1. Cel ćwiczenia:
Celem ćwiczenia było zapoznanie z metodami oznaczania ilości białek w próbkach środowiskowych. Metoda Lowry’ego, którą wykorzystano opierała się na barwnej reakcji białek z odczynnikiem Folina-Ciocalteau.
2. Przebieg ćwiczenia:
Wykonano odpowiednie rozcieńczenia mleka (rozcieńczenia 1:500, 1:1000, 1:2000 wykonano podwójnie oraz próbka kontrolna). Następnie do 7 probówek odmierzono po 0.4 ml próbki (2 x 1:500, 2 x 1:1000, 2 x 1:2000 i próba ślepa – 0.4 ml wody destylowanej) oraz 2 ml roztworu A (roztwór zawierający po 0.5 ml 2% NaKC4H4O6•4H2O i 1% CuSO4•5H2O rozpuszczonych w 2% alkalicznym roztworze Na2CO3) i dobrze wymieszano. Próbki odstawiono na 10 minut.
Po tym czasie bardzo szybko dodano 0.2 ml odczynnika E i mieszano 5-7 sekund. Następnie probówki inkubowano w ciemnym miejscu przez czas 30 minut, po czym zmierzono absorbancję przy długości fali λ=750 nm.
Obliczenia;
Stężenie białka w próbce rozcieńczonej obliczono ze wzoru ;
y=335,21*x-10,014
gdzie:
x = absorbancja
Stężenie białka w próbce wyjściowej obliczono ze wzoru:
z = y*a
Gdzie:
y – stężenie białka w próbce rozcieńczonej
a – rozcieńczenie probki (np.:500,1000,2000)
| Rozcieńczenie | 1:500 | 1:1000 | 1:2000 | Kontrola |
|---|---|---|---|---|
| Absorbancja | 0,313 | 0,263 | 0,192 | 0,176 |
| 0,333 | 0,271 | 0,324 |
Tab. nr 1. Odczyty z ćwiczenia potrzebne do określenia ilości białka w badanej próbce.
| Rozcieńczenie | Absorbancja | Stężenie białka w rozcieńczonej próbce [mg/l] | Stężenie białka w próbce wyjściowej [mg/l] | Stężenie białka w próbce wyjściowej [g/l] | Średnie stężenie białka [g/l] |
|---|---|---|---|---|---|
| 1:500 | 0,313 | 94,90673 | 47453,37 | 47,45337 | 93,85228 |
| 0,333 | 101,6109 | 50805,47 | 50,80547 | ||
| 1:1000 | 0,263 | 78,14623 | 78146,23 | 78,14623 | |
| 0,271 | 80,82791 | 80827,91 | 80,82791 | ||
| 1:2000 | 0,192 | 54,34632 | 108692,6 | 108,6926 | |
| 0,324 | 98,59404 | 197188,1 | 197,1881 |
Tab. nr 2. Obliczenia potrzebna do określenia średniego stężenia białka w próbce ( dane z tab. nr 1)
Przeliczono średnie stężenie białka z [g/l] na [g/100ml]
Średnie stężenie białka = 9,39
Z powodu zbyt zawyżonych wyników przyjęto wyniki zaproponowane przez prowadzącego:
| Rozcieńczenie | 1:500 | 1:1000 | 1:2000 |
|---|---|---|---|
| Odczyt | 0,209 | 0,120 | 0,075 |
| 0,211 | 0,119 | 0,077 | |
| 0,208 | 0,121 | 0,069 |
Tab. nr 3. Wyniki podane przez prowadzącego przyjęte do określenia ilości białka w badanej próbce
| Rozcieńczenie | Absorbancja | Stężenie białka w rozcieńczonej próbce [mg/l] | Stężenie białka w próbce wyjściowej [mg/l] | Stężenie białka w próbce wyjściowej [g/l] | Średnie stężenie białka [g/l] |
|---|---|---|---|---|---|
| 1:500 | 0,209 | 60,04489 | 30022,45 | 30,02245 | 29,88304 |
| 0,211 | 60,71531 | 30357,66 | 30,35766 | ||
| 0,208 | 59,70968 | 29854,84 | 29,85484 | ||
| 1:1000 | 0,120 | 30,2112 | 30211,2 | 30,2112 | |
| 0,119 | 29,87599 | 29875,99 | 29,87599 | ||
| 0,121 | 30,54641 | 30546,41 | 30,54641 | ||
| 1:2000 | 0,075 | 15,12675 | 30253,5 | 30,2535 | |
| 0,077 | 15,79717 | 31594,34 | 31,59434 | ||
| 0,069 | 13,11549 | 26230,98 | 26,23098 |
Tab. nr 4. Obliczenia potrzebna do określenia średniego stężenia białka w próbce (dane z tab. nr 3)
Przeliczono średnie stężenie białka z [g/l] na [g/100ml]
Średnie stężenie białka = 2,98
Równanie krzywej wzorcowej:
y = 335.21x – 10.014 [mg/l]
Wnioski:
Do oznaczenia ilości białek użyto mleka 3,2% tłuszczu. Wg etykietki na opakowaniu mleko zawierało 3,2 g białka w 100 ml produktu.
Wykorzystując metodę Lowry’ego uzyskano wynik 9,39 g/100 ml. Zawartość białka znacznie odbiega od informacji na opakowaniu. Prawdopodobnie jest to spowodowane błędami pomiarowymi, które mogą wynikać z samej reakcji z odczynnikiem Folina.
W skład odczynnika wchodzi kwas fosfomolibdenowy, który w środowisku zasadowym nie jest stabilny i może ulegać hydrolizie. Dlatego powodzenie doświadczenia w dużej mierze zależało od intensywnego wytrząsania. Na skutek nieprawidłowego wymieszania reakcja zachodzi z mniejsza wydajnością, co zaburza warunki pomiaru.