ĆWICZENIE NR 5: PODSTAWOWE METODY BADAWCZE STOSOWANE W BIOLOGII KOMÓRKI - metody izolowania frakcji subkomórkowych

Cel ćwiczenia:

Zapoznanie z podstawowymi technikami dezintegracji komórek oraz frakcjonowania uzyskanych składników subkomórkowych.

Wymagane wiadomości:

Sposoby dezintegracji komórek.

Budowa i zasada działania wirówki.

Rodzaje gradientu: ciągły; nieciągły.

Zagadnienia:

- techniki frakcjonowania składników komórkowych,

- homogenizacja - środowisko homogenizacji; składniki roztworu homogenizacyjnego;

warunki przebiegu procesu homogenizacji

- sposoby homogenizacji materiału biologicznego:

metody fizyczne - sonikacja; homogenizacja ostrzowa; homogenizacja ciśnieniowa; technika zamrażania i odmrażania

metody chemiczne - szok osmotyczny; rozpuszczalniki organiczne

- wirowanie - rozdział homogenatu na frakcje

wirowanie różnicowe

wirowanie w gradiencie gęstości

- rodzaje rotorów wirówki i ich zastosowanie

- obliczanie wartości siły odśrodkowej podczas wirowania

1. METODY IZOLOWANIA FRAKCJI SUBKOMÓRKOWYCH

Otrzymanie organelli komórkowych wymaga wstępnego rozerwania błon komórkowych i uwolnienia zawartości komórki. Pierwszą czynnością zmierzającą do uzyskania składników wewnątrzkomórkowych jest homogenizacja komórek bądź też całych tkanek.

Homogenizacja jest jedną z najczęściej używanych metod służących do dezintegracji tkanek miękkich. W zależności od rodzaju tkanki używa się różnych metod homogenizacji:

1. metody fizyczne - sonikacja; homogenizacja ostrzowa; homogenizacja ciśnieniowa;

technika zamrażania i odmrażania

1. metody chemiczne - szok osmotyczny; rozpuszczalniki organiczne

Proces homogenizacji przeprowadza się w odpowiednim środowisku, którym najczęściej jest izotoniczny roztwór sacharozy (0,25 mol·dm^-3) lub 0,9% NaCl. W czasie homogenizacji wskazane jest utrzymywanie obniżonej temperatury tzn. 0 – .

Rozdział składników homogenatu przeprowadza się poprzez wirowanie. Podczas wirowania wykorzystywane jest zjawisko sedymentacji cząstek o większej gęstości w roztworze o mniejszej gęstości. Siłą wspomagającą rozdział jest siła odśrodkowa działająca podczas wirowania. Za jednostkę siły odśrodkowej przyjmuje się przyspieszenie ziemskie (g) oraz określa się ile razy jest ona większa od siły przyciągania ziemskiego.

ZADANIA ĆWICZENIOWE

1. Obserwacja różnic w kierunku działania siły odśrodkowej w zależności od rodzaju zastosowanego rotora

W wirówkach stosuje się dwa typy rotorów tj. kątowe i horyzontalne, które różnią się miedzy innymi kierunkiem działania siły odśrodkowej, co w efekcie daje różne ułożenie osadu na dnie probówki.

Wykonanie:

Przygotować 4 szklane probówki wirówkowe. Do każdej z nich odmierzyć po 3 ml zawiesiny komórek drożdży S. cerevisiae. W komorze wirówki umieścić rotor wychyleniowy, wstawić dwie probówki tak, aby były umieszczone naprzeciw siebie, zamknąć wirówkę, uruchomić odpowiedni program wirowania: 2500obr/min, 5min. Po skończonym wirowaniu zaobserwować sposób ułożenia osadu komórek w probówkach. Następnie zmienić rotor na horyzontalny i umieścić w nim 2 pozostałe probówki, uruchomić odpowiedni program wirowania: 2500obr/min, 5min. Po skończonym wirowaniu zaobserwować sposób ułożenia osadu komórek w probówkach.

Porównać ułożenie osadu i wyjaśnić przyczynę zaobserwowanych różnic.

