2. PRZEGLĄD LITERATURY

1. Procesy utleniania oraz rola przeciwutleniaczy w żywności

Reakcje o charakterze oksydacyjnym zachodzące w żywności są jedną z przyczyn pogarszania się jej jakości. Główne formy oksydacji opisywane w literaturze to utlenianie za pomocą tlenu, enzymów z klasy oksydoreduktaz oraz autooksydacja (Maniak i Targoński, 1996). W wyniku tych procesów następuje pogorszenie cech sensorycznych żywności (smak, zapach, barwa, konsystencja), obniżeniu ulega wartość odżywcza (m.in. zmniejsza się zawartość witamin A, D, E) oraz powstają związki szkodliwe (tj. nadtlenki, wolne rodniki, produkty polimeryzacji), co negatywnie wpływa na zdrowie konsumenta (Sicińska, 2008).

1. Wolne rodniki

Wolny rodnik definiowany jest jako atom lub cząsteczka, zdolna do samodzielnego istnienia, mająca jeden lub więcej niesparowanych elektronów. Słowo rodnik pochodzi od „radix” (z łac. korzeń, podstawa) wskazując na kluczowe biologiczne znaczenie wywoływanych przez nie reakcji. Przymiotnik „wolny” podkreśla natomiast wyższą aktywność chemiczną stanu rodnikowego w porównaniu do formy ustabilizowanej (nierodnikowej) (Bergendi i in., 1999). Obecność niesparowanego elektronu sprawia, że bardzo szybko wchodzą one w reakcje z innymi atomami lub cząsteczkami. Najważniejszymi czynnikami stresowymi dla organizmów tlenowych są reaktywne formy tlenu (RFT), powstające w naturalnych procesach fizjologicznych i metabolicznych. Do RFT zaliczmy:

• O2^_(anionorodnik ponadtlenkowy),

• OH (rodnik hydroksylowy),

• RO2* (rodnik peroksylowy),

• RO (rodnik alloksylowy),

• NO*, N02*(rodniki tlenku azotu),

• H₂0₂ (nadtlenek wodoru),

• HOCI (kwas podchlorawy),

• '0₂ (tlen singletowy)

• O3 (ozon) (Galek i Targoński, 2003; Radwańska-Wala i in., 2008).

1. Źródła wolnych rodników

Nie wszystkie przedstawione reaktywne formy tlenu są wolnymi rodnikami, ale często biorą udział w reakcjach ich powstawania. Ludzki organizm generuje wolne rodniki celowo, w ilościach fizjologicznych oraz jako nieuniknione metabolity procesów biochemicznych. Główna część wolnych rodników powstaje jako uboczne produkty metabolizmu tlenowego w mitochondriach (rysunek 1), w pośrednich etapach redukcji tlenu do wody (Jensen, 2003). Pod kontrolą mechanizmów enzymatycznych znajduje się 95-99% tlenu. Szacuje się, że 1-5% wdychanego tlenu (jest to około 2 kg rocznie) nie jest przetwarzana do końca, czyli do cząsteczki wody, ale zatrzymuje się w fazie produktów pośrednich. W wyniku „ucieczki” elektronów z cyklu, tlen ten redukowany jest do form aktywnych Jest to najważniejsze źródło anionorodnika ponadtlenkowego w większości komórek aerobowych (Kalisz i in., 2007; Puzanowska-Tarasiewicz i in., 2010)

Rysunek 1. Schemat ilustrujący powstawanie rodników z stabilnej cząsteczki tlenu tripletowego ’’02 (Ramarathnam i in., 1995)

Anionorodnik ponadtlenkowy powstaje również w szeregu reakcji enzymatycznych (np. układu cytochromu P 450, oksydaz: ksantynowej i aldehydowej), w wyniku utleniania zredukowanych form wielu związków (np. NADH, FADH₂, tioli), monoamim (np. dopaminy, adrenaliny), hemoglobiny i innych (Fang i in., 2002; Fontecavea i in., 2001). Anionorodnik ponadtlenkowy jest rodnikiem raczej mało reaktywnym w stosunku do większości związków i ulega icaKcji enzymatycznej Katalizowanej przez aysmutazę ponadtlenkową tworząc nadtlenek wodoru (H2O2) (Kalisz i in., 2007). Jednakże w kontakcie z jonami metali wielowartościowych (tzw. reakcja Fentona) powstaje najbardziej reaktywny rodnik wodorotlenowy, który atakuje praktycznie wszystkie biologiczne substancje:

