Metody hodowli selektywnych (wybiórczych)

Nasza umiejętność rozróżniania mikroorganizmów jest oparta na dwóch

typach postępowania. Niektóre mikroorganizmy można zróżnicować na

podstawie charakterystyki ich kolonii, nagromadzania pewnych związków

lub zmian w środowisku. Wiele z nich, wytwarzając widoczne dowody

swojej obecności, nadaje się do bezpośredniej izolacji. Dla takich

mikroorganizmów łatwo ustalić odpowiednie warunki i podłoża wzrostowe.

Czystą kulturę definiuje się jako potomstwo pojedynczej

komórki (klon). Otrzymanie czystej kultury, wykazanie jej czystości

ponad wszelką wątpliwość i przechowanie jej bez zakażeń jest jednym

z najważniejszych zadań mikrobiologii.

Izolację czystej kultury jakiegoś

mikroorganizmu przeprowadza się, poza nielicznymi wyjątkami, na podłożach stałych. Najpierw pojedyncza komórka musi zostać odseparowana od reszty populacji, tak aby kolonia, która powstanie z tej komórki,pozostawała z dala od innych kolonii i komórek. Bakterie tlenowe izoluje się metodą lanych płytek Kocha lub w mniej pracochłonny sposób

— wykonanie posiewu redukcyjnego za pomocą platynowego oczka

(zwanego też ezą) na powierzchni odpowiedniej płytki agarowej

Bakterie beztlenowe zawiesza się w upłynnionym podłożu agarowym

o temperaturze 45°C i inkubuje się bez dostępu tlenu Przez

ostrożne pobranie pojedynczej kolonii, zawieszenie jej w odpowiednim

roztworze i wielokrotne wysiewanie metodą redukcyjną na podłożu agarozowym można zazwyczaj wyizolować czystą kulturę większości

szczepów.

Otrzymywanie czystej kultury można też przeprowadzić na podłożu

płynnym, pod warunkiem że poszukiwany mikroorganizm dominuje

ilościowo w wyjściowym materiale. W wyniku wykonania serii rozcieńczeń

w płynnym podłożu można osiągnąć taki etap, że w ostatnim rozcieńczeniu

będzie obecna tylko jedna komórka. Powstały z niej klon będzie czystą

kulturą.

Hodowla mieszana. Naturalne populacje zazwyczaj składają się z mieszaniny różnych mikroorganizmów. Spotykamy wśród nich dużą różnorodność wzajemnych relacji. Mamy więc do czynienia z konkurencją, jeśli organizmy współzawodniczą o jeden substrat, lub też z komensalizmem albo mutualizmem W badaniu tych zależności coraz szersze zastosowanie znajdują hodowle mieszane. W hodowlach okresowych, jak i w systemie hodowli ciągłej można stosować określone warunki, a także monitorować kolejność pojawiania się różnych mikroorganizmów i ich produktów metabolicznych. Dostarczają one dowodów na synergistyczne lub antagonistyczne zależności między tymi mikroorganizmami. Hodowlę mieszaną o pożądanym składzie można uzyskać przez zmieszanie próbek czystych kultur. Doświadczenia z mieszanymi hodowlami o zdefiniowanym składzie dają wgląd w złożone zależności między mikroorganizmami w ich naturalnym środowisku.

Fizjologia wzrostu

Wzrost może być rozważany jako powiększanie ilości żywej substancji

określanej zazwyczaj liczbą żywych komórek lub całkowitą masą

komórek. Szybkość wzrostu mierzy się zmianami liczby komórek

lub ich masy w jednostce czasu. W przypadku organizmów jed-

nokomórkowych wzrost polega przede wszystkim na zwiększaniu liczby

komórek. Komórki bakteryjne rozmnażają się przez podział. Najpierw

rozmiar komórki podwaja się, a następnie komórka dzieli się na dwie

komórki potomne, które mają w przybliżeniu ten sam rozmiar co

pierwotna komórka macierzysta. Czas niezbędny do podwojenia liczby

komórek nazywa się czasem generacji, a czas potrzebny do podwojenia

masy komórkowej określa się jako czas podwojenia. Oczywiście,

w takich warunkach, kiedy masa komórkowa i liczba komórek podwajają

się w tych samych przedziałach czasowych, czas generacji (g) i czas

podwojenia (td) są sobie równe.