1. Określanie siły wirowania oraz prędkości obrotowej wirówki.

RCF – (Relative Centrifugal Force) – siła wirowania. Wskazuje ile razy siła działająca na rozdzielane podczas wirowania składniki jest większa od siły przyciągania ziemskiego (g)

RPM – (Rotations Par Minute) prędkość obrotowa wirówki. Wyrażana jest liczbą obrotów wirnika w ciągu minuty

RCF = r ^. (RPM / 1000)^{2 .} 11,18m/s²

RPM = [RCF / (r ^. 11,18m/s²)] ^. 1000

11,18m/s² – siła grawitacji

r – odległość między środkiem rotora wirówki a końcem probówki wyrażona w cm

Zadanie nr1:

Określić wartość RCF podczas wirowania w rotorze o promieniu równym 10cm przy RPM równym 2500obr./min.

Zadanie nr2:

Określić wartość RPM podczas wirowania w rotorze o promieniu równym 10cm jeśli siła działająca podczas wirowania wynosi 3500x g.

1. Rozdział składników homogenatu

Homogenat zawierający poszczególne składniki subkomórkowe może być frakcjonowany poprzez wirowanie różnicowe lub też wirowanie w gradiencie gęstości.

Wirowanie różnicowe

Wirowanie różnicowe jest to wirowanie ze wzrastającym przyspieszeniem. Jest to najczęściej stosowana metoda rozdzielania homogenatu na frakcje subkomórkowe (organelle).Zasada wirowania różnicowego opiera się na sedymentacji cząstek w polu siły odśrodkowej poprzez środowisko, w którym są zawieszone. Szybkość sedymentacji zależna jest od ich rozmiarów, kształtu czy też gęstości. Z uwagi na to, że współczynnik sedymentacji dla poszczególnych struktur komórkowych jest różny, możliwa jest łatwa ich separacja poprzez różnicowanie wartości siły odśrodkowej działającej na frakcjonowany homogenat. Pod wpływem małej wartości sił odśrodkowych działających przez krótki czas, sedymentują struktury największe i o największej gęstości np. jądra komórkowe zaś pod wpływem długiego działania siły odśrodkowej o dużej wartości sedymentują struktury najmniejsze
i o najmniejszej gęstości jak np. drobne struktury pęcherzykowe.

W przypadku rozdziału struktur o podobnych parametrach tzn. o podobnym współczynniku sedymentacji znacznie lepsze wyniki daje wirowanie w gradiencie gęstości.

Rys.14. Schemat rozdziału składników subkomórkowych na zasadzie wirowania różnicowego.

Wirowanie w gradiencie gęstości

Zasada wirowania w gradiencie gęstości polega na tym, że podczas wirowania cząstki wędrują tylko do tych pozycji, w których ich gęstość odpowiada gęstości środowiska i tam pozostają. Do wytworzenia gradientu gęstości (ciągłego lub nieciągłego) najczęściej używa się roztworu sacharozy, fikolu bądź chlorku cezu (CsCl). Wirowanie w gradiencie gęstości przeprowadza się jedynie w rotorach horyzontalnych z uwagi na kierunek działania siły odśrodkowej oraz sposób ułożenia warstw rozdzielanych cząstek.

Rys.15. Schemat rozdziału składników subkomórkowych na zasadzie wirowania w gradiencie ciągłym sacharozy.

3a. Technika przygotowania gradientu gęstości sacharozy

• skokowy (nieciągły) gradient gęstości sacharozy

Wykonanie:

Przygotować roztwory sacharozy o stężeniu 5%; 15%; 30% (dla lepszego wizualnego zobrazowania tworzenia gradientu do poszczególnych roztworów można dodać niewielką ilość barwnika). Przy pomocy pipety ustawionej na objętość 2 ml pobrać roztwór o najwyższym stężeniu (30%) i wprowadzić na dno probówki, następnie pobrać taką samą objętość roztworu o stężeniu 15% i bardzo ostrożnie wprowadzić na powierzchnię roztworu 30% tak, aby nie doszło do zmieszania warstw. Na końcu wprowadzić taką samą objętość roztworu 5%.