0₂' + 0₂‘ + 2H⁺ -> H₂0₂ + 0₂ H₂0₂ + Fe⁺² -> OH + OH + Fe⁺³ 0₂' + Fe⁺³ -> 0₂ + Fe⁺²

Reaktywne formy tlenu są prekursorami dalszych pochodnych. Mogą łączyć się z innymi atomami lub większymi cząsteczkami z wytworzeniem rodników alloksylowych, peroksylowych, silnych utleniaczy jak HOC1 czy tlen singletowy, a wyniku powiązania NO* z *02 ” powstaje wysoce reaktywny nadtlenoazotyn. (Conner i Grisham, 1996). Innym źródłem dostarczającym wolne rodniki jest autooksydacja lipidów. Jest to proces, w którym dochodzi do utleniania i degradacji wielonienasyconych kwasów tłuszczowych. W wyniku tych przemian powstają wodoronadtlenki lipidów, które mają niestabilny charakter i mogą ulegać rozpadowi z wytworzeniem kolejnych rodników, co zapewnia ciągłą ich dostawę i przyczynia się do zwiększenia procesu propagacji. Rodniki lipidowe podlegają dalszym przemianom, aż do stabilnych nie rodnikowych związków, takich jak: aldehydy, ketony, alkohole, estry, laktony oraz węglowodory: alkany i alkeny (Radwańska- Wala i in., 2008).

Reakcje rodnikowe maja charakter łańcuchowy. Przykładem takiej reakcji jest proces peroksydacji lipidów. Można wyróżnić trzy fazy reakcji wolnorodnikowej: etap inicjacji, propagacji i terminacji. W reakcji inicjacji dochodzi do tworzenia wolnych rodników, na etapie propagacji liczba wolnych rodników nie ulega zmianie, natomiast następuje zmiana przenośników niesparowanych elektronów. Reakcja terminacji kończy łańcuch reakcji wolnorodnikowej (Kalisz i in., 2007).

Organizm ludzki narażony jest również na działanie wolnych rodników pochodzących z źródeł zewnętrznych - promieniowanie UV i jonizujące, zanieczyszczenia środowiska, niektóre leki, toksyny, jak również przebyte infekcje wirusowe i bakteryjne czy urazy (Baraniak i in, 2002; Radwańska-Wala i in., 2008). Powstawaniu wolnych rodników w organizmie sprzyjają również inne czynniki takie jak: nadmierny wysiłek fizyczny lub psychiczny, nieprawidłowa dieta, palenie tytoniu i spożywanie alkoholu (Czajka, 2006). Oprócz wytworzonych wewnątrz organizmu, na człowieka oddziaływują również rodniki egzogenne. Powstają m.in. poprzez fotolizę lotnych zanieczyszczeń przemysłowych, podczas spalania węglowodorów w silnikach spalinowych, wytwarzania mas plastycznych (Bali, 2001). Pojawiają się również w niewłaściwie przechowywanych lub przetworzonych produktach żywnościowych, powstają na skutek wędzenia, smażenia lub jełczenia tłuszczów. Są również obecne w pleśni (Panczenko-Kresowska, 1997; Barowicz 2000).

