Manipulowanie ganami

Manipulowanie genami Inżynieria genetyczna przenoszenie genów z jednego organizmu do innego, bądź na zmodyfikowaniu genomu poprzez izolowanie lub eliminację kodu genetycznego. W wyniku tego typu zabiegów organizm ulega modyfikacji, przybierając cechy zgodne z oczekiwaniami; zmianom ulegają właściwości fizyczne (np.: rozmiar, masa, wygląd, kolor, itp.) lub fizjologiczne (np.: procesów wzrostu i starzenia się, odporności, itp.).

Korzyści:

• można poznać ewolucję organizmów

• poznanie funkcji genów (przede wszystkim ludzkich)

• walka z chorobami, nawet z tymi, które obecnie uznawane są za nieuleczalne i śmiertelne

Homogenizacja-sposób na uwolnienie zawartości komórek przez rozbicie błony komórkowej.

Jest to jedna z najczęściej używanych metod do dezintegracji miękkich tkanek

zwierzęcych. W zależności od rodzaju tkanki używa się różnych typów

homogenizatorów:

-Potter-Elvehjema (tkanki wątroby, serca, mózgu, mięśni gładkich),

-Dounce'a (tkanka mózgu, komórki z hodowli tkankowych),

-homogenizatora-miksera.

W czasie homogenizacji utrzymuje się obniżoną temperaturę. (0-4^oC) i dodatek

inhibitorów proteaz komórkowych. Postęp procesu można monitorować przez

obserwacje mikroskopowe lub przez pomiar uwolnionego białka komórkowego w

nadsączu.

Fluorescencja sortowania komórek aktywowanych (FACS) jest typem cytometrii przepływowej, w której cytometr został wyposażony w urządzenie sortowania komórek w polu elektrycznym. Odchyla on płynące komórki zgodnie z różnicami potencjału elektrycznego poszczególnych komórek, dzięki czemu poza możliwością oceny w sposób statystyczny parametrów strukturalnych zbiorów komórek (rozmiar, kształt, ziarnistość cytoplazmy, zawartość barwników naturalnych lub dodanych w wyniku barwienia, intensywność fluorescencji) możliwa jest dodatkowa ocena niektórych parametrów czynnościowych komórek.

W cytometrze przepływowym zawiesina odpowiednio zabarwionych komórek (rozcieńczona krew, próbka cytologiczna pobrana metodą biopsji aspiracyjnej, próbka płynu z jamy ciała, itp.) jest wytłaczana w otoczce płynu osłaniającego przez specjalną dyszę, w postaci laminarnie płynącego, cienkiego strumienia zawierającego rząd pojedynczych komórek. Jest to tzw. ogniskowanie hydrodynamiczne, w którym płyn osłaniający płynie szybciej, niż centralny strumień z komórkami. Strumień ten (o średnicy ok. 30 mikrometrów) przepływa przed optoelektronicznymi układami rejestrującymi (fotokomórkami lub fotopowielaczami), w którym pojedyncze komórki są oświetlane przez cienkie wiązki monochromatycznego, spolaryzowanego światła (lasera, wycinki widma światła lampy rtęciowej). Pojedyncze komórki rozpraszają, załamują, odbijają i absorbują światło przechodzące przez komorę pomiarową, powodując chwilowe zmiany sygnału elektrycznego z rejestrujących elementów optoelektronicznych. Zmiany te są zależne od barwy, struktury i intensywności zabarwienia komórki. Rejestrowane są: czas zmiany tego sygnału (wskazujący na wielkość przepływającego obiektu) i amplituda zmian sygnału (wskazująca na intensywność zabarwienia, ziarnistość) oraz zmiany polaryzacji w stosunku do pierwotnej polaryzacji światła lasera (wskazujące na ukształtowanie powierzchni struktury). Rozproszenie wiązki światła jest mierzone przez przedni detektor światła rozproszonego (ang. forward scatter channel), leżący w osi wiązki światła, którego sygnał informuje o wielkości komórki, oraz boczny detektor światła rozproszonego (ang. side scatter channel), ustawiony prostopadle do niej, którego sygnał uznawany jest za informujący o strukturze jądra. Bardziej rozbudowane cytometry mają dodatkowe układy optoelektroniczne ustawione pod różnymi kątami w stosunku do wiązki światła, informujące o powierzchni komórki. W przypadku pomiaru fluorescencji komórki te są wzbudzane do świecenia, a świecenie komórek jest także rejestrowane (po odpowiednim filtrowaniu wzbudzonego światła).

KULTURY TKANKOWE

Kultura tkankowa (ang. tissue culture) – tkanka hodowana na podłożu. Tkanki lub luźne komórki z tkanek rozwijają się poza organizmem. Można tak hodować również komórki ludzkie.

