiadają konfiguracje liniową (szczegóły związane z łączeniem się jodu z węglowodanami zostały opisane we wniosku do ćwiczenia nr 6) mogą być nimi: achrodekstryny, maltozy a nawet sladowe ilości glukozy. Wnioskiem wynikającym z tej części ćwiczenia jest fakt że wraz ze wzrostem czasu przebywania w łaźni wodnej w temperaturze wrzenia hydroliza polisacharydów postępuje. W drugiej części ćwiczenia gdzie do próbówek dodaliśmy NaOH a następnie odczynnika Benedicta i Tyma razem zanurzyliśmy próbówki na 2 min w łaźni wodnej. Otrzymaliśmy następujące wyniki: w pierwszej próbówce kolor był pomarańczowy, w kolejnych próbówkach od 2-5 zabarwienie przybierało postać coraz ciemniejszego pomarańczowego odcieniu. W próbówce nr 6 roztwór przyjął czerwoną barwę. Istotnym faktem jest wytrącający się osad. W próbówce nr 1 brak osadu. W pozostałych jego ilość wzrastała wraz z czasem pobytu roztworu w łaźni wodnej (czas trwania hydrolizy). Największe stężenie zaobserwowaliśmy w próbówce nr 6. Z wyników otrzymanych w tym doświadczeniu wynika że skrobia nie posiada właściwości redukcyjnych, oraz to że właściwości redukcyjne cukrów wzrastają wraz z postępującą hydrolizą. Najbardziej redukcyjnymi są cząsteczki glukozy. Wytrącony osad oraz zabarwienie jest związane z zastosowaniem odczynnika Benedicta. Jest to spowodowane redukcją miedzi z Cu²⁺ do Cu⁺.

Dlatego że glukoza ulega łatwo redukcji co prowadzi do fermentacja a w skutkiem tego procesu było by psucie się owoców.