Klasyfikacja aminokwasow:
Ze względu na budowe łańcuchów bocznych wyróżniamy aminokwasy:
- niepolarne
- z alifatycznym lub aromatycznym lancuchem bocznym
- polarne niezjonizowane (bez ładunku) – zawierajace w lancuchu bocznym grupe –OH lub –SH
- kwasne – z dodatkowa grupa –COOH
- zasadowe – z dodatkowa grupa –NH2 lub grupa guanidynowa lub pierścieniem imidazolowym;
2) ze względu na ich wystepowanie lub brak w bialkach aminokwasy dzielimy na:
- białkowe
-niebiałkowe;
3) wyróżniamy aminokwasy:
- endogenne
- egzogenne (niezbędne);
4) ze względu na metabolizm lncuchow weglowych wyróżniamy aminokwasy:
- glukogenne
-ketogenne.
Aminokwasy endogenne i egzogenne
Aminokwasy egzogenne – sa to aminokwasy, które nie sa syntezowane w organizmie ludzkim i musza być dostarczone z pożywieniem, a ich obecność i odpowiednie stezenie w bialkach spożywczych decyduje o wartości odżywczej.
Aminokwasy, które musza być dostarczone w pożywieniu: arginina, histydyna, izoleucyna, leucyna, lizyna, metionina, fenyloalanina, treonina, tryptofan, walina
Aminokwasy, które nie musza być dostarczone w pożywieniu: alanina, asparagina, asparaginian, cysteina, glutaminian, glutamina, glicyna, hydroksyprolina, hydroksylizyna, prolina, kseryna, tyrozyna.
Aminokwasy gluko- i ketogenne
Aminokwasy glukogenne (glikogenne)- aminokwasy, których metabolizm prowadzi do wytwarzania glukozy (sacharydow).
Aminokwasy ketogenne- aminokwasy, których metabolizm prowadzi do wytworzenia związków ketonowych.
Glikogenne: arginina, alanina, kwas asparaginowy, asparagina, cysteina, kwas glutaminowy, glutaminy, glicyna, histydyna, prolina, metionina, seryna, treonina, walina.
Ketogenne: lizyna, leucyna.
Gliko- i ketogenne: izoleucyna, tyrozyna, fenyloalanina, tryptofan.
Struktura wiazania peptydowego:
-dlugosc wiazania peptydowego wynosi 1,32 A
-Angstrem (A) to jednostka długości 1A=10-10m=0,1nm
-elektrony wiazania C=O oraz wolna para elektronow przy N ulegaja delokalizacji, wiazanie C-N (peptydowe) staje się polarne i może występować w postaci form tautometrycznych (rezonansowych)
-ugrupowanie C=O staje się anionem, natomiast N-H jest kationem, a wiazanie C-N w około 40% ma charakter wiazania podwojnego.
Aminokwasy niebiałkowe:
- beta alanina– wystepuja w czasteczce kwasu pantotenowego (witamina z grupy B) oraz w niektórych naturalnych peptydach.
-D-alanina – występuje w polipeptydach scian komorkowych bakterii
- kwas 4-aminomaslowy – wystepuje w mozgu i innych tkankach zwierzęcych, dziala jako neurotransmiter
- kwas D-glutaminowy – wystepuje w polipeptydach scian komorkowych wielu bakterii
- L-homoseryna – występuje w wielu tkankach, związek posredni w metabolizmie aminokwasow
- L-omityna – wystepuje w wielu tkankach, intermedia w syntezie argininy i w cyklu mocznikowym
- Sarkozyna – wystepuje w wielu tkankach, uczestniczy w syntezie aminokwasow
- L-tyroksyna – tarczyca, hormon tarczycy.
Ze względu na skalę przestrzenną pełną strukturę białka można opisać na czterech poziomach:
-Struktura pierwszorzędowa białka, zwana również strukturą pierwotną - jest określona przez sekwencję (kolejność) aminokwasów w łańcuchu białkowym
-Struktura drugorzędowa białka - są to lokalne struktury powstające w wyniku tworzenia się wiązań wodorowych pomiędzy tlenem grupy -C=O, a wodorem grupy -NH dwóch niezbyt odległych od siebie w łańcuchu wiązań peptydowych. Do struktur drugorzędowych zalicza się:
*helisę - gł. helisę alfa (ang. α helix)
*różne rodzaje beta kartki lub "pofałdowanej kartki" (ang. β sheet)
*skręty (ang. turn)
-Struktura trzeciorzędowa białka - Wzajemne położenie elementów struktury drugorzędowej stabilizowane przez oddziaływania reszt aminokwasowych oraz tworzenie mostków dwusiarczkowych -S-S- , powstających pomiędzy dwiema resztami cysteiny w łańcuchu.
-Struktura czwartorzędowa białka - opisuje ilość i wzajemne ułożenie podjednostek cząsteczkowych (pojedynczych łańcuchów) białek.
Pierwszorzedowa struktura bialek:
-to liniowa sekwencja aminokwasow polaczonych wiazaniami peptydowymi
-wyznacza się ja na podstawie kolejności ułożenia zasad azotowych w gnie kodującym dane bialko
-zawarte jest tu polozenie wszystkich innych wiazan kowalencyjnych.
Struktura drugorzedowa:
-to regularne pofaldowanie regionow lancucha polipeptydowego;
a) alfa helisa: tlen karbonylowy każdego wiazania peptydowego jest polaczony wiazaniem wodorowym z wodorem grupy aminowej czwartego z kolei aminokwasu
b) struktura beta: wiazania wodorowe powstaja pomiedy wiazaniami peptydowymi roznych łańcuchów polipeptydowych lub roznych czesci tego samego lancucha polipeptydowego.
Harmonijka β:
Atomy grupy =C=O i =N-h oraz dwa sąsiednie atomy C leza w jednej płaszczyźnie. Cα każdej reszty aminokwasowej jest miejscem styku tych płaszczyzn/ Odleglosc pomiedzy dwiema resztami aminokwasowymi wynosi 0,35nm.
Sasiadujace polipeptydowe nici mogą być ułożone w przeciwnych kierunkach lub w jednym kierunku. Sa stabilizowane wiazaniamo wodorowymi pomiedzy grupami CO i NH należącymi do odrenych łańcuchów polipeptydowych.
Udzial aminokwasow w tworzeniu struktur przestrzennych bialek:
Zwrot β (struktura spinki do włosów lub struktura wstega-zwrot- wstega). Wiazania wodorowe tworza się miedzy grupa –CO reszty i a grupa –NH reszty i+3.
Trzeciorzedowa struktura bialek:
-struktura trzeciorzedowa bialek powstaje w wyniku oddziaływań pomiedzy lancuchami bocznymi aminokwasow zarówno sąsiadujących ze soba jak i odległych w sekwencji liniowej
-jest efektem pofaldowania i zwiniecia się lancuch polipeptydowego mającego już okreslona strukture drugorzedowa, w trojwarstwowa postac globularna lub inny układ przestrzenny
-wiazania niekowalencyjne stabilizujące strukture trzeciorzedowa to:
*wiazania wodorowe
*wiazania jonowe
*oddziaływania hydrofobowe i sily van der Waalsa
*mostki dwusiarczkowe.
Struktura trzeciozedowa dotyczy przestrzennego ułożenia aminokwasow zarówno odległych w sekwencji liniowej, jak i tych, które ze soba sąsiadują. Koncowa struktura przestrzenna jest determinowana przez sekwencje aminokwasow
Domeny i motywy strukturalne w bialkach:
-elementy struktury drugorzędowej polaczone ze soba za pomoca zwrotow β lub petli tworza tzw. Motywy strukturalne (struktury naddrugorzedowe)
-motyw αα- (α- helisa- petla-α-helisa) wystaepuje w bialkach oddziałujących z DNA i w bialkach wiążących jony wapnia
-motyw ββββ (motyw klucza gerckiego) wystepuje w nukleazie bakteryjnej degradującej DNA
-Domeny białkowe:
*zawieraja 50-350 reszt aminokwasowych
*stanowa moduly konstrukcyjne i funkcjonalne
*często sa kodowane przez rozne eksony
-czasteczka bialka oprocz regionow o regularnej strukturze może zawierac obszary o zakloconej regularności, tzw. Struktury przypadkowego (statystycznego) klebka.
Czwartorzedowa struktura bialek:
-wystepuje w bialkach składających się z wiecej niż jednego lancucha polipeptydowego
-każdy z łańcuchów nazywa się monomerem (podjednostka);
-monomery mogą asocjowac tworzac oligomer (dimer, tetramer, heksametr, oktamer)
-strukture czwartorzedowa stabilizuja
*wiazania dwusiarczkowe (disulfidowe)
*wiazania jonowe
*oddziaływania hydrofobowe
*wiazania cheletowe powstające z udzialem jonow metali.
Struktura ta dotyczy przestrzennego ułożenia polipeptydowych podjednostek i natury oddziaływań miedzy nimi. Tymi oddziaływaniami mogą być wiazania kowalencyjne lub oddziaływania niekowalencyjne.
Wysalanie bialka:
-mechanizm procesu wysalania bialka polega na pozbawieniu czasteczki bialka warstwy hydratacyjnej (otoczki wodnej)
-wysalanie bialka wykorzystywane jest do wyodrębniania bialek z roztworu oraz do frakcjonowania bialek
-bialko po wysoleniu zachowuje aktywność biologiczna.
Denaturacja bialka:
-silne kwasy- wysokie stezenie jonow wodorowych powoduje cofanie się grup –COO- czego skutkiem jest zrywanie wiazan jonowych i wodorowych
-COO- + H2O+ COOH + H2O
-silne zasady- zobojętniają grupy –NH+3
-NH3+ + OH- -NH2 + H2O
-jony metali ciezkich zrywaja wiazania dwusiarczkowe. Kationy Hg2+, Pb2+, Cu2+, Fe3+ tworza z bialkami sole o bardzo malej dysocjacji.
Klasyfikacja bialek:
Ze względu na sklad chemiczny wyróżniamy:
-bialka proste- które po hydrolizie daja wyłącznie aminokwasy lub ich pochodne
-bialka zlozone- które składają się z czasteczki bialka prostego polaczonego z inna, niebialkowa czasteczka, zwana grupa prostetyczna
*Do bialek zlozonych zaliczamy:
-fosfoproteiny (kazeiny mleka)
-glikoproteiny (przeciwciała, substancje grupowe krwi, glukoamylaza)
-chromoproteiny (hemoglobina, rodopsyny)
-metaloproteiny (ferredoksyna, oksydaza cytochromowa, reduktaza azotanowa)
-nukleoproteiny (bialka zasadowe twrozace kompleksy z kwasami nukleinowymi)
-lipoproteiny (bialka blon komorowych i cytoplazmatycznych transportujące lipidy, hormony)
Na podstawie rozpuszczalnosci można wyroznic:
-albuminy- rozpuszczalne w wodzie i rozcieńczonych roztworach soli
-globuliny- slabo rozpuszczalne w wodzie, a bardzo dobrze w roztworach soli
-prolaminy- rozpuszczalne w 70-80% etanolu, występują tylko w nasionach traw, zawieraja duzo proliny i aminokwasow dikarboksylowych
-skleroproteiny- nierozpuszczalne w wodzie ani w roztworach soli, bogate w Gly, Ala, Pro i hydroksyproline
Ze względu na kształt czasteczki wyróżniamy bialka:
-globularne
-wlokienkowe (fibrylarne).
