Biologia molekularna 25.05.2011
Typy retrotranspozonów c.d.
Nie wirusowe- nie zawierają sekwencji LTR
- LINE (long interspersed elements) – mają długość od kilkuset do kilku tysięcy bp. Są transkrybowane przez polimerazę II, kodują odwrotną transkryptazę, stanowią ok. 17 (20.4) % ludzkiego genomu (500000 kopii)
Przykład:
Ludzkie elementy Line -1 (L1) mają długość od kilkuset do ok. 9000 bp kopie funkcjonalne (z genomami ulegającymi ekspresji)- mają ok. 6500 bp i kodują odwrotną transkryptazę oraz endonukleazę 5’ UTR zawiera promotor dla RNA Pol II 3’ URT zawiera sygnał poliadenylacji (AATAAA) i sekwencje Poli- A
RNA Pol II kopiuje element L1 z Dna na RNA -> w cytoplazmie RNA ulega translacji do białek -> kompleks białek i RNA transpozonu jest importowany do jądra -> endonukleaza nacina nić docelowego DNA (często w intronach) -> RT kopiuje L1 RNA na L1 DNA, który jest wstawiany do docelowego DNA jako nowa kopia transpozonu.
-SINE (short interspersed elements) – mają długość ok. 100- 400 bp są transkrybowane przez polimerazę III (są pochodnymi genów transkrybowanych przez tą polimerazę tj. genów tRNA 5S rRNA snRNA nie kodują odwrotnej transkryptazy) stanowią ok. 11% ludzkiego genomu (ok. 1 500 000 kopii)
Przykład:
ludzkie elementy Alu mają długość ok. 300 bp, nazwa pochodzi od nazwy restryktazy Alul, która ma miejsce trawienia w obrębie tych elementów; nie zawiera sekwencji kodujących, ich transpozycja jest zależna od aktywnych (funkcjonalnych) kopii elementów L1; są odwrotnymi transkryptami 7S RNA, który wchodzi w skład cząsteczek SRP (Signac recognition particie) transpozycja elementów Alu może wywołać choroby genetyczne; stanowią ok. 10.6% ludzkiego genomu (ok. 1 200 000 kopii )
Klasa II; Transpozony DNA
- podczas ich transpozycji nie występuje intermediat RNA
- transpozycję katalizuje transpozaza- jej gen często występuje w obrębie transpozonu.
-enzym ten wiąże się z sekwencjami odwróconych powtórzeń, które znajdują się na końcach transpozonu oraz z sekwencją w docelowym DNA (jakakolwiek lub określona – zależnie od transpozazy)
-Transpozaza przecina DNA w miejscu docelowym (miejsca przecięcia górnej i dolnej nici są przesunięte względem siebie dlatego w rezultacie trawienia powstają lepkie końce) i wycina transpozon z pierwotnej lokalizacji po czym
-liguje go w miejscu docelowym
- polimeraza DNA wypełnia luki w obrębie lepkich końców, ligaza DNA nadaje ciągłość uzupełnionym niciom DNA- w rezultacie tych procesów miejsce docelowe ulega duplikacji (mechanizm cut and paste zwany też transpozozycją niereplikatywną)
Dlatego miejsca insercji transpozonów można rozpoznać po:
- znajdujących się zewnętrznie krótkich prostych powtórzeniach (powstałych w rezultacie przesunięcia miejsc trawienia obu nici przez transpozazę i wypełnienia powstałych luk przez polimerazę DNA) oraz
-znajdujących się dośrodkowo odwróconych powtórzeniach (które są konieczne do rozpoznania końców transpozonu i jego wycięcia przez transpozazę)
Niektóre transpozony bakteryjne wykorzystują mechanizm copy and paste tzn, transpozycje replikatywną. W jej toku pojawia się tzw. kointegrat, który jest rozdzielany dzieki aktywności enzymu zwanego resolazą- jest on także kodowany w obrębie transpozonu.
Biologiczne znaczenie transpozonu
Są źródłem zmienności genetycznej (często generowanej i przydatnej w warunkach stresu)
Stanowią tzw. samolubny DNA (selfish DNA)
ORGANOGENEZA KWIATU
Analiza fenotypów mutacji homeotycznych.
Indywidualne organy kwiatowe rozwijają się z tzw. zawiązków, które pojawiają się kolejno w obrębie merystemu kwiatowego. Najpierw pojawiają się zawiązki działek kielicha, a następnie organów położonych odśrodkowo. Zawiązki i powstające w nich organy kwiatowe tworzą cztery koncentryczne okręgi zwane okółkami. W kwiecie typu dzikiego tożsamość danego organizmu można przewidzieć w pozycji jego zawiązka obrębie merystemu kwiatowego.