Rys.16. Roztwory sacharozy o różnym stężeniu (dla wyraźniejszego efektu wizualnego do poszczególnych roztworów sacharozy dodano różną ilość barwnika)

• ciągły gradient gęstości sacharozy

Wykonanie:

Przygotować roztwory sacharozy o stężeniu 10% i 30%. Przy pomocy cylindrów miarowych odmierzyć po 22 ml każdego z roztworów. Urządzenie do formowania gradientu umieścić na mieszadle magnetycznym i podłączyć do pompy perystaltycznej ustawionej na najmniejszą prędkość. Oba roztwory wlać do oddzielnych naczyń (dla lepszego wizualnego zobrazowania tworzenia gradientu do roztworu o stężeniu 30% można dodać niewielką ilość barwnika). Włączyć mieszadło magnetyczne i uruchomić pompę perystaltyczną. Spływający roztwór sacharozy zbierać do szklanej probówki wirówkowej na dno, której wprowadzić 1,5 ml 30% roztworu sacharozy.

Rys. 17. Zestaw do układania ciągłego gradientu sacharozy.

3b. Rozdział komórek drożdży na frakcje różniące się wielkością w ciągłym gradiencie sacharozy

Nie są to frakcje subkomórkowe zawierające organelle komórkowe lecz symulacja frakcjonowania subkomórkowego w postaci rozdziału komórek drożdży, wykazujących różnice wielkości.

Wykonanie:

• Przygotowanie ciągłego gradientu gęstości sacharozy

Gradient przygotować według metody opisanej powyżej.

• Sonikacja zawiesiny komórek drożdży

Sonikacja

Polega na wykorzystaniu tzw. fal kawitacji wywołanych przez ultradźwięki, które powodują mechaniczne uszkodzenie ściany komórkowej. Metoda ta jest wykorzystywana do dezintegracji komórek.

Uwaga!

W przypadku tego eksperymentu czas oraz częstotliwości ultradźwięków należy dobrać tak, aby nie doprowadzić do dezintegracji komórek a jedynie do oderwania komórek potomnych (pączków) od komórek macierzystych.

Wykonanie:

Do probówki typu Falcon wprowadzić 15ml zawiesiny komórek drożdży. Komórki zebrać przez wirowanie przy 2500 obr/min przez 5 min, płyn nadosadowy odrzucić osad zaś zawiesić w 15 ml wody. Czujnik sonikatora przetrzeć watą zwilżoną etanolem (w celu sterylizacji) a następnie umieścić go w probówce z zawiesiną komórek drożdży i uruchomić sonikator (czas 20 s). Po upływie 20 s wyłączyć sonikator zaś komórki zebrać przez wirowanie przy 3500 obr/min przez 10 min. Po odwirowaniu płyn nadosadowy odrzucić zaś osad komórek zawiesić w 1 ml wody.

3c. Rozdział komórek drożdży na frakcje różniące się wielkością komórek

Wykonanie:

1 ml zawiesiny otrzymanej w pkt.b bardzo delikatnie umieścić na powierzchni gradientu sacharozy. Następnie probówki przenieść do wirówki i wirować przez 5 min przy 1500 obr/min. Po skończonym wirowaniu ustawiając probówkę na ciemnym tle sprawdzić ułożenie poszczególnych warstw komórek. Przy pomocy rurki zakończonej cieniutkim końcem zebrać dwie skrajne frakcje (górną i dolną; frakcje środkowe odrzucić). Z obu zebranych frakcji pobrać niewielką ilość zawiesiny i sporządzić preparat mikroskopowy. Przy pomocy skali okularowej mikroskopu zmierzyć średnicę komórek należących do poszczególnych frakcji.

po wirowaniu

Materiały i sprzęt:

Hodowla drożdży Saccharomyces cerevisiae szczepu SP4

Wirówka z rotorem horyzontalnym i wychyleniowym

Gradient Forming Device

Mieszadło magnetyczne

Pompa perystaltyczna

Homogenizator ultradźwiękowy (sonikator)

Probówki wirówkowe o poj. 50ml

Probówki szklane

Cylindry miarowe o poj. 25ml

Probówki typu Falcon

Szkiełka mikroskopowe: podstawowe i nakrywkowe

Sterylna woda

Roztwory sacharozy (5%; 10%; 15%; 20%; 30%)

Pipety automatyczne o zmiennej objętości

Mikroskop świetlny