Funkcje bialek:
-enzymy- biokatalizatory, uczestnicza w tworzeniu lub rozpadzie wiazan chemicznych, np. pepsyna katalizuje rozklad bialek pokamowych w żołądku;
-bialka strukturalne- stanowia mechaniczna podpore Komorek i tkanek, np. kole=Agen składnik substancji międzykomórkowej, sciegien i kosci;
-bialka transportujące- przenoszą Male czasteczki lub jony, np. albumina transportuje lipidy, hemoglobina- tlen;
-bialka motoryczne- generuja ruch w komorkach i tkankach, np. miozyna w Komorkach miesni szkieletowych wytwarza sile motoryczna, kinezyna oddziałując z mikrotubulami, przemieszcza organelle w Komorkach;
-bialka receptorowe (rodopsyna), bialka regulujace geny (rep resor operony laktozowego), bialka specjalnego przeznaczenia (bialko zapobiegające zamarzaniu, bialko słodkie- monelina Discoreophyllum cumminisii, taumatyna Thamatococcus danielli).
Punkt izoelektryczny:
Przy określonej wartości pH liczba ładunków dodatnich (+) i ujemnych (-) jest sobie równa i wówczas aminokwas znajduje się w punkcie izoelektrycznym. Podobnie w białkach mogą pojawiać się lub zanikać ładunki dysocjujących grup R. Punkt izoelektryczny aminokwasów lub białek jest to taka wartość pH roztworu, przy której występuje taka sama liczba ładunków dodatnich i ujemnych, a więc ładunek wypadkowy cząsteczki jest równy zeru.
Cyklem azotu nazywamy przemieszczanie się azotu w lancuchu pokamowym, od prostych zwazkow nieorganicznych, glownie amoniaku, do zlozonych związków organicznych.
Pierwszym etapem w cyklu jest redukcja gazowego N2 do amoniaku w procesie nazywanym wiazaniem azotu; może on również powstawac przez redukcje jonu azotanowego w glebie; powstaly amoniak może być wlaczany przez wszystkie organizmy.
Organizmy wiazace azot
Organizmy symbiotyczne:
-rhizobium: motylkowate, lubin, wyka, koniczyna
-frankia (Actinomycetes): olcha
-azospirillum: trawy tropikalne
-cyjanobakterie (Anabena, Nostoc): paproc wodna;
Organizmy niesymbiotyczne:
-niefotosyntezujace bakterie tlenowe
-fotosyntezujace bakterie tlenowe
-fotosyntezujace bakterie beztlenowe.
Wiazanie azotu
Nitrogenaza
N2+8e- + 16ATP + 16H2O → 2NH3 + H2 + 16ADP + 16P + 8H+
Kompleks nitrogenazy sklada sie z dwoch bialek: reduktazy (dostarcza elektrony o duzym potencjale redukcyjnym; dimer z jednym ugrupowaniem żelazo-siarkowym i dwoma miejscami ważącymi ATP) i nitrogenezy (wykorzystuje elektrony do redukcji N2 do NH3; dwie podjednostki alfa i dwa beta, oraz kompleks żelazo-molibdenowy)
Mechanizmy zabezpieczajce nitrogenazę przed dzialaniem tlenu:
-wytwarzanie leghemoglobiny– bakterie z rodzaju rhizobium
-wytwarzanie heterocyst– sinice (cyjanobakterie) anabena
-rozdzielanie czasowe fotosyntezy i wiazania N2 – gleotheca
-intensyfikacja oddychania.
Asymilacja azotu
Asymilacja nieorganicznego azotu w postaci amoniaku do związków organicznych odbywa się w dwoch reakcjach katalizowanych przez dehydrogenaze glutaminianowa i syntetaze glutaminowa z utworzeniem aminokwasow (glutaminianu i glutaminy)- te sa pozniej uzywane w kolejnych reakcjach biosyntetycznych
a) dehydrogenaza glutaminianowa- katalizuje redukcyjna aminacje alfa-ketoglutaranu; dziala z NAD jak i z NADP b) syntetaza glutaminowa- katalizuje wlaczenie amoniaku do glutaminy, zuzywa energie z hydrolizy ATP (syntetaza a nie synteza bo zuzywa ATP)
Amonifikacja- przejscie azotu organicznego w amoniak.
Nitryfikacja- mikrobiologiczne przekształcenia amoniaku do azotanów i azotynów.
Denitryfikacja- proces edukcji azotanow do azotu czasteczkowego.
Pochodzenie jonow amonowych (NH4+) asymilowanych przez rosliny:
-N2
-NO3-
-NH4+
-katabolizm bialek
-fotooddychanie
-katabolizm innych zwiazkow zawierajacych azot.
Cykl kwasu cytrynowego
Glowna funkcja szlaku jest utlenianie pirogronianu do CO2 i H2O z jednoczesnym uzyskiwaniem energii.
Przebiega na terenie mitochondriom, wiec pirogronian musi być transportowany przez specjalny. Cykl krebsa można traktowac jako koncowy etap utleniania glukozy. Produktem glikolizy jest pirogronian. W warunkach tlenowych pirogronian z glikolizy leci do mitochndrium i tam ulega dekarobksylacji z udzialem dehydrogenazy pirogronianowej. Uczestnicza w tej reakcje rozne koenzymy i grupy prostetyczne. Wazna reakcja, w niej powstaje substrat dla cyklu krebsa czyli acetylo coa.
Reakcja katalizowana przez dehydrogenaze pirogronianowa
Reakcje katalizowane przez kompleks dehydrogenazy pirogronianowej
Etapy reakcji:
-1. pirogronian wiaze się z DPT i ulega dekarboksylacji, jednoczesnie powstaje difosforan (pirofosforan) hydroksyetylotiaminy. Reakcja przebiega z udzialem E1
-2. grupa hydroksyetylowa tiaminy zostaje utleniona do grupy acetylowej i przeniesiona na kwas liponowy, który ulega redukcji. Powstaje acetylolipoamid. Reakcje katalizuje E2.
-3. grupa acetylowa jest przenoszona na CoA (koenzym A), reakcje katalizuje E2
-4. zredukowany lipoamid ulega regeneracji z udzialem E3, FAD, i NAD powstaje NADH
-5. kompleks dehydrogenazy pirogronianowej gotowy do katalizowania reakcji.
Cykl kwasu cytrynowego
Sumaryczne wiazanie cyklu:
Acetylo- CoA + 3NAD+ + FAD + GDP + Pi+ H2O → 2CO2 + 3NADH + FADH2 + GTP + 2H+ + CoA
U roslin ATP a nie GTP
Funkcje kwasu cytrynowego:
-jest to glowny szlak rozkladu czasteczek aminokwasow, sacharydow i kwasow tluszczowych do dwutlenku wegla i wody.
-dostarcza czasteczki zredukowanych koenzymow NADH i FADH2 które są utleniane w lancuchu oddechowym dajac ATP
-cykl kwasu cytrynowego dostarcza substraty do reakcji biosytetycznych.
Cykl glioksalowy:
2 acetyloCoA + NAD+ +2H2O → bursztynian + 2CoA + NADH + 2H+
-proces wykorzystywany do wzrostu i wytwarzania cukrow z acetylo-CoA
-przebiega w glioksysomach roslin wyzszych i komorkach mikroorganizmow. Nie wystepuje w organizmach zwierzecych. W jednym obrocie cyklu zuzywane są dwie czasteczki acetylo-CoA pochodzace z octanu lub z rozkladu tluszczow.
Enzymy specyficzne dla cyklu glioksalowego:
-liaza izocytrynianowa
-syntaza jablczanowa.
Łańcuch oddechowy
Utlenianie NADH i FADH2 oraz zatrzymywanie uwolnionej energii w czasteczce ATP
Koenzym Q, ubichinon– ruchomy przenosnik elektronow
Cytochrom C– ruchomy przenosnik elektronow.
Skladniki lancucha oddechowego zawarte w wewnetrznej blonie mitochondrialnej zggrupowane są w piec kompleksow:
-kompeks I– oksydoreduktaza NADH: ubichinon (dehydrogenaza NADH) zawiera trwale zwiazana w czasteczke FMN, która wiaze dwa atomy wodoru (2H+ + 2e-), przechodzac w FMNH2. Zawiera bialka Fe:S.; przenosi atomy wodoru na następne ogniwo lancucha – ubichinon. Kompeks I jest sprzezony z reakcja fosforylacji
-kompleks II – oksydoreduktaza bursztynian: ubichinon– uczestniczy w utlenianiu bursztynianu. Jest kompleskem bialka enzymatycznego dehydrogenazy bursztynianowej ( enzym cyklu krebsa) oraz bialek Fe:S. Redukuje ubichinon do ubichinolu (ubihydrochinonu)
-kompleks III – oksydoreduktaza ubichinol: utleniony cytochrom c. zawiera cytochrom b, oraz bialka Fe:S. Jest sprzezony z reakcja fosforylacji
-kompleks IV- oksydoreduktaza zredukowana cytrochrom c tlen. Zawiera cytrochrom a i a3. Przekazuje elektrony ze zredukowanego cytochromy c na tlen. Jest sprzezony z reakcja fosforylacji
-kompleks V– syntaza ATP.
-kazdy przenosnik pobiera elektron od dawcy i przekazuje go biorcy. Koncowym akceptorem pary elektronow jest atom tlenu. Powstajacy jon O2 wiaze dwa protony tworzac czasteczke wody. Proces ten zuzywa wiekszosc tlenu pobieranego przez organizm.
Dzialanie pomp protonowych:
-dehydrogenaza NADH (reduktaza NADH- Q)
NADH + Q + 5H+matriks → NAD+ + QH2 + 4H+CYTOZOL
-reduktaza cytochromowa
QH2 + 2cyt cutleniony + 2H+matriks → Q + 2cyt czred + 2H+cytozol
-osydaza cytochromowa
4cyt czred + 8h+matriks + O2 → 4cyt cutl + 2H2O + 4H+cytosol
Tworzenie gradientu protonowego
W lancuchu transportu elektronow wszystkie przenośniki elektronow oddziałują wzajemnie zgodnie z ihc potencjałami erdoks. Pzenosnik przyjmujący ma wieksze powinowactwo do elektronu od przenośnika oddajacego. W ten sposób przebiega przeplyw elektronow netto z NADH (bardziej ujemny potencjal erdoks, najmniejsze powinowactwo do elektronow) do tlenu (najbardziej dodatni potencjal redoks, najwieksze powinowactwo do elektronow). To zapewnia jednokierunkowy przeplyw elektronow.
Potencjal spada (staje się bardziej dodatni) od początku do konca lancucha; popmy protonowe wypompowywuja jony H+ z matriks mitochondrialnej poprzez wewnetrzna blone mitochondrialna do przestrzeni międzybłonowej.
Podczas transportu elektronow z NADH przez lancuch oddechowy uwalnia się energia która zostaje wykorzystana do tworzenia gradientu H+.
Syntaza ATP:
Jest zlokalizowana w wewnętrznej blonie mitochondrialnej. Sklada się z dwoch głównych czesci:
-F1 ATPazy polaczonej z czescia
-F0 (czynnik sprzęgający 0)
stanowiaca transblonowy kanal protonowy zakotwiczony w wewnętrznej blonie.. W mitochondriach caly kompleks wykorzystuje energie uwalniana przez transport elektronow do syntezy ATP, natomiast wyodrebniona z całości F1 ATPaza hydrolizuje ATP. Podczas hydrolizy ATP i prawdopodobnie także podczas syntezy ATP, podjednostka gamma F1 ATPazy obraca się względem podjednostki beta; jest najmniejszym ze znanych w przyrodzie motorem obrotowym.