Metody określania liczby i masy bakterii

Określanie liczby bakterii. Niekoniecznie wszystkie komórki w populacji

bakteryjnej są żywe. Tylko te komórki są uważane za żywe, które

mogą rosnąć na powierzchni lub wewnątrz pożywki agarowej tworząc

kolonie lub takie, które rosnąc w pożywce płynnej wytwarzają zawiesinę.

Metoda przyżyciowego liczenia komórek polega na określeniu liczby

żywych komórek w danej populacji, podczas gdy „całkowita liczba

komórek" obejmuje zarówno żywe, jak i te, których obecność wykrywa

się innymi metodami, obejmującymi także komórki martwe lub uszkodzone.

Całkowita liczba komórek.

1) Najpowszechniejszą metodą określania całkowitej liczby

komórek jest liczenie, z użyciem mikroskopu, komórek zawieszonych w cienkiej warstwie

w specjalnej komorze o znanej objętości (np. w komorze Neubauera, Thoma lubPetroff-Hauzera). Dla warstwy o grubości 0, 02 mm i powierzchni kwadratu o boku równym 0, 05 mm objętość komory wynosi 5 x 10~ 8 cm3, a zatem liczba komórek tam znalezionych musi być pomnożona przez 2 x 107 w celu otrzymania liczby komórekw mililitrze.

2) Liczenie względem znanej liczby małych cząstek, jak np. erytrocytów we krwi (w przybliżeniu 5 x 106/ml), jest jedną z najstarszych metod.

3) Elektroniczny aparat zwany licznikiem Coultera bardzo ułatwia określanie całkowitej liczby komórek. Wykorzystuje on spadek przewodnictwa roztworu elektrolitu podczas przechodzenia komórki bakterii (lub małej cząstki) przez wąski otwór.

4) Kiedy mamy do czynienia z liczbą komórek mniejszą niż 106/ml, można zastosować metodę filtracji membranowej. Znana objętość wody morskiej, stawowej lub pitnej jest przepuszczana przez filtr membranowy,

który jest następnie suszony i barwiony. Filtr taki pod działaniem pewnych odczynników można uczynić przezroczystym, tak że nadaje się on do liczenia bakterii na jego powierzchni z użyciem mikroskopu.

Liczba żywych komórek. Zazwyczaj wykorzystuje się liczenie kolonii wytworzonych przez żywe komórki w odpowiednich warunkach wzrostu. Według metody lanych płytek Kocha,odmierzoną objętość odpowiednio rozcieńczonej zawiesiny hodowli miesza się z płynnym agarem odżywczym (o temperaturze 40-45°C), wylewa na płytkę Petriego i pozostawia do

zastygnięcia. Zawiesina bakterii może też być rozprowadzona po powierzchni agaru za pomocą specjalnej sterylnej głaszczki. Inną możliwością jest umieszczenie komórek na filtrze membranowym, który następnie zostaje położony na agarze odżywczym lub kartoniku

pokrytym pożywką. We wszystkich tych przypadkach liczy się kolonie, które wyrosły po inkubacji pożywki w odpowiednich warunkach. Zastosowanie metody lanych płytek Kocha, jak również innych metod pokrewnych, znajduje zastosowanie tylko w homogennych zawiesinach danego szczepu czy gatunku, a nie do liczenia indywidualnych komórek różnych gatunków w mieszanej populacji.

Oznaczanie masy bakterii. Wybór metody oznaczania masy bakterii

zależy od sytuacji i celu jakiemu ma służyć to oznaczenie. Na przykład

do określenia wydajności wzrostu stosuje się najczęściej badanie suchej

lub mokrej masy. Aby jednak ocenić aktywność enzymatyczną i metaboliczną,

właściwsze będzie oznaczanie zawartości białka lub azotu w danej

zawiesinie bakterii. Bardzo często wybór metody jest podyktowany

głównie szybkością wykonania i prostotą. Dlatego metody pośrednie,

chociaż wymagają kalibracji, są chętniej stosowane niż bezpośrednie.

