Chromatografia II

Analiza ilościowa w chromatografii gazowej (GC).

Chromatografia gazowa jest powszechnie wykorzystywana do analizy ilościowej nawet bardzo złożonych mieszanin i stanowi ostatni etap w analizie chromatograficznej (pierwszy – rozdział na poszczególne składniki; drugi - identyfikacja związków). Warunkiem wykonania poprawnych pomiarów jest dokładność na każdym etapie procesu chromatograficznego, włączając w to:

- zachowanie stałych warunków pomiaru (np. stała lub zmieniająca się o stałą wartość temperatura kolumny, stały przepływ gazu nośnego)

- odpowiednie dozowanie

- możliwie duża powtarzalność kolejnych analiz

- odpowiednia detekcja i przetwarzanie sygnału uzyskiwanego w detektorze (zakres liniowości wskazań detektora)

- właściwe przygotowanie próbki do rozdziału

Głównym parametrem wykorzystywanym w analizie ilościowej jest pole powierzchni piku chromatograficznego. Obecnie powierzchnie pików są wyznaczanie automatycznie przez rejestrator. Pole powierzchni sygnału symetrycznego można obliczyć korzystając ze wzorów:

S = h • w1/2h

S = 0, 5 • h  • wb

S- powierzchnia piku

h- wysokość piku

w_1/2h- szerokość piku w połowie wysokości

w_b – szerokość piku przy podstawie

Powierzchnię piku niesymetrycznego obliczamy ze wzoru:

$$S = h\frac{\text{w\ }0,15 + w\ 0,85}{2}$$

w_0,15 i w_0,85- szerokość piku chromatograficznego na 15% i 85% jego wysokości

Znajomość pól powierzchni pików chromatograficznych poszczególnych składników mieszaniny pozwala na określenie procentowego udziału rozdzielanych związków w mieszaninie, jak również określenie dokładnej ilości danego analitu w badanej próbce.

Detektory nie zawsze reagują jednakowo na takie same masy różnych substancji. Dlatego też, aby otrzymane wyniki analiz ilościowych odpowiadały rzeczywistości wprowadza się współczynnik korekcyjny f . Współczynnik ten jest liczbą, przez jaką należy pomnożyć pole powierzchni piku chromatograficznego, aby uzyskać wartość wprost proporcjonalną do masy związku. Jego wartość ustala się wobec głównego składnika próbki, lub wobec odpowiedniego wzorca (dla niego f=1), wykorzystując zależność:

$$\frac{mA}{mw} = f\frac{YA}{Yw}$$

Stąd:

$$f = \frac{mA \bullet Yw}{mw \bullet YA}$$

m_A- masa substancji badanej

m_w- masa wzorca

Y_A- pole powierzchni lub wysokość piku substancji badanej

Y_w- pole powierzchni lub wysokość piku wzorca

Metody obliczania ilości poszczególnych składników rozdzielonej próbki:

1. Metoda kalibracji zewnętrznej:

Polega na sporządzeniu kilku roztworów o znanym stężeniu związku, którego ilość chcemy wyznaczyć oraz wykonaniu analizy chromatograficznej dla każdego z tych roztworów. Mając pola powierzchni pików chromatograficznych oraz znając stężenia wcześniej przygotowanych roztworów wzorca wykreśla się krzywą kalibracyjną, która przedstawia zależność powierzchni piku od stężenia. Ilość związku w badanej próbce odczytuje się z krzywej kalibracyjnej.

W celu wykonania wiarygodnej krzywej kalibracyjnej należy przeprowadzać poszczególne analizy w tych samych warunkach oraz pobierać i dozować dokładną ilość kolejnych próbek. Stanowi to częsty problem, co sprawia, że metoda kalibracji zewnętrznej jest rzadko stosowana w analizie ilościowej za pomocą GC.

2. Metoda normalizacji wewnętrznej:

Służy do wyznaczenia procentowego udziału wszystkich składników rozdzielonej mieszaniny. Sumę powierzchni pików chromatograficznych związków rozdzielonej mieszaniny przyjmuje się za 100%, natomiast powierzchnia związku P_A w stosunku do sumy powierzchni wszystkich sygnałów odpowiada % zawartości związku w próbce.