-podjednostki beta syntazy ATP posiadaja miejsca katalityczne– miejsca wiazania nukleotydow: ADP +Pi oraz ATP
-podjednostki beta syntazy ATP są funkcjonalnie nierownowazne:
*miejsce katalityczne w formie O– otwarte– ma znikome powinowactwo do substratow;
*miejsce katalityczne w formie L – luzno wiaze sbstraty i nie ma aktywnosci katalitycznej;
*miejsce katalityczne T– mocno wiaze substraty (ADP i Pi) i jest katalitycaznie aktywna.
-energia wniesiona przez przeplyw protonow przez kanal Fo, powoduje zmiane konformacji miejsc klatalitycznych: T przechodzi w O, L w T a miejsce O w L.
-te zmiany konformacyjne zachodza prawdopodobnie na skutek rotacji podjednostek beta wzgledem podjednostki gamma. Podjednostka gamma przenosi energie protonow i wymusza transformacje miejsca T w miesjce O, aby nastopilo odlaczenie ATP.
Cykl Q:
-mechanizm sprzegajacy przeniesienie elektronow z QH2 na cyt C.
-dwie czasteczki QH2 zostaja utlenione
-jedna czasteczka Q ulega redukcji do QH2
-dwie czasteckzi cyt C ulegaja redukcji
-cztery protony są uwalniane do przestrzeni między blonowej, a dwa zostaja pobrane z matrix co przyczynia się do powstania gradientu protonowego po obydwu stronach wewnetrznej blony mitochondrialnej.
Fosforylacja oksydacyjna:
-budowa i funkcje mitochondriow
-fosforylacja oksydacyjna to proces powstawania ATP napedzany transportem elektronow z subtratow oddechowyn na tlen. W procesie tym posredniczy sila protonomotoryczna wytworzona przez gradient pH i roznice potencjalu elektrochemicznego na wewnetrznej blonie mitrochondrialnej.
-fosforylacja oksydacyjna zachoodzi w blonie komorkowej organizmow prokariotycznych i w wewnetrznej blonie mitochondrialnej organizmow eukariotycznych.
Bilans transportu elektronow – wynika z niego ze elektrony od zredukowanych na tlen koenzymow czyli od NAADH, FADH2 na tlen są transportowane dzieki kolejno przbeiegajacym reakcjom oksydoredukcyjnym. Czesci koenzymow dzialaj na zasadzie utleniania i redukcji. Transport elektronow jest wymuszony roznica potencjalow oksydoredukcyjnych między NADH, FADH2i tlenem. Zredukowane koenzymy mają ujemna wartosc potencjalu (są zwiazakmi które latwo oddaja elektrony) tlen ktory ma dodatnia wartosc potencjalu oksydoredukcyjnego jest akceptorem elektronow dzieki czemu może nastepowac utlenianie koenzymow czyli ich regeneracja w lanc oddechowym.
Enzymy:
-enzymy to wyspecjalizowane bialka wykazujące zdolności katalityczne
-przyspieszaja reakcje nie podlegające trwałym zmianom
-wydajnosc katalityczna enzymow >> przekracza wydajność katalizatorow chemicznych
-charakteryzuja się wysoka specyfcznoscia w stosunku do substratow
-przeyspieszaja reakcje bez produktow ubocznych
-dzialaja w rozcieńczonych roztworach, w lagodnych warunkach pH i temperatury, przy niskich wartościach cisnienia
-aktywnosc enzymow podlega precyzyjnej regulacji.
Architektura enzymow:
-enzymy rozpuszczalne
-enzymy blonowe
-kompleksy enzymatyczne
-bialka proste i bialka zlozone.
Apoenzym+ Kofaktor (koenzym, jon metalu, grupa prosteytczna)= Holoenzym
Apoenzym- to bialkowa czesc enzymu, od korej zalezy specyficzność substratowa enzymu.
Kofaktor- to niebialkowa czesc enzymu; sa to nisoczasteczkowe substancje chemiczne uczestniczace w katalizie. Koenzym jest luzno związany z enzymem i po zakończeniu reakcji może odłączyć się od bialka enzymu. Grupa prostetyczna jest silnie zwiazana z enzymem i po reakcji nie odlacza się od bialka enzymu.
Holoenzym- to czasteczka aktywnego enzymu.
Funkcje kofaktorow w czasie analizy:
Odpowiadaja za właściwe usytuowanie substratu
Koenzymy i grupy prostetyczne mogą brac udzial w reakcji:
-przenosza e- i H+
-przenosza grupy funkcyjne
Jony metali (Me):
-biora bezposredni udzial w reakcji przenoszac e-
-przylaczenie Me prowadzi do zmian konformacyjnych w bialku enzymu co ulatwia związanie substratu i przebieg katalizy
-mogą być potrzebne do bezpośredniego wiazania substratu z metaloenzymem
-kompleks Me-substrat może być rzeczywistym substratem reakcji.
Specyficznosc enzymow co do kieruku reakcji
Enzym przyspiesza tylko jedna z reakcji, ktorm może podlegac substrat
Specyficznosc substratowa
Rodzaje specyficzności substratowej:
-absolutna (ureaza, syntetaza aminoacylo-tRNA, polimeraza DNA I)
-grupowa (heksokinaza, lipaza)
-stereospecyficznosc (amoniakoliaza asparaaginianowa)
-wobec innych grup funkcyjnych poza regulacja
-wobec określonej długości lancucha weglowego.
Enzymy jako katalizatory:
-enzymy to katalizatory organiczne, czyli biokatalizatory. Przyspieszaja reakcje termodynamiczne korzystne (egzoergiczne) oraz reakcje termodynamiczne niekorzystne (endoergiczne) sprzężone z reakcjami egzoergicznymi
-enzymy działając jako biokatalizatory zwiększają:
*prawdopodobieństwo zderzen regulujących czesteczek
*ukierunkowuja względem siebie reagujące czasteczki
*obniżają energie aktywacji reagujących czasteczek.
Energia aktywacji to najmniejsza porcja energii, która trzeba dostarczyc 1 molowi substratow, aby kazda z czasteczek stala się reaktywna.
Etapy reakcji enzymatycznej:
-pierwszy etap- przyłączenie do powierzchni enzymu substratu(ow) i ko faktora, co zapewnia optymalne ulozenie reagujacych ze soba grup. Nastepuje „zamrozenie” czasteczek substratu na powierzchni enzymu
-drugi etap- oddziaływanie enzymu z substratem prowadzace do powstania wzbogaconej formy kompleksu enzym-substrat. Ten etap katalizy opisuje teoria stanu przejsciowego
-trzeci etap- wlasciwa kataliza, czyli przekształcenie kompleksu ES w kompleks EP i jego rozpad.
Dzialanie enzymu:
-ukierunkowane substraty mogą reagowac ze soba
-enzym napreza substrat
-substrat powoduje przegrupowanie ładunków co umozliwia katalize
-po przyłączeniu substratu do centru aktywnego dwie reszty aminokwasowe zyskuja ładunek elektryczny.
Zmiany energii w reakcjach enzymatycznych
Ea= ^G#= energia aktywacji
^G= GS #- GS
^G#- energia aktywacji- to roznica energii swobodnej stanu przejściowego i substratu w stanie podstawowym.
Teoria stanu przejściowego:
-w centrum aktywnym enzymu zderzaja się ze soba czesteczki (S) o energii co najmniej rownej energii aktywacji
-w momencie efektywnego zderzenia nastepuje przegrupowanie elektronow walencyjnych tych tych czasteczek i tworzy się nietrwaly układ zwany stanem przejściowym S# (kompleks ES), w stanie przejściowym przy określonej konfiguracji atomow, energia swobodna osiaga wartość maksymalna
-kompleks ES rozpada się i nastepuje uwolnienie produktu oraz czasteczki enzymu.
Centrum (miejsce) aktywne enzymu
-centrum aktywne enzymu- to miejsce w czasteczce enzymu, do którego przylaczaja się substraty oraz nastepuje ich przekształcenie w produkt(y)
-lancuchy boczne aminokwasow budujacych centrum aktywne mogą lezec w roznych miejscach linowej sekwencji aminokwasow
-w polaczeniach ES biora udzial slabe wiazania (o sile 12-50 kJ/mol)
-centra aktywnesa zagłębieniami lub szczelinami niedostępnymi dla wody
-specyficznosc wiazania substratu zalezy od precyzyjnie określonego ułożenia atomow w centrum aktywnym.
Aminokwasy kontaktowe- te które wiaza substrat jak i te, które bezpośrednio uczestnicza w katalizie.
Aminokwasy pomocnicze- nie stykaja się z substratem ale uczestnicza w katalizie.
Aminokwasy stabilizujące- utrzymuja odpowiednia konformacje CA.
Modele wiazania substratu:
-model fischera – klucza i zamka
-model koshlanda – indukowanego dopasowania.model – dloni i rekawiczki.
-ogstona – trojpunkowego wiazania substratu.
Badanie aktywnosci enzymow:
-miara aktywnosci enzymu jest ilosc substratu przeksztalconego w jednostce czasu lub ilosc produktu powstalego w jednostce czasu przeliczona na ilosc badanego materialu. Aktywnosc enzymu wyraza się w jednostkach aktywności;
-Jednostka uniwersalna (standardowa) to taka ilosc enzymu, która katalizuje przemiane 1µmola substratu w ciagu 1min, w temp 30stC i optymalnych warunkach pH oraz stezenia substratu;
-Katal to taka ilosc enzymu, która w ciagu 1 sekundy, w temp 30stC i optymalnych warunkach pH oraz stezenia substratu powoduje przemiane 1mola substratu;
-aktywnosc molekularna jest to ilosc mmoli substratu przeksztalcona w ciagu 1min w standardowych warunkach przez 1 µmol enzymu;
-Aktywnosc wlasciwa okresla liczbe jednostek uniwersalnych enzymu w przeliczeniu na 1mg bialka.
Właściwości kinetyczne enzymow Model Michaelisa-Menten
k1 k2
E+S ↔ ES → E +P
k-1
-reakcje enzymatyczne stanowia uklad, na ktory składa się kilka reakcji posrednich o roznych stalych k (stalych rownowagi), a więc te reakcje czastkowe przebiajgaja z roznymi predkosciami
-szybkosc tworzenia kompeksu ES: ES=k1[E][S]
-szybkossc rozpadu kompeksu ES: ES=(k2+k-1)[ES]
-szybkosc reakcj izalezy od stezenia kompeksu ES i szybkoszi jego rozkladu, a stala rownowagi tych przemian nazywana jest stala michaelisa-menten, symbol KM
-V0- szybkosc poczatkowa reakcji
-KM to takie stezenie substratu (w mol/dcm3), przy ktorym reakcja osiaga polowa Vmax.
KM= k2+k-1/k1
V0=Vmax[S]/KM+[S].
Wyznaczanie wartosci KM oraz Vmax
1/V=1/Vmax+KM/Vmax*1/[S]
-wykres zaleznosc 1/v od 1/[S] nazywamy wykresem Lineweavera-Burka, jest linia prosta o nachyleniu rownym KM/Vmax, która przecina os 1/v w pkcie 1/vmax. Wartosci KM i Vmax można tez uzyskac przez wprowadzenie danych doswiadczalnych do ronwania, uzywajac programu komputerowego;
-KM oznacza takie stezenie substratu, przy ktorym polowa centrow aktywnych jest obsadzona.
-KM informuje o powinowactwie enzymow do substratu. Wysoka wartosc KM oznaccza slabe wiazanie substratu, a niska wartosc – silne wiazanie substratu.