Metody bezpośrednie.

1) Oznaczanie mokrej masy po odwirowaniu. Po wysuszeniu

odwirowanych komórek do stałej wagi można też określić suchą masę. Obie te procedury są obciążone poważnymi błędami systematycznymi.

2) Dokładniej można oznaczyć zawartość całkowitego azotu (mikrometodą Kjeldahla z mikrodyfuzją amoniaku) oraz zawartość węgla (wg Van Slyke-Folcha).

3) W oznaczeniach rutynowych z powodzeniem stosuje się ilościowe oznaczenie bakteryjnych białek. Szczególnie wygodne są reakcje oparte na pomiarach kolorymetrycznych, jak np. reakcja biuretowa

i inne. Mikrometody oparte są na oznaczeniach reprezentatywnych składników białek, takich jak tyrozyna czy tryptofan w metodzie Lowry'ego lub Folina-Ciocalteu.

Metody pośrednie.

1) Metody, które są oparte na pomiarze zmętnienia zawiesiny bakterii są

bardzo dogodne do oznaczania masy bakterii. Zazwyczaj stopień zmętnienia zawiesiny bakteryjnej przedstawia się w postaci ekstynkcji (turbidometria), chociaż dla pewnych celów właściwszy bywa pomiar światła rozpraszanego (nefelometria). Zachowanie liniowości między tymi pomiarami a masą bakterii pozostaje tylko w wąskim zakresie gęstości komórek. Ponieważ rozpraszanie światła przez komórki zależy od ich wielkości, średnicy,

kształtu, współczynnika refrakcji światła, a także składu i turgoru komórki, konieczne jest przeprowadzenie w każdych warunkach kalibracji pomiarów optycznych w stosunku do bardziej bezpośrednich parametrów (np. sucha masa, zawartość azotu lub węgla).

2) Właściwą miarą masy bakteryjnej mogą też być pewne funkcje fizjologiczne, które sąbezpośrednio związane ze wzrostem zużycia tlenu, wytwarzaniem CO2, lub kwasu. Takie oznaczenia są użyteczne w tych przypadkach, w których inne metody zawodzą, np. kiedy mamy do czynienia z bardzo małą gęstością komórek. Pomiary aktywności metabolicznej można przeprowadzać z zastosowaniem różnych metod miareczkowych, manometrycznych, elektrochemicznych itd. Dla właściwej, a nie tylko względnej oceny masy bakterii, pomiary dokonywane tymi metodami również muszą być skorelowane z pomiarami bezpośrednimi

(np. z wartością suchej masy).

Wzrost logarytmiczny i czas generacji

Bakterie namnażają się przez podział, w wyniku którego powstają dwie

komórki potomne. Dlatego też ich rozmnażanie odbywa się w postępie

geometrycznym 2°-> 21 ->22->23... 2". Liczba komórek zwiększa się

w każdym przedziale czasowym pewną ilość razy określoną przez stały

czynnik. Ten typ wzrostu nazywamy wzrostem logarytmicznym *.

Wzrost populacji bakteryjnych

Każda komórka potomna powstała w wyniku podziału komórkowego może

sama rosnąć i dzielić się. W związku z tym, w sprzyjających warunkach z jednej komórki może powstać liczna populacja. Populacje mogą się rozwijać na powierzchniach stałych lub w płynach. W bakteriologii każde ciało stałe lub płyn przygotowany specjalnie do wzrostu bakterii nazywamy pożywką (podłożem)

Wzrost na podłożu stałym

Jednym z typowych stałych podłoży powszechnie stosowanych w bakteriologii jest galaretowata substancja (żel agarowy) zawierająca związki odżywcze i inne składniki. Załóżmy, że pojedyncza komórka bakteryjna została umieszczona na powierzchni takiego podłoża dostarczającego wszystkich składników potrzebnych do wzrostu i podziału. Komórka więc rośnie, dzieli się na dwie, a każda

z komórek potomnych powtarza te procesy. W trakcie ciągłego wzrostu i podziału potomstwo komórki wyjściowej tworzy widoczną gołym okiem masę komórek. Nazywamy ją kolonią.