2.1.1.2. Biologiczne efekty działania wolnych rodników

Reaktywne formy tlenu (RTF) oraz ich nierodnikowe pochodne od wielu lat uważane są za czynniki sprzyjające uszkodzeniu komórek (Gałecka i in., 2008). Wolne rodniki reagują w zasadzie ze wszystkimi kluczowymi strukturami i cząsteczkami na poziomie komórkowym. Powodują konwersję białek, peroksydację lipidów oraz uszkodzenia struktury kwasów nukleinowych, natomiast z organelli komórkowych najbardziej narażone na atak wolnych rodników są mitochondria. Ich uszkodzenie może prowadzić do dysfunkcji komórki (Głód i in., 2009; Kalisz i in.,

2007. . W celu przeciwdziałania tym zmianom w organizmie wykształcił się antyoksydacyjny układ ochronny (ADS Antioxidant defense system), który stanowi skutecznie działająca grupa czynników ochronnych i mechanizmów naprawczych organizmu. W skład ADS wchodzą systemy enzymatyczne (katalaza, dysmutaza ponadtlenkowa, peroksydaza glutationowa, reduktaza glutationowa), systemy nieenzymatyczne (zmiatacze wolnych rodników) oraz antyoksydanty prewencyjne (Czajka, 2006). Jednak w niektórych schorzeniach, przy zbyt intensywnych procesach wolnorodnikowych czy też długotrwałej ekspozycji na działanie reaktywnych form tlenu bariery antyoksydacyjne nie są w stanie usunąć wytwarzanych RFT, co powoduje zaburzenie równowagi fizjologicznej między powstawaniem a eliminacją wolnych rodników. Zjawisko to określa się mianem stresu oksydacyjnego. Helmut Sies zdefiniował stres oksydacyjny, jako „zaburzenie równowagi prooksydacyjno-antyoksydacyjnej w kierunku reakcji utleniania” (Radwańska-Wala i in., 2008). Stres oksydacyjny jest ważnym czynnikiem w patogenezie wielu chorób, m.in.:

• Choroby układu krążenia (miażdżyca tętnic, zawał serca, niedokrwienna choroba serca)

• Choroby układu oddechowego (astma, zapalenie oskrzeli, przewlekła obturacyjna choroba płuc)

• Choroby trzustki (ostre zapalenie trzustki)

• Choroby wątroby (włóknienie i marskość wątroby, cholestaza wątrobowa, alkoholowe zapalenie wątroby)

• Choroby przełyku

• Cukrzyca

• Choroby oczu (zaćma, jaskra, zwyrodnienie plamki związane z wiekiem)

• Choroby nowotworowe (Kalisz i in., 2007)

• Choroby ośrodkowego układu nerwowego (zespół Downa, wodogłowie, autyzm, urazy i nowotwory mózgu, zapalenie opon mózgowo rdzeniowych, Alzheimer, Parkinson, stwardnienie zanikowe boczne, stwardnienie rozsiane, niedokrwienny udar mózgu oraz schorzenia psychiatryczne: schizofrenia, depresja) (Radwańska-Wala i in., 2008).

Destrukcyjne działanie wolnych rodników oraz innych utleniaczy uwalnianych w nadmiernej ilości towarzyszy również procesom starzenia. Obserwuje się tu osłabienie systemu antyoksydacyjnego, co może być skutkiem spadku aktywności enzymów antyoksydacyjnych bądź niedostatecznej ilości przeciwutleniaczy niskocząsteczkowych, które ulegają szybkiemu zużyciu w reakcjach z nadmiernie wytwarzanymi wolnymi rodnikami (Zabłocka i Janusz

2007. . W wyniku wadliwego działania systemów obronnych dochodzi do kumulacji uszkodzeń i mutacji w mitochondrialnym DNA. Hipoteza ta poparta jest przez oznaczanie markerów uszkodzeń oksydacyjnych u ludzi w podeszłym wieku. Jednakże proces starzenia jest wieloczynnikowy, a stres oksydacyjny jest jednym z mechanizmów starzenia (Jensen, 2003).