-[S]<KM to V0 jest prost proporcjonalne do[S]
-[S]>KM toV- jest rowna Vmax
-[S] = KM to V0=1/2Vmax
-Vmax ronwa isie liczbie obrotow enzymu, czyli liczbie czasteczek substratu przeksztalconych w produkt przez czasteczke enzymu w jednostce czasu, przy pelnym wysyceniu enzymu. Liczba obrotow = k2=kkat (szybkosci powstawania produktu)
-Kkat/KM jest miara aktywnosci katalitycznnej enzymu, jeśli zawiera się w granicach 108-109/s/M mowimy o perfekcji katalitycznej enzymu.
Charakterystyczną cechą reakcji enzymatycznych jest zjawisko wysycania enzymu substratem. Obserwacje tego zjawiska doprowadziły Michaelisa i Menten do sformułowania teorii działania enzymów i ich kinetyki. Zgodnie z tą teorią enzym E tworzy z substratem S kompleks enzym-substrat ES, który następnie rozpada się na: produkt P i wolny enzym E.
k+1 k+2
E+S ES E+P
k-1
gdzie: k+1, k-1, k+2- stale szybkości odpowiednich przemian.
Energia kompleksu ES określa poziom, do którego w danych warunkach musi wzrosnąć energia układu reagującego, aby reakcja mogła przebiegać. Poziom energetyczny kompleksu ES jest wyższy od poziomu energetycznego substratu o wartość energii potrzebnej do zaktywowania substratu, czyli tzw. energii aktywacji. Tworzenie kompleksu ES obniża wartość energii aktywacji niezbędnej do zapoczątkowania reakcji i tym samym przyspiesza przebieg reakcji termodynamicznie możliwych.
Stężenie kompleksu jest tym większe przy stałym stężeniu enzymu, im wyższe jest stężenie substratu. Przy odpowiednio wysokim stężeniu substratu praktycznie wszystkie cząsteczki enzymu znajdują się w kompleksie ES, wówczas reakcja osiąga szybkość maksymalną V i staje się proporcjonalna do aktualnego stężenia enzymu:
V=k+2[E]=V
Przy stałym stężeniu enzymu szybkość reakcji zmienia się zależnie od aktualnego stężenia substratu. Zależność szybkoości reakcji enzymatycznej od stężenia substratu ujmuje równanie:
V={V[S]/(Km+[S])}
gdzie: Km - stała Michaelisa- Menten.
Przedstawiony wzór nosi nazwę rówwnania Michaelisa-Menten, a graficznie obrazuje go hiperbola.
Ważna zależność wynika z równania Michaelisa-Menten wtedy, gdy szybkość reakcji odpowiada połowie szybkości maksymalnej v= 1/2 V. Wówczas po przekształceniu równania otrzymuje się wartość: Km=[S], co pozwala zdefiniować stałą Km jako takie stężenie substratu (w molach na litr), przy którym szybkość reakcji enzymatycznej osiąga połowę szybkości maksymalnej.
Oznaczanie aktywności enzymów. Wskaźnikiem obecności czynnego enzymu jest stwierdzenie określonej przemiany chemicznej, którą on katalizuje. Natomiast o ilości enzymu wnioskuje się na podstawie szybkości reakcji w określonych warunkach stężenia substratu, pH mieszaniny reakcyjnej, temperatury itp. W odpowiednich warunkach szybkość reakcji- mierzona najczęściej ilością wytworzonego produktu lub ubytkiem substratu w jednostce czasu - jest proporcjonalna do ilości czynnego enzymu, czyli jego aktywności. Aktywność enzymu bowiem jest zmienna i zależy od wielu czynników, takich jak: stężenie substratu, czas trwania reakcji, temperatura, pH, hamowanie przez produkty itp. Dlatego pomiaru aktywności enzymów dokonuje się w tzw. warunkach optymalnych i w takim czasie, kiedy pozostaje ona stała, tj. przemiana przebiega według kinetyki reakcji zerowego rzędu.
Enzymy allosteryczne:
1. Enzym wykazuje kooperatywne wiazanie substratu
2. Krzywa kinetyczna dla enzymu allosteryccznego ma ksztalt sigmoidalny: przy stezeniu substratu, przy ktorym mniej niż polowa miejsc aktywnych jest wysycona substratem (Sc) enzym wykazuje niska aktywnosc. Przy stezeniu substratu wyzszym od (Sc) enzym jest bardzo aktywny.
3. W przypadku enzymow allosterycznych już niewielkie zmiany stezenia substratu skutkuja duzymi zmianami szybkosci katalizowanej reakcji.
Forma nieaktywna (T)- zahamowane wytwarzanie produktu:
-Zmiany konformacyjne- enzym jest zbudowany z podjednostek katalitycznych i regulatorowych
-regulacja allosteryczna- kiedy enzym jest w formie T do podjednostki regulatorowej może przyłączyć się inhibitor allosteryczny
-kooperatywnosc- przyłączenie pierwszej czesci inhibitora utrwala forme nieaktywna, a przyłączenie pierwszej czesci substratu przesuwa równowagę konformacyjna w kierunku R.
Forma aktywna (R)- produkt jest wytwarzany:
-kiedy enzym jest w formie R do podjednostki katalitycznej może przyłączyć się substrat.
Regulacja aktywności enzymow:
-wyrozniamy dwa podstawowe mechanizmy regulowania aktywnosci enzymow, a przez to procesow metabolicznych:
1. Regulacja syntezy bialek enzymatycznych zwiazana z funkcja kwasow nukleinowych;
2. Regulacja szybkosci dzialania enzymow juz istniejących.
-czynniki regulujace szybkosc dzialania enzymow juz istniejacych:
1. Strukturalne– uzalezniaja dzialanie enzymu od organizacji komorki
2. Kinetyczne– naleza do nich: stezenie enzymu i substratu, koenzymow, inhibitorow, temperatura, potencjal redoks, allosteria, modyfikacje kowalencyjne, aktywacja proteolityczna.
Sprzezenie zwrotne
W wielu reakcjach inhibitory biorą udział w mechanizmie regulacji aktywności enzymatycznej na drodze sprzężenia zwrotnego. Jeśli enzym produkuje jedną substancję ponad potrzeby komórki, to ta substancja może stać się inhibitorem dla tego enzymu, co zmniejsza lub całkowicie hamuje aktywność enzymu, co z kolei zmniejsza stężenie produktu. Taka regulacja jest formą ujemnego sprzężenia zwrotnego.
Inhibicja i inhibitory:
-zmiany aktywnosci enzymow sa wywolywane przez inaktywatory lub inhibitory
-inaktywatory dzialaja w sposob niespecyficzny i nieodwracalny, powoduja denaturacje bialka enzymatycznego
-inhibitory hamuja dzialanie enzymow w sposob specyficzny, wybiorczy
-Inhibicja: odwracalna [kompetycyjna (wspolzawodnicza); niekompetycyjna (niewspolzawodnicza)] i nieodwracalna;
-inhibitorami moga byc: metabolity komorkowe; leki, trucizny lub inne substancje obce dla organizmu (ksenobiotyki).
Inhibicja nieodwracalna:
-DFP (diizopropylofluorofosforan)– blokuje grupy -OH Ser w centrum aktywnym (CA) esterazy acetylocholinowej
-jodoacetamid– blokuje grupy –SH cysteiny w CA enzymow cysteinowych
-penicylina– blokuje grupy -OH Ser w CA transpeptydazy peptydoglikanu, enzym uczestniczacy w syntezie sciany komorkowej bakterii;
-CN (cyjanki) reaguja z jonami metali (Fe,Zn, Cu) w CA enzymow, hamuja enzymy lancucha oddechowego.
Wplyw temperatury na aktywnosc enzymow:
Temperatura moze dzialac na enzymy jako:
-aktywator– regula Van't hoffa– podwyzszenie temp o 10C powoduje okolo dwukrotny wzrost szybkosci reakcji enzymatycznych. Temperatura optymalna– szybkosc reakcji jest najwieksza;
-inhibitor– niska temperatura hamuje dzialanie enzymow ze wzgledu na niska energie kinetyczna reagujacych czasteczek;
-inaktywator– przy wzroscie temperatury powyzej optymalnej nastepuje gwaltowne obnizenie szybkosci reakcji, co jest zwiazane z denaturacja cieplna bialka enzymu.
Wplyw pH na aktywnosc enzymow:
Wplyw pH na aktywnosc enzymow zwiazany jest z wartoscia stalych dysocjacji:
-grup czynnych w centrum aktywnym enzymu uczestniczacych w wiazaniu substratu
-grup funkcyjnych w czasteczce substratu, ktorymi wiaze sie on z enzymem.
-grup funkcyjnych w czasteczce enzymu, od ktorych zalezy kataliza.
- innych grup w czasteczce enzymu, ktorych stan zjonizowania moze gwarantowac katalitycznie aktywna konformacje.
Kazdy enzym ma optymalna wartosc pH, przy ktorej szybkosc reakcji jest maksymalna. Niewielkie odchylenia od optimum pwoduja zmniejszenie szybkosci reakcji, a duze odchylenia prowadzi do denaturacji bialka enzymu.
Wplyw jonow metali na aktywnosc enzymow:
Jony metali moga pelnic funkcje:
-katalityczne– biorac udzial w katalizie, np. przenoszac elektrony (jony Cu2+, Fe2+)
-strukturalne– laczac podjednostki enzymow lub stabilizujac strukture przestrzenna enzymow
-aktywatorow– szereg enzymow wymaga obecnosci kationow lub anionow jako wewnatrzkomorkowych aktywatorow dzialania
-Metaloenzymy– enzymy, ktore do swojego dzialaniw wymagaja obecnosci jonow metali np dehyfrogenaza alkoholowa.
Fosforylacja/defosforylacja enzymow:
-fosforylacja polega na przeniesieniu koncowej grupy fosforanowej z ATP na grupe -OH Ser, Thr, Tyr w czasteczce enzymu
-jest katalizowana przez kinazy bialkowe
-reakcje defosforylacji katalizuja fosfatazy bialkowe
-kinaza bialek A jest aktywowana przez cykliczny adenozynomonofosforan (cAMP), ktory uwalnia jej podjednostki katalityczne.
Aktywacja proteolityczna:
Proteoliza jest jednym ze sposobow aktywacji enzymow i innych bialek biologicznie czynnych. Na drodze proteolizy nastepuje:
-aktywacja zymogenow protelitycznych enzymow trawiennych
-proces krzepniecia krwi
-aktywacja hormonow syntetyzowanych w postaci nieaktywnych prekursorow
-przeksztalcenie prokolagenu w kolagen
-kontrolowanie procesow rozwojowych (przeobraznie kijanki w zabe- przeksztalcenie prokolagenazy w kolagenaze)
-programowana smierc komorki (apoptoza)- przeksztalcenia prokaspaz w kaspazy.
Aktywacja proteolityczna– rola trypsyny:
-aktywacja proteolityczna jest procesem nieodwracalnym i nie wymagajacym dostarczenia energii. Polega na hydrolizie jednego lub kilku specyficznych wiazan peptydowych i odlaczeniu fragmentu bialka enzymatycznego, co umozliwia wytworzenie centrum aktywnego w czasteczce enzymu.
-trawienie bialka wymaga jednoczesnego dzialania kilku enzymow proteolitycznych, ktore musza byc jednoczesnie aktywowane
-trypsyna jest wspolnym akktywatorem wszystkich zymogenow trzustki.
Witaminy i koenzymy:
-Polski uczony Kazimierz Funk nadal nazwe witaminy skladnikom żywności, których brak powodowal objawy chorobowe
-WITAMINY to związki niskocząsteczkowe, o zróżnicowanej budowie chemicznej pełniące w organizmach zwierzęcych funkcje regulacyjne
-Klasyfikacja witamin opiera się na ich rozpuszczalności:
*witaminy rozpuszczalne w wodzie: wit. z grupy B, Wit. C, P, cholina
*witaminy rozpuszczalne w tluszczach: wit. A, D, E, K
-Awitaminozy, hipowitaminozy to schorzenia spowodowane brakiem lub niedoborem witamin
-witaminy sa prekursorami koenzymow.