Zazwyczaj, w określonych warunkach wzrostu, każdy gatunek tworzy kolonie o charakterystycznym rozmiarze, kształcie kolorze i konsystencji.

Podczas wzrostu na różnych podłożach lub w innych warunkach różnicującychmogą powstawać różne rodzaje kolonii. Wielkość kolonii może być ograniczonanp. przez miejscowe wyczerpanie się substancji odżywczych (zależne od wzrostukolonii). Z tego powodu, liczne, położone blisko siebie kolonie są przeważnie mniejsze od kolonii odległych. Szybkość powiększania się rozmiarów kolonii zależy od temperatury i innych czynników. Bakterie wytwarzające barwniki tworzą zazwyczaj jaskrawo zabarwione kolonie (np. czerwone, żółte, fioletowe).

Kolonie bakterii nie mających tej cechy są szare, białawe lub kremowe. Konsystencja kolonii może być śluzowata (lepka, jak śluz), masłowata (podobna domasła), krucha (rozpadająca się) itp. Powierzchnia kolonii natomiast bywa gładka lub szorstka, świecąca lub matowa itp.

Przypuśćmy, że nie pojedyncza komórka, lecz ich duża liczba została rozprowadzona na powierzchni podłoża. Może wówczas brakować dostatecznego miejsca do wytworzenia się pojedynczych kolonii. Potomstwo tak wysianych komórek będzie tworzyć jednolitą warstwę pokrywającą całą powierzchnię podłoża.

Jednolity wzrost nazywany jest zlewającym się („murawa").

Zlewający się wzrost obserwuje się również po wysianiu na podłoże jednej lubkilku ruchliwych bakterii. Potomstwo takich bakterii może pływać w wilgotnej warstewce pokrywającej powierzchnię i w ten sposób rozprzestrzeniać się pocałym podłożu.

Wzrost w pożywce płynnej

W pożywce płynnej bakterie mogą się swobodnie przemieszczać albo na drodze dyfuzji, albo, w przypadku gatunków ruchliwych, na drodze aktywnego ruchu.W ten sposób wzrost i podział komórek w podłożu płynnym doprowadza do ich jednolitego rozprzestrzenienia się w całym środowisku. Zwiększenie się liczby komórek prowadzi zazwyczaj do wzrostu zmętnienia pożywki. Wyjątkowo niektóre bakterie mają skłonność do tworzenia warstwy (błony) na powierzchni podłoża. Podłoże pod błoną może być prawie pozbawione komórek. Niektóre błony składają się zarówno z bakterii, jak i produktów ich metabolizmu, np.

szczepy Acetobacter xylinum tworzą sztywną błonę zawierającą celulozę.

Hodowle okresowe

Przypuśćmy, że kilka bakteryjnych komórek zostało wprowadzonych do odpowiedniego płynnego podłoża, które następnie było przechowywane w temperaturze odpowiedniej dla danego gatunku. W regularnych odstępach czasu pobrano małe próbki i policzono zawarte w nich bakterie.

Sposób ten umożliwia śledzenie rozwoju populacji, czyli

wzrostu liczby komórek w czasie. Wykres przedstawiający liczbę komórek

w funkcji czasu nazywamy krzywą wzrostu. Dla komórek danego gatunku

bakterii rosnących w ściśle zdefiniowanych warunkach krzywa wzrostu ma

określony kształt.Namnażając bakterie w lub na podłożu otrzymujemy hodowlę. Hodowlą nazywamy więc płynne lub stałe podłoże z bakteriami wyrosłymi (lub nadal rosnącymi) w nim lub na nim. Zabiegi zmierzające do utrzymania określonej temperatury (i/lub innych żądanych czynników) potrzebnych do wzrostu bakterii nazywamy inkubacją. Początkowe wprowadzenie komórek do podłoża zwie się inokulacją (zaszczepieniem).