$$\sum_{}^{}{Pi - 100\%}$$

PA − xA%

stąd:

$$xA\% = \ \frac{PA}{\sum_{}^{}{Pi\ }} \bullet 100$$

3. Metoda wzorca dodanego

Polega na wykonaniu dwóch równoległych analiz –badanej próbki, w której znajduje się związek A oraz takiej samej próbki, do której została dodana dokładnie znana ilość wzorca, który jest związkiem A. Porównując uzyskane chromatogramy widać, że na chromatogramie po rozdziale drugim pole powierzchni piku chromatograficznego dla związku A jest większe od pola powierzchni piku chromatograficznego związku A po rozdziale pierwszym (bez wzorca). Pole to zwiększyło się proporcjonalnie do ilości dodanego wzorca. Wykorzystując tą zależność i stosując poniższe wzory można obliczyć ilość związku A w badanej próbce:

$$\frac{PA}{PB} = \frac{PA'}{PB'}$$

Pc = PA′+Pw

Pw = Pc − PA^′

$$\frac{Pw}{PA} = \frac{mw}{mA}\ $$

P_A,P_A’- pola powierzchni pików chromatograficznych odpowiadające ilości związku A w badanej próbce (odpowiednio: po pierwszym i drugim rozdziale)

P_B, P_B’- pola powierzchni pików chromatograficznych odpowiadające ilości związku B w badanej próbce (odpowiednio: po pierwszym i drugim rozdziale)

P_c- pole powierzchni piku chromatograficznego związku A z dodanym wzorcem

P_w- pole powierzchni piku chromatograficznego odpowiadające ilości dodanego wzorca

m_A- masa związku A w badanej próbce

m_w- masa dodanego wzorca do próbki, będącego jednocześnie związkiem A

4. Metoda wzorca wewnętrznego:

Najbardziej rozpowszechniona metoda analizy ilościowej GC. Polega na dodaniu do próbki określonej ilości wzorca wewnętrznego, który nie jest jednym z analizowanych związków. Należy pamiętać, że wzorzec trzeba dodać przed przygotowaniem próbki do analizy. Zwykle stosuje się wzorce zbliżone strukturalnie do związków obecnych w próbce i o podobnej temperaturze wrzenia. Znając pola powierzchni pików chromatograficznych rozdzielanych związków oraz współczynnik korekcyjny można obliczyć ilość określonego związku w badanej próbce stosując wzór:

$$\frac{mA}{mw} = f\frac{YA}{Yw}$$

stąd:

$$mA = \ f\frac{YA}{Yw}\ \bullet mw$$

m_A- masa substancji badanej

m_w- masa wzorca

Y_A- pole powierzchni lub wysokość piku substancji badanej

Y_w- pole powierzchni lub wysokość piku wzorca

Często nie ma możliwości wyznaczenia współczynnika korekcyjnego, wtedy przyjmuje się, że dla wszystkich związków f=1, więc ilość związku w badanej próbce obliczamy stosując wzór:

$$ma = \ \frac{Ya}{Yw}\ \bullet mw$$

Wykonanie ćwiczenia:

Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z różnymi metodami określania ilości poszczególnych związków w badanej próbce przy użyciu chromatografii gazowej.

W związku z tym należy wykonać szereg rozdziałów chromatograficznych w temperaturze 65°C mieszaniny alkoholi, z dodatkiem odpowiednich wzorców. W skład mieszaniny wchodzą:

Alkohol	Gęstość [g/ml]
tert- butylowy	0,79
n- butanol	0,79
izo-amylowy I rzędowy	0,78
izo-amylowy II rzędowy	0,80
n-amylowy	0,80
octan butylu	0,82

W metodzie wzorca dodanego do mieszaniny alkoholi dodawano 0,25 ml odpowiednio każdego z wyżej wymienionych alkoholi.

W metodzie wzorca wewnętrznego, jako wzorzec wewnętrzy użyto izo- butanol [0,81 g/ml], którego dodano 0,25 ml do badanej próbki.

Opracowanie wyników:

Na podstawie otrzymanych chromatogramów i pól powierzchni pików chromatograficznych należy ustalić kolejność wychodzenia alkoholi z kolumny, a następnie obliczyć ilość każdego z alkoholi w rozdzielanej mieszaninie używając metody: normalizacji wewnętrznej, wzorca dodanego oraz wzorca wewnętrznego. Opracowane wyniki umieścić w sprawozdaniu.

Wymagania:

Znajomość i praktyczne zastosowanie metod analizy ilościowej w chromatografii gazowej (metoda kalibracji zewnętrznej, normalizacji wewnętrznej, wzorca wewnętrznego, wzorca dodanego).

Literatura:

1. Chemia analityczna. Podręcznik dla studentów pod redakcją Ryszarda Kocjana. Wydanie II. Wydawnictwo Lekarskie PZWL

2. Adamowicz A., Dziedzic J., Kruczek M., Miałkowski F., Petrusewicz W. Analiza instrumentalna. Podręcznik dla słuchaczy medycznych studiów zawodowych wydziałów analityki

3. J. Minczewski, Z. Marczenko, Chemia analityczna. PWN, Warszawa 2005.

4. E. de Hoffmann, J. Charette, V. Stroobant. Spektrometria mas rozdział 3. Wydawnictwo Naukowo Techniczne.

+ inne podręczniki do chemii analitycznej oraz biofizyki