Koenzymy prostetyczne- jak dzialaja enzymy i grupy prostetyczne:
-koenzym (grupa prostetyczna) wiaze się z substratem za pośrednictwem określonych grup chemicznych
-koenzym może się wiazac z enzymem wiazania niekowalencyjnymi lub kowalencyjnymi
-koenzym i grupa prostetyczna mogą być rozpatrywane jako drugi substrat, ponieważ zmiany chemiczne w koenzymie rownowaza zmiany zachodzące w substracie, np. w reakcji red-ox jednoczesnie z utlenianiem substratu zachodzi redukcja czasteczki koenzymu
L-mleczan +NAD+ <-LDH-> L-pirogronian+ NADH
LDH- dehydrogenaza mleczanowa.
Klasyfikacja koenzymow
-koenzymy przenoszące protony H+ i elektrony e-: NAD+, NADP+, FAD, FMN, LipS2, ubichinon. Te koenzymy wspoldziaja z oksydoreduktazami;
-koenzymy przenoszące inne grupy niż H+ i e-: Co A, PLP, DPT, biotyna, koenzym B12, Co F, ATP, GTP, CTP, UTP. Te koenzymy wspoldziaja z transferazami, izomerazami, liazami i ligazami.
PLP – fosforan pirydoksalu
DPT – difosforan tiaminy
CoF (THF) – koenzym F inaczej kwas tetrahydrofoliowy
LIP S2 – lipoamid
NAD+ - dinukleotyd nikotynamidoadeninowy
NADP+ - fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego
FAD – dinukletoyd flawinoadeninowy
FMN – mononukleotyd flawinoadeninowy
Witamina C uczestniczy w wielu procesach metabolicznych (dostarcza protony i elektrony do reakcji chemicznych):
-bierze udzial w hydroksylacji proliny
-bierze udzial w degradacji tyrozyny
-uczestniczy w syntezie adrenaliny, kwasow żółciowych, steroidow
-ulatwia wchłanianie żelaza w przewodzie pokarmowym
-hamuje powstawanie nitrozo amin w procesie trawienia.
Metabolizm, pojecia podstawowe:
-metabolizm- to suma wszystkich procesow fizycznych i chemicznych, dzieki którym organizmy powstaja i utrzymuja się przy zyciu. Sa to wszystkie przekształcenia chemiczne i energetyczne przebiegające w Komorkach organizmow;
-anabolizm- to procesy metabolizmu komorkowego prowadzace do syntezy związków o zlozonej strukturze gromadzących w swoich wiazaniach energie;
-katabolizm- to procesy metabolizmu komorkowego polegajace na rozszczepianiu duzych czasteczek związków organicznych stanowiących źródło energii użytecznej, gromadzonej w postaci ATP. Mogą przebiegac w warunkach tlenowych i beztlenowych.
Glowne zadania metabolizmu:
-wytwarzanie ATP
-wytwarzanie sily redukcyjnej w postaci czasteczek NADH i NADHP
-wytwarzanie substratow dla procesow biosyntetycznych.
Typy reakcji chemicznych w metabolizmie:
-reakcja oksydoredukcyjna- przeniesienie elektronow;
-ligacja wymagajaca rozszczepienia ATP- tworzenie wiazania kowalencyjnego (np. wiazania C-C);
-izomeryzacja- rearanzacja atomow prowadzaca do powstania izomerow;
-przeniesienie grupy- przeniesienie grupy funkcyjnej z jednej czasteczki na druga;
-hydroliza- rozszczepienie wiazania z udzialem wody;
-dolaczenie lub odlaczenie grupy funkcyjnej-dodanie grupy funkcyjnej do wiazania podwojnego lub jej usuniecie z utworzeniem wiazania podwojnego
Fosforylacja oksydacyjna- to proces powstawania ATP napedzany transportem elektronów z substratów oddechowych na tlen. W procesie tym posredniczy siła protonomotoryczna wytworzona przez gradient pH i ró_nice
potencjału elektrochemicznego na wewnetrznej błonie mitochondrialnej.Fosforylacja oksydacyjna zachodzi w
błonie komórkowej organizmów prokariotycznych i w wewnetrznej błonie mitochondrialnej organizmów
eukariotycznych.
ENERGETYKA CYKLU KWASU CYTRYNOWEGO
• Z ka_dej czasteczki NADH w fosforylacji oksydacyjnej powstaja 2.5 czasteczki ATP.
• Z ka_dej czasteczki FADH2 w fosforylacji oksydacyjnej powstaje 1.5 czasteczki ATP.
• W cyklu kwasu cytrynowego zachodza :
• Trzy odwodorowania z udziałem NAD+ 3NADH 7.5 ATP
• Jedno odwodorowanie z udziałem FAD FADH2 1.5 ATP
• Jedna fosforylacja substratowa GTP 1 ATP
• _10 ATP na jedna czasteczke acetylo-CoA, czyli 20 na jedna czasteczke glukozy.
FUNKCJE CYKLU KWASU CYTRYNOWEGO
1. Jest to główny szlak rozkładu czasteczek
aminokwasów,sacharydów i kwasów
tłuszczowych do dwutlenku wegla i wody.
2. Dostarcza czasteczki zredukowanych
koenzymów NADH i FADH2 , które sa utleniane
w łancuchu oddechowym dajac ATP.
3. Cykl kwasu cytrynowego dostarcza substraty do
reakcji biosyntetycznych (patrz rysunek)
REAKCJE ANAPLEROTYCZNE
Reakcja
Pirogronian + CO2 +ATP + H2O szczawiooctan + ADP + Pi
Fosfoenolopirogronian + CO2 + GDP szczawiooctan + GTP
Pirogronian + CO2 + NADH + H+ jabłczan + NAD+
Cykl glioksalowy
2 acetylo-CoA + NAD+ + 2H2O__ bursztynian +2CoA +NADH +2H+
Proces wykorzystywany do wzrostu i wytwarzania cukrów z
acetylo-CoA. Przebiega w glioksysomach roslin
wy_szych i komórkach mikroorganizmów. Nie wystepuje
w organizmach zwierzecych. W jednym obrocie cyklu
zu_ywane sa dwie czasteczki acetylo-CoA pochodzace z
octanu lub z rozkładu tłuszczów. Enzymy specyficzne dla cyklu glioksalowego: 1) liaza izocytrynianowa;
2) syntaza jabłczanowa.
REAKCJE KATALIZOWANE PRZEZ KOMPLEKS
DEHYDROGENAZY PIROGRONIANOWEJ
• Etapy reakcji:
1. Pirogronian wia_e sie z DPT i ulega dekarboksylacji, jednoczesnie powstaje difosforan (pirofosforan)
hydroksyetylotiaminy. Reakcja przebiega z udziałem E1.
2. Grupa hydroksyetylowa tiaminy zostaje utleniona do grupy acetylowej i przeniesiona na kwas liponowy, który
ulega redukcji. Powstaje acetylolipoamid. Reakcje katalizuje E2.
3. Grupa acetylowa jest przenoszona na CoA ( koenzym A), reakcje katalizuje E2.
4. Zredukowany lipoamid ulega regeneracji z udziałem E3, FAD i NAD. Powstaje NADH.
5. Kompleks dehydrogenazy pirogronianowej gotowy do
katalizowania reakcji
ŁANCUCH TRANSPORTU ELEKTRONÓW
• Transport elektronów przez łancuch
oddechowy jest wymuszony różnica
potencjału redoks miedzy NADH i O2.
• Eo
’ dla NADH wynosi – 0,32 V
Eo
’ dla O2 wynosi + 0,82 V.
NADH + H+ + ½ O2 NAD+ + H2O
D Eo
’ = 0,82 – (-0.32)= +1.14 V
DGo
’ = - nF D Eo
’
DGo
’ = -2 x 96,556kJ·V-1·mol-1x 1,14V = - 220kJ/mol
n – ilosc przeniesionych elektronów
F – stała Faradaya
D Eo
’ – zmiana potencjału redoks
DGo
’ – energia swobodna wydzielana podczas
reakcji utleniania.
ADP + Pi + H+ ATP + H2O _G0’ = 30,5kJ/mol
Cykl Q
• Mechanizm sprzegajacy przeniesienie elektronów z QH2
na cyt.C.
• Dwie czasteczki QH2 zostaja utlenione.
• Jedna czasteczka Q ulega redukcji do QH2.
• Dwie czasteczki cyt.C ulegaja redukcji.
• Cztery protony sa uwalniane do przestrzeni miedzybłonowej, a dwa zostaja pobrane z matrix co
przyczynia sie do powstania gradientu protonowego po
obydwu stronach wewnetrznej błony mitochondrialnej.
DZIAŁANIE POMP PROTONOWYCH
• Dehydrogenaza NADH (reduktaza NADH- Q )
NADH + Q + 5H+ matriks NAD+ + QH2 + 4H+ cytozol
• Reduktaza cytochromowa
QH2 + 2 cyt cutleniony + 2H+ matriks Q + 2cyt czred + 2H+ cytozol
• Oksydaza cytochromowa
4cyt czred + 8H+ matriks + O2 4cyt cutl + 2 H2O + 4H+
cytozol
DZIAŁANIE SYNTAZY ATP
• Hipoteze działania syntazy ATP sformułował Paul
Boyer przy współpracy z J. Walkerem. .Nagroda
Nobla w dziedzinie chemii – 1997r.
• Podjednostki ß syntazy ATP posiadaja miejsca
katalityczne - miejsca wiazania nukleotydów: ADP
+Pi oraz ATP.
• Podjednostki ß syntazy ATP sa funkcjonalnie
nierównowa_ne:
• miejsce katalityczne w formie O - otwarte – ma
znikome powinowactwo do substratów;
• miejsce katalityczne w formie L – luzno wia_e
substraty i nie ma aktywnosci katalitycznej;
• miejsce katalityczne T – mocno wia_e substraty
( ADP i Pi ) i jest katalitycznie aktywne.
• Energia wniesiona przez przepływ protonów przez
kanał Fo, powoduje zmiane konformacji miejsc
katalitycznych: T przechodzi w O, L w T a miejsce
O w L.
• Te zmiany konformacyjne zachodza
prawdopodobnie na skutek rotacji podjednostek ß
wzgledem podjednostki g. Podjednostka g przenosi
energie protonów i wymusza transformacje miejsca
T w miejsce O, aby nastapiło odłaczenie ATP
Utleniania glicerolu
Fosfodihydroksyaceton:
glukoneogeneza glukoza
glikoliza pirogronian acetylo-S-CoA CKT, lancuch oddechowy
Katabolizm kwasow tluszczowych
I etap- utlenianie kwasow tluszczowych:
-uwalnianie acetylo-CoQ
-uwalnianie NADH i FADH2.
II etap- utlenianie acetylo-CoA
-wytwarzanie NADH i FADH2
-wytwarzanie GTP (ATP).
III etap- utlenianie zredukowanych koenzymow za pośrednictwem lancucha oddechowego.
Aktywacja kwasow tluszczowych:
-rozpad kwasow tluszczowych w komorkach eukariotycznych zachodzi w matriks mitochondrialnej
-przed wejściem do mitochondrium kwasy tluszczowe ulegaja aktywacji przez utworzenie wiazania tioestrowego z CoA
-reakcja jest katalizowana przez syntetaze acetylo-CoA i zuzywa ATP.