Wolne rodniki obok negatywnego wpływu na organizm pełnią również korzystne funkcje. Wytwarzane w ilościach fizjologicznych są niezbędne do zapewnienia prawidłowego funkcjonowania komórki i jej wzrostu, różnicowania oraz programowania apoptozy. Liczne badania dowodzą, że wolne rodniki biorą udział w procesach komórkowego przekazywania sygnału, co świadczy, że mogą pełnić rolę drugich przekaźników, jak również gwarantują utrzymanie prawidłowej homeostazy redox, kontrolują procesy adhezji komórek oraz relaksacji mięśni gładkich (Gałecka i in., 2008). Z kolei komórki fagocytujące wykorzystują wolne rodniki do eliminacji patogenów. RFT uczestniczą także w usuwaniu pasożytów oraz czynników potencjalnie chorobotwórczych pojawiających się w jamie ustnej. Do pozytywnych oddziaływań rodników zalicza się również zdolność do zwiększania przepuszczalność ściany naczyń włosowatych, zapewnianie prawidłowego przebiegu reakcji zapalnej oraz wpływ na syntezę, uwalnianie lub inaktywację tlenku azotu, który reguluje ciśnienie krwi (Zabłocka i Janusz, 2008).

1. Przeciwutleniacze

Przeciwutleniacze odgrywają niezwykle ważną rolę wśród substancji bioaktywnych zawartych w żywności. Są one substancjami chemicznymi, zapobiegającymi lub opóźniającymi procesy utleniania zachodzące zarówno w produktach spożywczych, jak i w organizmach żywych (Gramza-Michałowska i in., 2011). Zmniejszają oksydacyjne uszkodzenie komórek i biocząsteczek, jak również obniżają ryzyko powstawania wielu chorób i chronią przed czynnikami powodującymi raka. Ponadto posiadają szereg cennych biologicznych właściwości do których należą m.in.: działanie antymutagenne, antyalergiczne, opóźniające procesy starzenia. Głównym źródłem antyutleniaczy jest pożywienie, znajdują się one bowiem w warzywach, owocach, roślinach zbożowych, rybach a także mogą być przyjmowane w formie suplementów diety (Kisała, 2009).

Według Hawlliwella i Gutteridge’a (1995) przez pojęcie antyoksydant rozumiemy substancję, która występuje zwykle w stężeniach niskich, w porównaniu z substratami ulegającymi utlenianiu i znacząco opóźnia lub hamuje ich oksydację. Zdolność ta znalazła wykorzystanie w przemyśle spożywczym do zabezpieczania żywności, jak również przemyśle kosmetycznym i farmaceutycznym, aby uniknąć oksydacji nietrwałych składników (Kisała, 2009). Termin utlenialny substrat obejmuje każdy rodzaj substancji występującej w żywności oraz tkankach żywych. Działanie przeciwutleniaczy obejmuje zapobieganie utlenianiu:

• tlenem z powietrza substancji nietłuszczowych, utlenianych najczęściej przy udziale enzymów obecnych w surowcu (np. ciemnienie przekrojonych warzyw i owoców, brunatnienie mięsa),

• tłuszczów, Które jest przyczyną psucia się produktów tłuszczowych, a również żywności, która zawiera nawet niewielkie ilości tłuszczu (Rutkowski i in., 1997).