Odstępstwa od ścisłej zależności pomiędzy pozycją a tożsamością organu obserwuje się w przypadku kwiatów tzw. mutantów homeotycznych tzn. u takich, u których organy jednego typu są zastąpione innymi. U Arabidopsis thaliana szczególnie wiele uwagi poświęcono czterem takim mutacjom. Wszystkie mają charakter recesywny izostały otrzymane w wyniku zastosowania mutagenezy chemicznej (mutagen: ethylmethane sulphanate- EMS) we wczesnych latach 60-tych.
(rys.)
Każda z wymienionych mutacji zmienia charakter organów w obrębie 2 przylegających okółków. Dlatego można je podzielić na 3 klasy:
- mutacje zmieniające okólki 1 i 2 (zewnętrzne), ap2;
- mutacje zmieniające okólki 2 i 3 (centralne), pi/ap3;
- mutacje zmieniające okólki 3 i 4 (wewnętrzne), ag;
Konsekwentnie merystem kwiatowy można podzielić na 3 koncentryczne pola, z których każde obejmuje teren 2 okółków i jest domeną działania jednego lub dwóch genów homeotycznych. I tak:
Pole A – obejmuje O1 i O2, jest domena działania AP2;
Pole B- obejmuje O2 i O3, jest domeną działania PI oraz AP3;
Pole C – obejmuje O3 i O4 jest domeną działania AG
W rozważnym kontekście termin okółek dotyczy określonej lokalizacji w kwiecie lub merystemie kwiatowym w obrebie której mogą pojawić się dowolne organy ( nie odnosi się do określonych organów jako takich)
Naczelnym założeniem tego tzw. modelu ABC jest, że kierunek rozwoju zawiązków w obrębie danego okółka jest długoterminowany kombinacją poroduktów genów homeotycznych obecnych w komórkach tego okółka. I tak, jeżeli w komórkach merystemu znajdują się produkty :
- tylko AP2- formują się działki kielicha (O1);
- AP2 + PI/AP3- formują się płatki korony (O2);
- PI/AP3 + AG- formują się pręciki (O3);
- tylko AG – formują się owocolistki (O4)
Jakie organy tworzą się w kwiecie przy nieobecności produktów jakichkolwiek genów homeotycznych?
Takie organy mają charakter tzw. karpeloidalnych (owocolistkowa tych) liści (a nie jak zwykłych liści). Takie organy pojawiają się w O1 i O4 u podwójnego mutanta ap2/ag oraz w całych kwiatach potrójnych mutantów ap2/pi/ag i ap2/ap3/ag.
Wzory ekspresji genów homeotycznych zarządzających organogenezą kwiatu.
Analiza ekspresji genów homeotycznych stała się możliwa po ich sklonowaniu i zsekwencjonowaniu. Do klonowania wykorzystano techniki T-DNA tagging oraz alternatywnie sondy heterologiczne z Antirrhium majus
Model ABC sugeruje następującą dystrybucję produktów ekspresji:
- AP2- O1 i O2;
-PI, AP3- O2 i O3;
-AG –O3 i O4
-AP2 w kontekście ag – O1,O2,O3 i O4
AG w kontekście ap2- O1,O2,O3 i O4
AG mRNA jest wykrywane w obrębie 2 wewnetrznych okółków, modyfikowanych również przez mutację ag. Domena ekspresji AG rozrasta się na O2 i O1 w przypadku mutanta ap2. Wzór ekspresji pozostaje zatem w zgodzie z modelem ABC.
AP2 ulega ekspresji w komórkach merystemu generatywnego oraz podczas rozwoju wszystkich 4 typów organów kwiatowych. Dlaczego AP@ nie jest regulowany negatywnie przez AG w O3 i O4. Dlaczego AP2 nie hamuje ekspresji AG w O3 i O4 ?
PI mRNA jest w obrębie O2 i O3 , ale także w O4. Jest to zaskakujące, ponieważ mutacje pi nie zmieniają O4. Z kolei w późniejszych stadiach rozwojowych transkrypty PI wykrywa się zgodnie z przewidywaniami tylko w O2 i O3. Wzór ekspresji tego genu z grubsza koresponduje z założeniami modelu ABC .
Zgodnie z przewidywaniami modelu ABC transkrypty AP3 pojawiają się tylko na terenie O2 i O3.