Synteza kwasow tluszczowych versus beta-oksydacja
Porównanie syntezy kwasow tluszczowych z degradacja kwasow tluszczowych:
-synteza przebiega w cytozo lu, a degradacja w matriks mitochondrialnej
-produkty pośrednie syntezy kwasow tluszczowych sa kowalencyjnie związane z grupa –SH białkowego nosnika reszt acylowych (ACP), a produkty pośrednie degradacji kwasow tluszczowych sa związane z grupa –SH Co A
-synteza jest katalizowana przez synteza kwasow tluszczowych, która jest wielofunkcyjnym kompleksem enzymatycznym zlokalizowanym w pojedynczym lancuchu polipeptydowym. Enzymy uczestniczace w degradacji sa pojedynczymi, odrębnymi bialkami
-lancuch kwasu tluszczowego ulega wydłużaniu przez dolaczanie kolejnych jednostek dwuweglowych, pochodzących z acetylo-CoA. Bezpośrednim, aktywowanym dawca tych jednostek dwuweglowych jest malonylo-ACP. Podczas degradacji uwalniane sa czasteczki acetylo-CoA
-reduktorem w procesie biosyntezy kwasow tluszczowych jest NADPH. Utleniaczami w procesie degradacji kwasow tluszczowych sa NAD+ i FAD.
Transport kwasow tluszczowych do mitochondriow:
-o krotkich lancuchach latwo przenikaja przez wewnetrzna blone mitochondrialna
-czasteczki kwasow tluszczowych o dlugich lancuchach sa transportowane do matrix przez specjalny przenośnik- translokaze
-reszty acylowe o dlugich lancuchach sa przenoszone do wnętrza mitochondrium po sprzężeniu z karnityna
-rekakcja sprzegania katalizowana jest przez acylotransferaze karnitynowa I i polega na usunieciu CoA oraz zastapieniu go czasteczka karnityny; nastepnie translokaza karnityna transportuje acylokarnityne przez wewnetrzna blone mitochondrialna; po przeniesieniu czasteczki karnityny sa uwalniane, czemu towarzyszy przeniesienie grupy acylowej z powrotem na CoA- katalizuje acylotransferaza katnirynowa II
Synteza kwasow tluszczowych przebiega w cytozolu to acetylo-CoA musi zostac przetransportowany z mitochondriow do cytozolu; ulega on najpierw kondensacji ze szczawiooctanem, tworząc cytrynian, który latwo pzenika przez blone; w cytozolu cytrynian ulega rozszczepieniu, co umozliwia odtworzenie czasteczki acetylo-CoA.
Wiazanie peptydowe
Długość wiązania peptydowego wynosi 1,32 Å.
Angstrem (Å ) to jednostka długości. 1Å = 10-10 m =0,1 nm
Elektrony wiązania C=O oraz wolna para elektronów przy N ulegają delokalizacji, wiązanie C-N (peptydowe) staje się polarne i może występować w postaci form tautomerycznych (rezonansowych).
Ugrupowanie C=O staje się anionem (-) natomiast N-H jest kationem (+), a wiązanie C – N w około 40% ma charakter wiązania podwójnego.
Wiazanie peptydowe-udzial 2-aminowych grup i 2-karboksylowych.wystepuje pomiedzygrupa karboksylowa jednego aminokwasu i grupa aminowa(N-h)drugiego.
BIAŁKO Medoty oznaczania zawartości białka oparte są na charakterystycznych cechach jego budowy:
-obecnośc azotu w składzie pierwiastkowym; -obecność reszt aminokwasów aromatycznych; -występowanie wiązań peptydowych; -wystpowanie wolnych grup aminowych
Białka
Struktura pierwszorzędowa białek to liniowa sekwencja aminokwasów w łańcuchu. Jest stabilizowana przez wiązania peptydowe oraz jest zdeterminowana genetycznie.
Struktura drugorzędowa – to sposób pofałdowania łańcucha polipeptydowego bez uwzględnienia oddziaływań pomiędzy łańcuchami bocznymi aminokwasów. Do struktur drugorzędowych należą: α-helisa i ß-harmonijka.
Struktura trzeciorzędowa – to dodatkowe zwinięcie w przestrzeni struktur drugorzędowych. Powstaje w wyniku oddziaływań pomiędzy łańcuchami bocznymi aminokwasów.
Struktura czwartorzędowa – występuje w białkach o budowie podjednostkowej. Podjednostki (monomery) mogą łączyć się ze sobą tworząc cząsteczkę zwaną oligomerem.
Glicyna-to najprostszy aminokwas nie zawierający asymetrycznego atomu węgla, przez to jest zw. achiralnym. Pozostałe aminokwasy zawierają taki atom węgla i są związkami chiralnymi i występują w dwóch formach stereoizomerycznych. zdj
Wg grupy R wyróżniamy aminokwasy z gr: niepolarną(alanina, walina, fenyloalanina, prolina) Polarną ale bez ładunku(seryna, cysteina, tyrozyna) o ładunku ujemnym(kwas asparaginowy, glutaminowy) o ład. Dodatnim (lizyna, arginina, histydyna) Zdj- formy występowania aminokwasów.
R.ninhydrynowa- wykrywanie w roztworze wolnych aminokwasów, reagują gr 2-karboksylowa i 2-aminowa-po podgrzaniu powstaje niebieskofioletowy produkt(prolina, hydroksyprolina, cysteina, cystyna dają żółtą barwę) Zdja r ninhydryny
R.ksantoproteinowa- wykrywanie aminokwasów zawierających gr aromatyczną, HNO3 +nitrowe pochodne pierścienie aromatyczne dają w śr.zas. zabarwienie pomarańczowe
-SH-wykrywanie grup hydrosulfidowych traktując roztwory NaOH+temp powoduje wydzielanie siarkowodoru, który z solami ołowiawymi tworzy czarny nierozpuszczalny osad.
Denaturacja-niszczenie wtórnej struktury (wiązań wodorowych i oddziaływań hydrofobowych) na nie zniszczona pozostaje struk. Pierwotna(wiąz. Peptydowe). Proces następuje na skutek: podwyższonej temp, nieodpowiedniego pH, wysokich stężeń soli metali ciężkich, rozpuszczalników organ, Rezultat- białko wypada w postaci osadu.
Aktywność białka zależy od jego konformacji.
Wysalanie- metoda frakcjonowania białek za pomocą siarczanu amonowego, ma to charakter odwracalny i wiąże się ze stopniem uwodnienia zdysocjowanych grup aminokwasowych, najlepiej przeprowadzać to w punkcie izoelektrycznym, wytrąca się osad.
Charakterystyczną cechą reakcji enzymatycznych jest zjawisko wysycania enzymu substratem: E+S ES E+P
1. wl aminokwasow
a. Odróżnianie aminokwasów od innych związków organicznych. Odmierzyć do jednej probówki 1 ml glicyny (/), do drugiej 1 ml białka , dodać po 1 ml ninhydryny i ogrzewać mieszaninę przez 3 min we wrzącej łaźni wodnej.. Reakcja nihydrynowa-wykrywa wolne aminokwasy w roztworze bierze w niej udzial grupa 2-karboksylowa i 2-aminowa.w obecnosci wolnego aminokwasu i nihydryny po podgrzaniu powstaje niebieskofioletowy produkt kosdensacji(prolina,hydroksyprolina,cysteinai cystyna daja produkt o zabarwieniu zoltym
b. . Odróżnianie białek (względnie peptydów) od wolnych aminokwasów. Odmierzyć do jednej probówki 1 ml białka ), do drugiej 1 ml glicyny ), dodać po 2 ml wodorotlenku sodowego ) i jedną kroplę siarczanu miedziowego ), dobrze wymieszać i dodać kroplami dalsze 0,5 ml siarczanu miedziowego ). Reakcja biuretowa piotrowskiego – wykrywa wiazania peptydowe w bialku (co njamniej 2), polega na zdolnosci tworzenia przez jony miedziowe w srodowisku zasadowym fioletowego kompleksu z tymi wiazaniami.najprostszym zwiazkiem dajacym taka reakcje jest biuret.
c. Reakcja ksantoproteinowa, próba ksantoproteinowa - reakcja białek zawierających aminokwasy z pierścieniami aromatycznymi (np. tryptofan) ze stężonym kwasem azotowym(V). W wyniku znitrowania aromatycznych ugrupowań powstaje trwałe, żółte zabarwienie.
Wykrywanie aminokwasów zawierających pierścień aromatyczny. Odmierzyć do jednej probówki 1-ml glicyny , do drugiej 1 ml białka ) (białko jaja kurzego zawiera znaczne stężenie aminokwasów aromatycznych i może być użyte jako ich źródło) i dodać po 1 ml
d. Wykrywanie aminokwasów zawierających grupy hydrosulfidowe . Odmierzyć do jednej probówki 1 ml glicyny, do drugiej 1 ml białka, do każdej dodać po 2 ml wodorotlenku sodowego oraz po 0,5 ml octanu ołowiawego i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez
3-5 min.
e. Koagulacja cieplna białka. Odmierzyć do probówki 1 ml białka (3) i ogrzewać nad
palnikiem do wrzenia.
f. Wytrącanie białka kwasem. Odmierzyć do probówki 1 ml białka (5) i dodać 1 ml kwasu trichlorooctowego .
g. Wytrącanie białka solami metali ciężkich. Odmierzyć do probówki 1 ml białka (3) I dodać kroplami 1 ml octanu ołowiawego (8).
i. Wysalanie białka. Wysalanie białek – strącanie białek z roztworów poprzez dodanie stężonego roztworu soli. Proces jest wynikiem zaburzenia otoczki solwatacyjnej i agregacji cząsteczek białek w wyniku łatwiejszego kontaktu pomiędzy polarnymi grupami sąsiadujących cząsteczek. Do wysalania stosuje się sole metalu lekkiego (oprócz KCl) lub amonu, np. siarczanu amonu. Proces ten jest przejściem zolu w żel (koagulacja), nie narusza struktury białka (także czwarto- i trzeciorzędowej) i jest odwracalny (nie powoduje denaturacji). Wykonanie?:Do kolby stożkowej na 100 ml odmierzyć 10 ml roztwom białka jajka kurzego (2), dodać taką samą objętość nasyconego roztworu siarczanu amonowego (10) i wymieszać. Wytrącają się w tych warunkach globuliny. Część mieszaniny przesączyć przez sączek z bibuły i przesącz zebrać do suchej kolby stożkowej.
Do przesączu dodać małymi porcjami, mieszając, sproszkowany siarczan amonowy az do nasycenia roztworu. Przesączyć ok. 1 ml roztworu przez sączek z bibuły do probówki dodać kroplę kwasu octowego (12) i ogrzewać do wrzenia. Brak osadu świadczy o usuniciu bialka z roztworu
Denaturacja białka - zmiany w II, III- i IV-rzędowej strukturze białka natywnego, które prowadzą do utraty aktywności biologicznej lub innej indywidualnej cechy charakterystycznej przy zachowaniu jego struktury pierwszorzędowej.
Podczas denaturacji niszczone są wiązania wodorowe.
2 fotometryczne oznaczanie zawartosci bialka
Metody fotometryczne- wykorzystuje się w nich zjawisko pochlaniania promieniowania elektromagnetycznego przez rozne substancje pomiar absorpcji swiatla może być miara ilosci substancji absorbujacej i jest podstawa fotometrycznej analizy jakosciowej.
Metoda biuretowa-oparta na tworzeniu przez bialka i peptydy w srod zasadowym barwnyc komplekosw z jonami miedziowymi.rzadko stosowana ze względu na niska czułość.