1. Podział przeciwutleniaczy

Przeciwutleniacze stanowią dużą grupę różnorodnych związków. Znanych jest szereg przeciwutleniaczy pochodzenia naturalnego jak i otrzymanych drogą syntetyczną (Kisała, 2009). Spośród syntetycznych związków najczęściej wykorzystywane są: butylohydroksytoluen (BHT), butylohydroksyanizol (BHA), tert-butylohydrochinon (TBHQ) i estry kwasu galusowego (np. galusan propylu, oktylu i dodecylu). Są one bardzo skuteczne i mają na ogół dobre właściwości przetrwania procesu technologicznego, zwłaszcza obróbki termicznej, na zasadzie tzw. efektu przeniesienia (curry through) czyli przeniesienia aktywności stabilizującej do finalnego produktu (Uchman i in., 2001; Sicińska, 2008). Antyutleniacze syntetyczne, mimo dużej aktywności przeciwuteniająej mogą mieć szkodliwy wpływ na zdrowie człowieka poprzez wywoływanie pewnych schorzeń (np.: rak). Bezpieczeństwo stosowania syntetycznych przeciwutleniaczy (BHT i BHA) coraz częściej poddawane jest dyskusji. W laboratorium Międzynarodowej Agencji do Badań nad Rakiem (The International Agency for Research on Cancer IARC) przeprowadzono badania wpływu BHA na wystąpienie nowotworu, które potwierdziły jego rakotwórczość (Kisała, 2009). Z badań prowadzonych na zwierzętach wynika również, że BHA w większych dawkach może powodować spadek krzepliwości krwi oraz niekorzystnie wpływać na mięsień sercowy. Uważa się jednak, że w takich ilościach, w jakich BHA jest podawany do żywności jest nieszkodliwy (Sicińska, 2008). Dla BHT otrzymano ograniczone dane dotyczące właściwości kancerogennych, dlatego nie jest on sklasyfikowany przez IARC jako rakotwórczy (Kisała, 2009). Jednakże badania prowadzone na zwierzętach dowodzą, że BHT może niekorzystnie oddziaływać na organizm powodując m.in. krwotoki, zaburzenia pracy tarczycy i wątroby (Sicińska, 2008). Nierozstrzygnięte wątpliwości wokół syntetycznych przeciwutleniaczy oraz preferencje konsumentów dla naturalnych dodatków do żywności spowodowało, że w ostatnich latach obserwuje się większe zainteresowanie naturalnymi inhibitorami utleniania (Jędrusek-Golińska

i in lQGO\

Przeciwutleniacze naturalne dzielone są na dwie grupy tzw. przeciwutleniacze pierwotne i wtórne. Związki należące do pierwszej grupy są składnikami obecnymi w surowcach roślinnych i zwierzęcych. Wtórne naturalne przeciwutleniacze, mniej poznane niż pierwotne, powstają w procesach przetwarzania żywności (Korczak i in., 1999).

Zidentyfikowano i wyizolowano szereg substancji chemicznych pochodzenia roślinnego o działaniu przeciwutleniającym. Większość z nich należy do związków fenolowych (Bali, 2001). Jedną z najważniejszych grup przeciwutleniaczy są polifenole. Dotychczas poznano ponad 8000 związków o charakterze polifenolowym, które przyporządkowano do 10 klas, a jedną z najważniejszych z nich stanowią flawonoidy. Do najważniejszych przeciwutleniaczy zalicza się również tokoferole, kwas askorbinowy, retinol, karotenoidy (w tym głównie [}- karoten, luteina, likopen i zeaksantyna), kwas nordihydrogwajetarowy (NDGA), kwas galusowy i jego pochodne (Grajek, 2004; Bali, 2001). Z innych naturalnych przeciwutleniaczy należy wymienić koenzym Qi₀, kreatynina, neopteryna, melatonina, bilirubina oraz hormony płciowe (estron i estradiol) (Czajka, 2006). Wśród przeciwutleniaczy roślin oleistych wyróżnia się także sterole, jak sitostanol, sigmasterol, kampesterol. Od dawna zwraca się również uwagę na bioaktywne składniki czosnku i cebuli. Zawarte w nich związki organiczne siarki odznaczają się silnym działaniem antyoksydacyjnym (Grajek, 2004). Do przedstawicieli związków

1. działaniu przeciwutleniającym zalicza się również selen, kwasy organiczne, chlorofiliny, fityniany, tiocyjaniany, izomery kwasu linolowego (Szejdek i Borowska, 2004).

Jako naturalne przeciwutleniacze mogą być wykorzystywane enzymy usuwające tlen (oksydaza glukozowa w połączeniu z katalazą) i DOS (dysmutaza nadtlenkowa) oraz redukujące wodoronadtlenki lipidów (S-transferaza glutationowa

1. peroksydaza glutationowa) (Meyer i Isaksen, 1995). Związkami ochronnymi, funkcjonującymi w organizmie są również zredukowany glutation oraz białka o właściwościach przeciwutleniajacych, które stanowią antyoksydanty prewencyjne, zapobiegające powstawaniu nowych reaktywnych form i peroksydacji lipidów. Są to ceruloplazmina, ferrytyna, transferyna oraz albumina. Właściwości antyoksydacyjne wykazuje również kwas moczowy, który wiąże jony metali i wychwytuje rodnik hydroksylowy. (Czajka, 2006; Kalisz i in., 2007).