Nie zawsze podział komórki rozpoczyna się natychmiast po wprowadzeniu

bakterii do świeżego, płynnego podłoża. Często występuje początkowa faza

zastoju (faza lag), w czasie której komórki dzielą się powoli lub nie dzielą sięwcale. W fazie tej zachodzi adaptacja do nowego środowiska — np. tworzone są enzymy niezbędne do wykorzystania nowych, dostępnych substancji pokarmowych. Długość początkowej fazy zastoju zależy w znacznym stopniu od warunków,w których bakterie bytowały przed wprowadzeniem do określonego podłoża. Długa faza zastoju występuje, gdy komórki przebywały w trudnych warunkach lub rosły wykorzystując inne substancje pokarmowe lub w innej temperaturze. W przypadku wzrostu komórek w podobnym lub tym samym podłożu początkowa faza zastoju jest krótka lub w ogóle nie występuje. Podczas (adaptacyjnej) fazy początkowego zastoju zachodzi synteza związków

chemicznych, ale wzrostowi masy populacji bakteryjnej nie towarzyszy

przyrost liczby komórek. Mówimy wówczas, że komórki charakteryzują się

wzrostem niezbalansowanym.

Po adaptacji do nowego podłoża, komórki zaczynają rosnąć i dzielić się

z szybkością maksymalną dla danego gatunku w tych warunkach. Tę fazę

wzrostu nazywamy logarytmiczną lub wykładniczą. Liczba komórek podwaja się ze stałą szybkością, co dotyczy również całej populacji. Mówimy o wzroście zbalansowanym.

Hodowle ciągłe

Wzrost bakterii w stałej objętości podłoża (jak w hodowlach okresowych) sprawia, że jego skład nieustannie się zmienia w wyniku zużycia substancji odżywczych i nagromadzenia się produktów odpadowych. Hodowle okresowe są przydatne do wielu badań, choć czasami lepiej jest hodować bakterie w stałych, kontrolowanych i ściśle określonych warunkach. Możemy to osiągnąć zakładając

hodowle ciągłe (hodowle z ciągłym przepływem, hodowle otwarte). W takich hodowlach bakterie rosną w podłożu płynnym, w aparacie zwanym chemostatem, a podczas wzrostu zapewniony jest ciągły dopływ świeżego, sterylnego podłoża i jednoczesny, zachodzący z tą samą szybkością, odpływ hodowli (tj.podłoża i komórek). Stałe i silne wytrząsanie zapewnia szybkie mieszanie się wpływającego, świeżego podłoża z hodowlą w chemostacie. Takie warunki umożliwiają ciągły wzrost logarytmiczny, tzn. zrównoważony w przedłużonym czasie. Hodowle ciągłe, ze względu na wzrost w stałych i określonych warunkach,są użyteczne np. do badań bakteryjnego metabolizmu.

Wzrost synchroniczny

W populacji rosnących bakterii komórki nie dzielą się jednocześnie. W laboratorium możemy jednak otrzymać populacje komórek dzielących się w przybliżeniu w tym samym czasie. Logarytmiczna część krzywej obrazującej taki typ wzrostu— zwany wzrostem synchronicznym — ma wówczas przebieg skokowy,a każdy skok obrazuje gwałtowne podwojenie się liczby komórek.Jedna z metod otrzymania hodowli synchronicznej, czyli synchronizacji hodowli, opiera się na tym, że stosunek masy do objętości, tj. gęstość bakterii zmienia się podczas cyklu komórkowego. Gęstość jest największa w komórkach tuż przed podziałem i w świeżo powstałych komórkach potomnych. W populacji niesynchronicznej komórki charakteryzujące się najmniejszą gęstością są więc prawdopodobnie w podobnych stadiach cyklu komórkowego. Ta subpopulacja mniej gęstych komórek może być oddzielona od reszty populacji przez zastosowanie

techniki wirowania w gradiencie gęstości. Zaletą tej czysto fizycznej metody jest możliwość uniknięcia zakłóceń metabolizmu komórkowego.