Metoda Lowryego-wykorzystuje 2 cechy budowy bialek-obecnosc wiazania peptydowegooraz obecnosc aminokwasow aromastycznych – tyrozyny i tryptofanuoraz jednego siarkowego cysteiny.reakcja biuretowa jest w tej metodzie wzmocniona jest reakcja z odczytnnikiem Folina i Ciocalteu w ktorej kwas fosforomolibdenowy i fosforowolframowy ulega redukcji do blekitu fosforomolibdenowego którego stezenie można mierzyc kolorymetrycznie i stezenie bialka odczytac z krtzywej wzorcowej
Wykonanie:
1. Sporządzanie krzywej wzorcowej. Do probówek odmierzyć w 2 powtórzeniach po 1 m1 z 5 kolejnych roztworów wzorcowych białka {3 ), a do próby kontrolnej zamiast białka
odmierzyć 1 ml wody. Do wszystkich probówek dodać po 5 ml odczynnika miedziowego ,
wyrnieszać i po 10 min dodać po 0,5 ml odczynnika Folina (2) i całość wymieszać. Po 30 min
zirerzyć intensywność zabarwienia w fotometrze (przy 670 nm) nastawiając przyrząd na zero
wobec próby kontrolnej. Na podstawie uzyskanych wartości absorbancji (A) wykreślić
krzywe zależności absorbancji od ilości białka w próbie.
2. Oznaczanie zawartości białka (np. w mleka). Roztwór białka (mleka) otrzymany w kolbce miarowej na 50 ml należy dopełnić do kreski wodą i dokładnie wymieszać. Do 2 probowek2 odmierzyć po 1 ml roztworu z kolbki i dalej postępować jak przy sporządzaniu krzywej wzorcowej. Próbę kontrolną potrzebną przy pomiarze sporządzić równolegle z próbą badana lub użyć próby przygotowanej przy sporządzaniu krzywej wzorcowej.
Absorbancja-jest to wygaszanie swiatla przez barwny roztow i nosi nazwe tez ekstynkcji.
Prawo Lamberta-ujmuje wprost proporcjonalna zależność miedzy grubością warstwy badanego rzotowru a ilością pochłoniętego przez ten roztwor swaitla,wyrazana jakos logarytm stosunku natezniea swiatla padającego do antezenia swaitla przechodzącego.
Prawo Beera-okresla wprost proporcjonalna zależność miedzy stężeniem subst a ilością swiatla pochlnietego.
Prawo Lamberta Beera-ujmuje zależność miedzy ilością swiatla pochlnietego a stężeniem i grubością barwnego roztworu.
Pomairy fotometryczne SA zap omoca fotometrow lub spektofotometrow wyposażonych w fotoogniwa które sluza do pmairow natężenia swiatla przechdozacego prsez roztwor pochlaniajacy oraaz przez probe odniesienia.
3.wplyw czynnikow na aktywnosc enzymow (fosfataza kwasna)
-wplyw temperatury- w miare wzrostu temp reakcja enzymatyczna podobnie jak kazda reakcja chemiczna poczatkowo ulega przyspieszeniu w zwiazku z dost. En. Cieplnej . podwyzszenie temp przyspiesza szybkosc reakcji zgodnie z regula van???t Hoffa(podwyzsz. Tem. O 10C powod. Około dwukrotnywzrost szybk.reakcji)w okreslonej temp. Zostaje osiagniete optimum dzialania enzymu a przy dalszym jej wzroscie nastepuje gwaltowny spadek szybkosci reakcji co jest zwiazane z denaturacja cieplna bialka enzymu. Optymalna temp.dzialania wiekszosci enzymow to 30-50 C (może się zmienic w zaleznosci od okresu trwania reakcji) wykonanie: 1. Do trzech probówek odmierzyć po 1 ml roztworu enzymu i po 1 ml buforu fosforanowego o pH = 7,0 . Pierwszą probówkę umieścić w temp. 0°C (woda z lodem), drugą w temp. 40°C, a trzecią w temp. 100°C (wrząca woda). Po doprowa dzeniu zawartości probówki do odpowiedniej temperatury (przez ok. 3 min) wyjąć probówkę z wrzącej łaźni wodnej i schłodzić jej zawartość, a następnie wstawić do łaźni o temp. 40°C. Odmierzyć do tak przygotowanych probówek po 1 ml roztworu mocznika , wymieszać zawartość probowek i inkubowac 10 minut. Nastepnie przerwac reakcje dodajac po 1 ml kwasu solnego do kazdej probowki uzupelnic woda do 9 ml i dodac po 1 ml odczynnika Nesslera
2. -Wplyw pH-najwieksza szybkosc dzialania enzymu pH-5-7 może ulegac pewnym zmianom zaleznie od stopnia czystosci preparatu enzymu i temperatury srodowiska. Wykonanie: Wpływ stężenia jonów wodorowych. Do trzech probówek odmierzyć po 1 ml roztworu enzymu i po 1 ml buforów: do pierwszej octanowego , do drugiej fosforanowego i do trzeciej boranowego . Umieścić probówki w łaźni wodnej o temp. 40°C, dodać po 1 ml mocznika , zawartość probówek wymieszać i inkubować przez 10 min. Następnie dodać do probówek po 1 ml kwasu solnego , uzupełnić wodą do 9 ml i dodać po 1 ml odczynnika Nesslera .
4.Witamina C-kwas askorbinowy
kwas askorbinowy ma wlec silnie redukujace ponieważ ma ugrupowanie pomiedzy C-2 i C-3,zwane en-diolowym,latwo oddaje dwa protony i dwa elektrony przechodząc w ugrupowanie diketonowe kwasu dehydroaskorbinowego.czynniki sprzyjające rozkładowi witaminy c:obecność tlenu,środowisko obojętne lub zasadowe,obecność enzymow utleniających oraz jonow metali,takich jak żelazo,miedz i srebro.
-rozpuszczalny w H2O
-nie jest koenzymem
-Rodzaj typowej reakcji →Antyutleniacz
-Konsekwencje nieodboru → Szkorbut (opuchnięte i krwawiące dziąsła, krwotoki podskórne).
Witamina C uczestniczy w wielu procesach metabolicznych (dostarcza protony i elektrony do reakcji chemicznych):
bierze udział w hydroksylacji proliny
bierze udział w degradacji tyrozyny
uczestniczy w syntezie adrenaliny, kwasów żółciowych, steroidów;
ułatwia wchłanianie żelaza w przewodzie pokarmowym
hamuje powstawanie nitrozoamin w procesie trawienia
Oznaczanie Kw.Askorbinowego -wykorzystanie właściwości redukcyjnych kwasu askorbinowego, który w środowisku kwaśnym redukuje:jod, błekit metylenowy, żelazicyjanek,
2,6-dichlorofenoloindofenol (najszybciej wchodzi w reakcję z kwasem).
Wg E.Pijanowskiego –przy małej zawartości kwasu dehydroaskorbinowego, redukuje się go siarkowodorem do kwasu askorbinowego. Nadmiar siarkowodoru wytrącony w postaci siarczku przez chlorek rtęciowy.
Oznaczenie kw.Ask. przeprowadza się metodą miareczkowania i kolorymetryczną.
M. Miareczkowa-polega na utlenieniu kwasu za pomocą mianowanego roztworu barwnika(dlatego-metoda oksydymetryczna) 2,6-dichlorofenoloindofenolu. Zawartość kwasu określa się przez ilość zużytego mianowanego roztworu barwnika. Barwnik w środ. kwaśnym w formie utlenionej-różowy, w formie zredukowanej-bezbarwny. Stałe różowe zabarwienie powstaje podczas miareczkowania po całkowitym utlenieniu kwasu askorbinowego,gdy dodamy pierwsza kroplę nadmiaru barwnika.
5.Monosacharydy-grupa karbonylowa+gr hydroksylowa np.(CH2O)n.(fruktoza,glukoza)
Oligosacharydy-od dwu do 10 jedn monosachardow polaczen wiazaniem glikozydowym(sacharoza,laktoza)
Polisacharydy-dlugie lancuchy monosahcarydow,nierzoglazeione(celuloza) i rozgalzeione(amylopektyna glikogen.)zastosowanie sacharydow-magazynowanie i uruchaminia energii,funkcje strukturalne.
SACHARYDY CUKRY
Wszystkie monosacharydy mają właściwości redukujące. Właściwości nieredukujące maja disacharydy których wiązanie glikozydowe utworzone jest z udziałem obydwu wegli acetylowych.
Reakcja BENEDICTA śr.zasad. nastepuje utlenienie sacharydów red. Do odpowiednich hydroksykwasów a jonu cu2+redukuja się do jonów Cu+ wypadających z roztworu w postaci nierozp tlenku miedziowego.Wykonanie:dla sacharydow redukujących,odmierzyc do 3 probowek po 1ml do pierwszej glukozy,2-maltozy,3-sacharozy.dodac po 2,5ml odczynnika Benedicta i ogrzac przez kilka minut w lazni wodnej.do 4 prob dodac sacharozy 1ml i dodac 2 krople stzeoneho hcl i ogrzac nad palnikiem.ostudzic i dodac 2,5 bededicta i kikla minut w lazni.
Reakcja BARFOEDA śr.słabo kwaś. Redukcja jonów miedziowych. tylko w roztworze monosacharydu pojawi się czerwony osad tlenku miedziawego. Dla monosacharydow redukujacyh.do 1 1ml glukozy do drugiej1ml maltozy,dodac po 2,5ml barfoeda ogrzac 3min w lazni.
Reakcja MOLISCHA wszystkie sacharydy po odwodnieniu kwasem siarkowym dają z a-naftolem fioletowo zabarwiony produkt kondensacji.dla wszystkich sacharydow,do 2 prob po 1 ml dowolnych sacharydow.dodac po 2 krople a-naftanolu wymieszac i wprowadzic po 3 krople stez kwasu siarkowego.
Reakcja BIALA pentozy przekształcają się w furfanal kondensujący z orcynolem w wyniku czego powstaje produkt o barwie zielonej.dla pentoz,do 2 porobwek po 5ml biala i ogrzac 5min w lazni.do 1 1ml arabinozy a 2-1ml glukozy ogrzac przez 5minut.
Odczynik SELIWANOWA zawiera rezocynol który z produktem odwodnienia ketoz hydroksymetylofurfuralem daje barwę łososiową. Dla ketoz,do 1-1mlfrkutozy do 2-1ml glukozy dodac po 3ml seliwanowa i ogrzac 1min w lazni.
6.Α i β amylaza-sa to enzymy amylolityczne.naleza do klasy hydrolaz.Rozkladaja one skrobie,glikogen oraz okrewne imoligo-i polisacharydy.w katabolizmie bierze tez udziela enzym glukoamylaza.
α-amylaza katalizuje rozrywanie Wizan α-1,4-glikozydowych wew.czasteczki substratu a produktami jej dzialania SA poczatkowo dekstryny wysokocząsteczkowe,przechodzące w miare przebiegu reakcji w dekstryny.produktami hydrolizy polisacharydow-skrobi,glikogenu i amylopektyny z udzialem a-amylaz SA gownie:maltotrioza,izomaltoza,maltoza,glukoza.w wyniku dzialania tego enzymu jest szybki spadek lepkości substratu zmiana zabarwienia kompleksu jodem i i przyrost redukcyjności.
Β-amylaza-dziala na substrat od strony nieredukującego konca lancucha i dlatego nazwa inna egzomylaza.hydrolizuje co drugie wizanie a-1,4-glikozydowe odrywając jednostki b-maltozy.w wyniku dzialania tego enzymu na substraty rozgalzeione produktami SA b-maltoza i wycoeczasteczkowa dektryna graniczna.enzym ten ma pochodzenia roślinnego pH 4-5,5 a b-amylazy bakteryjne dzialja optymalnie 6-7.