Przeciwutleniacze naturalne dzielone są na dwie grupy tzw. przeciwutleniacze pierwotne i wtórne. Związki należące do pierwszej grupy są składnikami obecnymi w surowcach roślinnych i zwierzęcych. Wtórne naturalne przeciwutleniacze, mniej poznane niż pierwotne, powstają w procesach przetwarzania żywności (Korczak i in., 1999).

Zidentyfikowano i wyizolowano szereg substancji chemicznych pochodzenia roślinnego o działaniu przeciwutleniającym. Większość z nich należy do związków fenolowych (Bali, 2001). Jedną z najważniejszych grup przeciwutleniaczy są polifenole. Dotychczas poznano ponad 8000 związków o charakterze polifenolowym, które przyporządkowano do 10 klas, a jedną z najważniejszych z nich stanowią flawonoidy. Do najważniejszych przeciwutleniaczy zalicza się również tokoferole, kwas askorbinowy, retinol, karotenoidy (w tym głównie [}- karoten, luteina, likopen i zeaksantyna), kwas nordihydrogwajetarowy (NDGA), kwas galusowy i jego pochodne (Grajek, 2004; Bali, 2001). Z innych naturalnych przeciwutleniaczy należy wymienić koenzym Qi₀, kreatynina, neopteryna, melatonina, bilirubina oraz hormony płciowe (estron i estradiol) (Czajka, 2006). Wśród przeciwutleniaczy roślin oleistych wyróżnia się także sterole, jak sitostanol, sigmasterol, kampesterol. Od dawna zwraca się również uwagę na bioaktywne składniki czosnku i cebuli. Zawarte w nich związki organiczne siarki odznaczają się silnym działaniem antyoksydacyjnym (Grajek, 2004). Do przedstawicieli związków

1. działaniu przeciwutleniającym zalicza się również selen, kwasy organiczne, chlorofiliny, fityniany, tiocyjaniany, izomery kwasu linolowego (Szejdek i Borowska, 2004).

Jako naturalne przeciwutleniacze mogą być wykorzystywane enzymy usuwające tlen (oksydaza glukozowa w połączeniu z katalazą) i DOS (dysmutaza nadtlenkowa) oraz redukujące wodoronadtlenki lipidów (S-transferaza glutationowa

1. peroksydaza glutationowa) (Meyer i Isaksen, 1995). Związkami ochronnymi, funkcjonującymi w organizmie są również zredukowany glutation oraz białka o właściwościach przeciwutleniajacych, które stanowią antyoksydanty prewencyjne, zapobiegające powstawaniu nowych reaktywnych form i peroksydacji lipidów. Są to ceruloplazmina, ferrytyna, transferyna oraz albumina. Właściwości antyoksydacyjne wykazuje również kwas moczowy, który wiąże jony metali i wychwytuje rodnik hydroksylowy. (Czajka, 2006; Kalisz i in., 2007).

Do wtórnych naturalnych przeciwutleniaczy zalicza się poliienole wytworzone podczas wędzenia, S-nitrozocysteinę powstającą podczas peklowania (Rutkowski i in., 1997) oraz produkty przemian (np. brązowienia nieenzymatycznego) (Maniak i Targoński, 1996).

Jak dotąd naturalne przeciwutleniacze nie znalazły tak szerokiego zastosowania jak syntetyczne. Wynika to z trudności wyizolowania ich w postaci czystej z surowców roślinnych, słabej rozpuszczalności (zwłaszcza w tłuszczach) oraz niskiej odporności na wysoką temperaturę i promieniowanie świetlne. Ponadto mogą wprowadzać swoistą barwę, smak i aromat, a w obecności metali ciężkich pochodzących z opakowań lub żywności mogą powodować odbarwienia. Czynniki te ograniczają ich wykorzystanie w przetwórstwie spożywczym (Szejdek i Borowska, 2004). Jednakże naturalne antyoksydanty stanowią atrakcyjny składnik z klinicznego punktu widzenia.