Komórki immortalizowane- kom. do których wprowadzono gen kodujący podjednostkę katalityczną telomerazy

Izolacja organelli

wirowanie różnicowe, wirowanie ze wzrastającym przyspieszeniem, najczęściej stosowana metoda rozdzielania homogenatu na frakcje subkomórkowe (organelle); ulepszoną techniką w. r. jest wirowanie w gradiencie gęstości.

Izolacja DNA

Jednym z najważniejszych etapów pracy z DNA stanowi prawidłowe pobranie materiału biologicznego, a także jego izolacja i przechowywanie. Bardzo ważny jest etap izolacji, ponieważ musi zapewnić on wysoką jakość preparatu DNA, dzięki czemu umożliwia to wykonanie dalszych analiz. Wśród materiałów biologicznych najczęściej wykorzystywanych do izolacji DNA należy krew obwodowa (w przypadku człowieka i zwierząt), zaś w przypadku roślin są to liście i młode siewki. Ponadto w badaniach dotyczących człowieka wykorzystuje się także DNA izolowane z:

-komórek nabłonka

-hodowli fibroblastów

-komórek płynu owodniowego (AFC), kosmówki (CVS)

- komórek cebulek włosów.

Rzadziej wykorzystywanym materiałem wyjściowym są plamy krwi, nasienia, szpik kostny, czy fragmenty tkanek(pobrane za pomocą biopsji cienkoigłowej). W przypadku korzystania z materiału archiwalnego i wykopaliskowego, DNA można izolować z czaszki, kości i zębów . Głównym celem izolacji materiału genetycznego jest otrzymanie (z maksymalną wydajnością) wysokocząsteczkowego DNA. Powinno to przebiegać z jednoczesnym oczyszczeniem preparatu DNA z białek oraz inhibitorów enzymów, które mogą stwarzać problemy podczas dalszej pracy z DNA.

Obecnie metody izolacji można podzielić na 3 główne grupy:

1) Izolacja DNA z zastosowaniem mieszaniny fenol: chloroform( stosowane do odbiałczania preparatów)

2) Izolacja DNA, która przebiega z wysoleniem białek z otrzymanych lizatów komórek

3) Izolacja DNA z wykorzystaniem odpowiedniego nośnika, do którego DNA będzie się wiązać, następnie odmycie zanieczyszczeń i uwolnienie związanego DNA [4].

Pomimo wielu różnych metod izolacji, nadal jedną z najlepszych pozostaje izolacja z zastosowaniem mieszaniny fenolu i chloroformu. Metoda ta dostarcza preparaty, które charakteryzuje wysoki stopień czystości. W związku z tym, preparaty te można dalej z powodzeniem stosować np. do analizy restrykcyjnej, klonowania czy reakcji PCR .

IZOLACJA mRNA

RNA jest znacznie bardziej narażony na degradację niż DNA. W materiale biologicznym oraz w środowisku zewnętrznym obecna jest duża ilość bardzo aktywnych i stabilnych rybonukleaz. Nawet po zastosowaniu wysokiej temperatury, np. 100°C, a także w obecności detergentów, np. SDS, enzymy te zachowują aktywność. Ponadto, wiele rybonukleaz nie wymaga dla swej aktywności kofaktorów, np. jonów dwuwartościowych, w związku z czym enzymu nie możemy zablokować stosując EDTA. Dlatego podczas izolacji RNA do inaktywacji RNaz należy stosować bardzo silne związki denaturujące białka, takie jak chlorowodorek guanidyny lub izotiocjanian guanidyny. Związki te, oprócz denaturacji rybonukleaz, umożliwiają również zniszczenie struktur komórkowych. RNazy powinny zostać również usunięte ze sprzętu używanego do izolacji. Do tego celu stosuje się inhibitory RNaz, tj. DEPC (dietylopirowęglan. Należy pamiętać aby roztwór ten poddać autoklawowaniu inaktywującemu DEPC, który jest silnie toksyczny. DEPC nie poddany inaktywacji blokuje aktywność enzymów wykorzystywanych na kolejnych etapach prac z RNA, np. odwrotnej transkryptazy.

Kolejnym, często stosowanym inhibitorem RNaz, jest tzw. RNazin - białko które inaktywuje RNazy wiążąc się z nimi. Inhibitor ten może towarzyszyć RNA podczas przechowywania oraz podczas reakcji enzymatycznych, gdyż nie powoduje inhibicji innych enzymów. Podczas izolacji RNA należy usunąć towarzyszący mu DNA. W tym celu stosuje się ekstrakcję fenolem o niskim pH. Kwaśny fenol powoduje usunięcie nadmiaru DNA z roztworu. DNA pozbywamy się również wytrącając RNA chlorkiem litu (LiCl). Dokładne usunięcie resztek DNA z preparatu można uzyskać wykonując trawienie DNazą wolną od RNaz.