Glukoamylaza-wytwarzana przez drobnoustroje,wystpuje tz w tkankach zwierzęcych.katalizuje hydrolize wiazan a-1,4 i 1,6 glikozydowych oraz nielicznie wysttepujacych Wizan 1,3,odrywając kolejno jednostki glukozy od nieredukującego konca czasteczek wielocukru.przegrupowanie waldena wystpuje przez co glukoza uwalnia się w formie B.obserwuje się przyrost szybki redukcyjności na skrobie,zmiane barwy jodem i spdek lepkości.dzialanie enzymem na skrobie,glikogen,amyloze i amylopektyne i pochodne jest glukoza.
Amylazy działaj na substrat-niezaleznie od długości lancucha i stopnia rozglaeznienia rozrywaja wiazania glikozydowe pomiedzy weglem glizkodyowym a tlenem wiazania glikozydowego.sposob dziania warunkuje budowa ich centrum aktywnego i substratu i od pH,tepm i obecności inhibiotrow. Do oznaczenia a-amylazy stosuje się pomiar zabarwienia skrobi z jodem po określony casie inkubacji z enzymem.aktywnosc b-amlyazy i glukoamylazy oznacza się stosując pomiar przyrostu redukcyjności.moze być tez ale to do wszystkich spadek lepkości,zmiana natężenia fluorescencji.reakcja z jodem(czerwone,fioletowe).,reakcja z odcz Benedicta i barfoeda.ceglasotczerwony osad.
Oznaczenie Aktywności B amylazy słodowej metodą bernfelda. Zasada metody. W metodzie bernfelda wykorzystuje się właściwości redukujące maltozy i innych cukrów, które w środowisku zasadowym redukuja grupy nitrowe kwasu 3,5dinitrosalicylowego DNS do grup aminowych. Powstałe pochodne aminowe mają barwę pomarańczową której intensywnośc zależy od ilści w próbie cukrów redukujących( głownie b-maltozy) uwalnianych podczas działania enzymu, dlatego reakcja ta może Stanowic podstawe do ich oznaczenia fotometrycznego.
Ligazy-katalizuja reakcje rozszczepienia i syntezy związków najczęściej pomiedzy atomami C-C,C-O i C-N.w pierwszym wypadku jest to rozklad niehydrolityczny.w reakcji syntezy enzymy nie wymagaja dostarczania energi z udzialem ATP.Aldolaza fruktozo-bifosforanowa-jest enzymem który katalizuje w procesie glikolizy rozszczepienie fruktozo 1,6-bifosforanu do aldehydu 3-fosfogliceynnowego i fosodihydroksyacetonu przy ustaleniu stalej równowagi.Enzym dziala tez w kierunku syntezy heksozy z dwoch trioz:aldozy i ketozy syntetyzowany jest fruktozo-1,6-bifosforan w dwoch procesach glukoneogenezie i fotosyntezie.Enzym zlokalizowany jest w cytosolu komorki a także w Stromie chloroplastow.aldolaza a w mięśniach,b-watrobie,c-mozgu.
Metoda kolorymetryczna opracowana przez Sibley-Lehningera i zmodyfikowana przez Brunsa.W metodzie tej powstale produkty reakcji poddaje się hydrolizie alkalicznej w celu odlaczenia reszt fosforanowych utrudniającej powstanie reakcji barwnej a aldehyd glicerynowy i dihydroksyaceton traktuje 2,4-dinitrofenylohydrazyna w wyniku czego powstaje mieszanina 2,4-dinitrofenyloosazonow które oznacza się kolorymetrycznie przy dl fali 500-550nm.
7.Oznaczanie aktywności aldolazy-10ml w kolbie miarowej uzupełniamy do kreski.do jednej z probowek dodac 3ml TCA,do wszytkich dodac po 1,4ml buforu kolidynowego potem po 0,2ml substratu 0,06M roztworu fruktozo 1,6-bifosforanu.ogrzewac w 30stopniach przez 5min.odmierzc po 1ml wyciągu roślinnego lub zwierzeecego i ogrzewac przez 30min w 30stopniach.potem dodac po 3ml TCA do wszytkich.wszytkie schłodzić i przesączyć do nowych probowek.z nich pobrac po 1ml klarowego przesączu.i odawac po 1ml NaOH w celu przeprowadzenia hydrolizy estrow fosofranow trioz.prowadzic hydrolize przez 10min w temp pokojowej.potem dodac po 1ml 2,4-dinitrofenylohydrazyny.i ogrzewac przez 10min w 30stopniach w lazni wodnej.potem dodac po 7ml NaOH i uzyskuje się barwne roztwory.potem wykonujemy absorbancje na 540nm długości fali.potem odczytujemy dane z krzywej wzorcowej dla d-aldehydu glicerynowego do obliczen.
Aldolaza fruktozo-bisfosforanowa- enzym należący do klasy liaz, pełni ważną rolę w glikolize, glukoneogenezie, fotosyntezie. Liazy katalizują reakcje rozszczepienia i syntezy. Enzym ten w procesie glikolizy katalizuje rozszczepienie fruktozo-1,6-bisfosforanu do aldehydu 3-fofoglicerynowego i fosfodihydroksyacetonu. Działa też w kierunku syntezy heksozy z dwóch trioz: aldozy i ketozy. Enzym występuje u zwierząt i roślin w cytosolu (u roślin dodatkowo w Stromie chloroplastów). Mechanizm reakcji aldolazy zakłada, że enzym tworzy kompleks przejściowy – protonowaną zasadę Schiffa. Najczęściej stosowaną metodą oznaczania aktywności tego enzymu jest metoda kolorymetryczna Sibley-Lehningera.
Optymalna temp dla aldolazy to 37*C u zwierząt i człowieka, a u roślin 30*C i pH 7-7,6. Zdj
- koenzymy to niskocząsteczkowe, niebiałkowe zwiazki organiczne, które decydują o aktywności katalitycznej enzymu.
- koenzymy moga byc rozpatrywane jako drugie sybstraty w reakcji enzymatyznej, ponieważ zmiany w koenzymie róznoważa zmiany zachodzące w substracie np. reakcja redoks powoduje jednoczesne utlenianie substancji oraz redukcje koenzymu.
Funkcje koenzymów:
1. Przenoszą protyny H+ i elektrony e-
- NAD+, NADP+, FMN, FAD, ubichinon, LIp S2.
2. Przenoszenie innych grup niż H+ i e-
- CoA (koenzymA) przenosi grupe acylową, CoF (koenzymF) przenosi grupe formylową, CoB12 (koenzym B12) przenosi grupe metylową, PLP (fosforan pirydoksalu) przenosi grupe aminowa, DPT (difosforan tiaminy) przenosi grupe ketolową, a takze inne enzymy : ATP, GTP, CTP, UTP, biotyna.
Klejno klasy enzymów współpracujących z koenzymami: oksydoreduktazy (wspópracowują z koenzymami z 1 punktu). transferazy, liazy, izomerazy, ligazy ( te 4 współpracowują z koenzymami z 2 punktu)
Centrum aktywne enzymu-CA-to miejsce w czasteczce enzymu do którego przyłączają się substraty oraz nastepuje ich przekształcenie w produkt.lancuchy boczne aminokwasow budujących centrum aktywne mogą lezec w roznych miejscach liniowej sekwencji aminowkasow.w polaczeniu E-S biora udzial slabe wiazania.centrum aktywne SA zaglebueniami lub szczelinami niedostępnymi dla wody,specyficzność wiazania substratu zalezy od precycyzjnie określonego ułożenia atomow w centrum aktywnym.
Aminokwasy kontaktowe-to te które wiaza substrat jak i te które bezpośrednio uczestnicza w katalizie(Cys,Asp,Glu,Ser).
Aminokwasy pomocniczze-nie stykaja się z substratem ale uczestnicza w katalizie.aminokwasy stabilizujące-utrzymuja odpieiednia konformacje CA.
miara aktywności enzymu-ilosc substratu przekształconego w jednostce czasu lub ilość produktu powstałego w jednostce czasu przeliczona na ilość badanego materialu.aktywosc enzymu wyraza się w jednostkach aktywności.
Wzór Michaelisa-Menten-E+S><K+1K-1ES>K+2E+P.E-enzym,S-substat.tworzy kompleks enzym-substrat ES,które nastepnie rozpada się na produkt P i wolny enzym E.ES-energia kompleku ES okresla poziom do którego w dnych warunkach musi wzrosnąć energia układu reagującego aby reakcja mogla przebiegac.
Vo-szybkosc poczatkowa reakcji-Vo=Vmax[s]/K(u dolu)M+[s].Km to takie stezenie substratu w mol na dm3 przy którym reakcja osiaga polowe Vmax.
Energia aktywacji-to energia potrzebna do zapoczątkowania reakcji (zaktywowania substratu)
Km-stała Michaelisa-Menten to takie stężenie substratu (mol/litr) przy którym szybkość reakcji enzymatycznej osiąga połowę szybkości maksymalnej. Niska wartość Km wskazuje na duże powinowactwo enzymu do substratu oraz dużą szybkość procesu katalitycznego i odwrotnie. Wartość V i Km wyznacza się doświadczalnie z wykresu zależności szybkości reakcji od stężenia substratu. Aktywność enzymów jest zmienna i zależy od: stężenia substratu, czasu trwania reakcji, temp, pH,
Jednostki aktywności enzymów:
Aktywność-to szybkość przemiany, mierzona ilością substratu przekształconego w jednostce czasu i przeliczona na ilość badanego materiału. J. standardowa-to taka ilość enzymu, która katalizuje przemianę 1mikromola substratu w ciągu 1min, temp 30*C i opt pH i stężenia substratu. Katal- to taka ilość enzymu, która w ciągu 1s w temp 30*C i opt pH i stężenia substratu powoduje przemianę 1 mikromola substratu. Aktywność molekularna- to ilość mmoli substratu przekształcona w ciągu 1 minuty w standardowych warunkach przez 1mmol enzymu. Czasami aktywność wyraża się podając liczbę jednostek enzymu na mg białka.
Fosfataza kwaśna- enzym należący do klasy hydrolaz, katalizujący hydrolizę różnych estrów fosforanowych. F kwaśna pH opt 5 i występuje w nasionach roślin. F zasadowa pH opt 9. Aktywność fosfataz oznacza się używając sztucznych substratów tu 4-nitrofenylofosforan, aktywność mierzy się ilością uwolnionego fosforanu. Otrzymujemy barwny produkt.
Energia kompleksu ES-okresla poziom do którego musi wzrosnąć energia układu reagującego aby mogla zajsc reakcja.
Wartość V wyznacza się-doswiadczalnie z wykresu zależności szybkość reakcji v od stężenia substratu.wyznaczanie stalej Michalisa-menten-do 6 probowek odmierzyc kolejno:0,1;0,2;0,4;,0,6;0,8 i 1ml 4nitrofenylofosforanu dodac po 1,5ml buforu octanowego i uzupełnić woad do objętości 4ml a do proby kontrolnej odmierzyc 1,5ml buforu i 2,5mlwody.ogrzac 38stopni i po 5min po 1ml enzmu,wymieszac i wstawic do lazni na 10min.dodac po 5ml weglanu sodowego oznaczyc absorbancje przy 420nm,proba kontrolna.wplyw stężenia enzymu na –do 5 porobwek odmierzyc 0,5,;1;1,5;2;2,5 enzymu dodac po 1ml buforu octanowego i uzupełnić do 3,5ml a do proby 0 dodac 1ml buforu i 2,5ml wody.ogrzac 38stopnia po 5min dodac po 1ml 4,nitrofenylofosforanu i ogrzac przez 10min.dalej tak jak w pkt 1.