Wykrycie zależności pomiędzy chorobami cywilizacyjnymi, a składnikami żywności doprowadziło do gwałtownego rozwoju badań, głownie nad substancjami o właściwościach przeciwutleniających. Udowodniono, że dieta bogata w warzywa i owoce zapobiega procesom starzenia się, a ludzie w których diecie przeważają składniki roślinne rzadziej cierpią na choroby sercowo-naczyniowe, cukrzyce, nowotwory i inne. Wolnorodnikowe przyczyny wielu schorzeń przyczyniły się do uznania prozdrowotnego działania antyoksydantów na organizm człowieka (Bartoń i in., 2005; Bartoszek i Grześkowiek, 2002).

2. Mechanizmy działania przeciwutleniaczy

Mechanizm działania przeciwutleniaczy pozwala na sklasyfikowanie ich w dwóch kategoriach:

1. Przeciwutleniacze pierwszorzedowe. które przerywają reakcję łańcuchową przez przekazanie rodnikom atomów wodoru lub elektronów co powoduje ich przemianę do bardziej stabilnych związków, zgodnie z reakcjami (1) i (2). Do takich związków można zaliczyć fenole typu galusanów, hydrochinonów i tokoferoli. (Grajek, 2004)

AH + R -» RH + A (1)

AH +ROO -> ROOH + A (2)

gdzie:

AH - przeciwutleniacz, np. fenolowy

R‘, ROO - węglowy rodnik alkilowy i rodnik nadtlenkowy

A - rodnik antyoksydanta

Stabilizacja rodników, wywołana mezomerią utrudnia ich udział w reakcji łańcuchowej. Dlatego reakcje z ich udziałem: (3-5) przebiegają bardzo wolno w porównaniu z reakcjami tworzenia rodników podczas reakcji autooksydacji.

A + 0₂-> AOO (3)

AOO + RH -> AOOH + R (4)

A-+RH-» AH + R (5)

2. Przeciwutleniacze drugorzedowe. które opóźniają utlenianie lipidów w wyniku procesów innych niż przerwanie łańcucha autooksydacji. Mogą one działać poprzez:

• częściową regenerację przeciwutleniaczy pierwszorzędowych (np. kwas askorbinowy),

• kompleksowanie jonów metali katalizujących reakcję autooksydacji, czyli jako czynniki chelatujące (np. kwas winowy, askorbinowy, cytrynowy, wersenian wapniowo-sodowy - EDTA, kwas fosforowy i jego pochodne, np. fosfolipidy),

• jako „zmiatacze" (scavengery) tlenu (np. kwas askorbinowy i jego ester palmitynowy, kwas izoaskorbinowy i jego sól sodowa),

• poprzez rozkład nadtlenków do nierodnikowych produktów (niektóre enzymy oraz niektóre produkty reakcji Maillarda),

• tworzenie ochronnej powierzchni na granicy oleju i powietrza (np. fosfolipidy),

• poprzez absorpcję promieniowania UV,

• poprzez dezaktywację („gaszenie") singletowego tlenu (np. p-karoten). Niektóre antyoksydanty mogą działać zarówno jako pierwszorzędowe i drugorzędowe (Szukalska, 1999).

3. Metody pomiaru zdolności antyoksydacyjnej

Istnieje wiele metod analitycznych umożliwiających określenie aktywności antyoksydacyjnej materiału biologicznego. Aktywność antyoksydacyjną (AA- Antioxidant Activity) rozumiana jest jako reaktywność konkretnego antyoksydanta wobec danego utleniacza. Przy ocenie AA produktów spożywczych należy oznaczyć całkowitą aktywność antyoksydacyjną (TAA- Total Antioxidant Activity), która jest sumą aktywności poszczególnych składników o charakterze przeciwutleniającym. Można również oznaczyć aktywność czystego składnika oddzielnie (Bartoń i in., 2005). Metody oceny działania przeciwutleniającego często opierają się na tej samej zasadzie: czynnik utleniający indukuje reakcję, której przebieg można łatwo obserwować np. dokonując pomiarów spektrofotometrycznych. Obecność przeciwutleniacza w próbie spowalnia reakcję utleniania, a parametr charakteryzujący to spowolnienie jest miarą aktywności przeciwutleniacza. Parametrem tym mogą być czas indukcji (czas, o jaki dodatek przeciwutleniaczy opóźnia rozpoczęcie reakcji utleniania), ilość substancji indykatorowej utlenianej po określonym czasie bądź stopień protekcji (pole pod krzywą obrazującą zależność stężenia substancji indykatorowej od czasu w obecności i nieobecności antyoksydanta) (Bartosz, 2003).

Do oznaczania AA stosuje się dwie kategorie metod, opierających się na:

1. Redukcji jonów metali do jonów o niższym stopniu utlenienia przez badany antyoksydant np.: FRAP (redukcja jonu Fe³⁺do Fe²⁺), CUPRAC (redukcja jonu Cu²⁺ do Cu¹⁺)

2. Neutralizowaniu wolnych, stabilnych rodników np.: ABTS*⁺ (wolny rodnik 2,2’-azynobis (3-etylobenzotiazolino-6-sulfonianu), DPPH⁺ (wolny trwały rodnik ł,l-difenylo-2-pikryIohydrazylu).

Metoda FRAP

Analiza polega na redukcji jonów Fe ^,+ do Fe²⁺, które są kompleksowane przez TPTZ (2,4,6-tris(2-pyridylo)-l,3,5-triazyne) z wytworzeniem ciemnego, niebieskiego zabarwienia o maksimum absorpcji przy 593 nm. Jest to metoda, która nadaje się do analizy wszystkich produktów nie wykazujących absorbancji w tym samym paśmie, gdyż reakcja zachodząca jest mało zależna od rodzaju materiału. Badanie to jest stosunkowo niedrogie, szybkie, a przygotowanie reagentów jest proste. Wyniki otrzymane tą metodą charakteryzują się wysoką powtarzalnością.

Metoda z ABTS

Oznaczenie to polega na określeniu stopnia neutralizowania wolnych rodników ABTS*⁺ wytworzonych uprzednio z soli amonowej kwasu 2,2’-azynobis(3- etylobenzotiazolino-6-sulfonowego przez utlenianie nadsiarczanem sodu. Reakcję monitoruje się spektrofotometrycznie przy długości fali 734 nm. Rodnik ten ma też inne charakterystyczne pasma absorpcji (417 nm, 645 nm. 815 nm). Jednakże pomiaru dokonuje się w najintensywniejszym paśmie przy długości fali 734 nm, z uwagi na możliwość eliminacji w tym zakresie interferujących czynników.

Metoda z DPPH

Metoda ta opiera się na tym, że stabilny rodnik DPPH⁺ w roztworze metanolowym intensywnie zabarwiony na fioletowo, o maksimum absorpcji przy 517 nm wychwytuje elektrony od substancji antyoksydacyjnych i przechodzi w produkt o słabej, żółtej barwie. Oznaczenie polega więc na pomiarze obniżenia absorbancji przy długości 517 nm (Bartoń i in., 2005).

Do oceny działania ochronnego przeciwutleniacza w stosunku do tłuszczy, jako substrat utleniania wykorzystuje się triacyloglicerole, oleje lub smalec. Oksydacji ulegają szczególnie wielonienasycone kwasy tłuszczowe (Moure i in., 2001). Aktywność antyoksydacyjną oznacza się w oparciu o hamowanie reakcji autooksydacji kwasu linolowego w układzie alkohol-woda, utlenianie kwasu linolowego przy użyciu nadtlenku wodoru i badanie wpływu otrzymanych produktów na szybkość degradacji (dekoloryzacji) P-karotenu (Amarowicz i Shahidi, 1997).

Najważniejszym testem przeciwutleniaczy przeznaczonych dla przemysłu spożywczego są badania w ekstremalnych warunkach, jakie zachodzą w procesach przetwarzania i przechowywania żywności (Korczak i in., 1999).