W komórkach eukariotycznych cząsteczki rRNA, tRNA oraz RNA niskocząsteczkowy stanowią łącznie ok. 80-98% RNA komórkowego. Dlatego, jeżeli interesuje nas tylko pula mRNA, należy zastosować dodatkowy etap izolacji, podczas którego usuwamy z preparatu pozostałe kwasy rybonukleinowe. Stosowane w tym celu techniki wykorzystują fakt, że cząsteczki mRNA na 3’ końcach zawierają sekwencje poli(A). Sekwencje te mogą zostać związane z cząsteczkami poli(T) przyłączonymi do stałego podłoża np. w kolumnach chromatograficznych lub na kuleczkach magnetycznych.

Cząsteczki RNA nie związane z podłożem są następnie odmywane a oczyszczone cząsteczki mRNA poddawane są elucji. Po rozdziale elektroforetycznym całkowitego RNA w żelu agarozowym najlepiej widoczne są frakcje rRNA (Rys. 1). Ich obraz może być wykorzystany jako orientacyjny marker mas cząsteczkowych, gdyż znane są wielkości podstawowych frakcji rRNA występujących u poszczególnych organizmów. Intensywność prążków rRNA informuje nas o jakości preparatu, ich zanikanie świadczy o postępującej degradacji RNA. Frakcje mRNA, ze względu na ichniewielką ilość w preparacie oraz zróżnicowaną wielkość, charakterystyczną dla poszczególnych genów, nie są widoczne na żelach po rozdziale RNA całkowitego.

Nukleazy restrykcyjne

Nukleazy – enzymy przecinające wiązanie fosfodiestrowe w kwasach nukleinowych.

Typy nukleaz:

egzonukleazy – odcinają nukleotydy z końców nici kwasu nukleinowego

endonukleazy – przecinają kwas nukleinowy wewnątrz jego nici

restryktazy (enzymy restrykcyjne) – szczególny przypadek endonukleaz, enzymy związane z systemem restrykcji i modyfikacji DNA, o dużej specyficzności co do ciętej sekwencji DNA

deoksyrybonukleazy (DNAzy) – nukleazy degradujące DNA

rybonukleazy (RNazy) – nukleazy degradujące RNA

Enzymy restrykcyjne, inaczej restryktazy – enzymy z grupy endonukleaz przecinające nić DNA w miejscu wyznaczanym przez specyficzną sekwencję DNA. Rozpoznawana sekwencja z reguły ma charakter symetryczny o długości od 4 do 8 par zasad (pz), choć zdarzają się częste wyjątki. Restryktazy wraz z metylazami DNA stanowią system restrykcji i modyfikacji DNA, który w organizmach prokariotycznych stanowi mechanizm obronny zapobiegający włączeniu DNA bakteriofaga do genomu bakterii. Niespecyficzność enzymów restrykcyjnych w niektórych warunkach nazywa się aktywnością star.

Enzymy restrykcyjne naturalnie występują u bakterii i sinic, stanowiąc element tzw. systemu "restrykcji-modyfikacji". System ten chroni komórkę przed wnikaniem obcego DNA (np. DNA bakteriofagów).

System ten zakłada istnienie w komórce mikroorganizmów dwóch rodzajów enzymów:

restrykcyjna endonukleaza – rozpoznaje specyficzne miejsce cięcia

metylotransferaza – chroni przed cięciem

Modyfikacja taka chroni DNA przed atakiem własnych enzymów restrykcyjnych

Wyróżnia się następujące typy enzymów restrykcyjnych:

Typ I

wielopodjednostkowe kompleksy enzymatyczne zawierające aktywności metylazy i restryktazy. Przecinają DNA z dala od rozpoznawanej sekwencji, w bliżej nieokreślonym miejscu. Z tego powodu nie mają większego zastosowania praktycznego. Ich aktywność in vitro zależy od jonów Mg2+ oraz ATP i S-adenozylometioniny.

Typ II

przecinają DNA w zdefiniowanym miejscu, w obszarze rozpoznawanej sekwencji lub w jej pobliżu. Składają się z pojedynczych polipeptydów. Rozpoznają sekwencje symetryczne (palindromowe). Ich aktywność in vitro zależy od jonów Mg2+.

Typ IIs

zbliżone do typu II, przecinają z jednej strony rozpoznawanej sekwencji, która jest asymetryczna.

Typ III

duże kompleksy, które wymagają dwóch sekwencji rozpoznawanych w pobliżu siebie. Bez znaczenia praktycznego. Ich aktywność in vitro zależy od jonów Mg2+ oraz ATP.

Typ IV

zbliżone do typu II. Zawierają aktywność metylazy i restryktazy w tym samym polipeptydzie. Przecinają DNA w zdefiniowanym obszarze poza sekwencją rozpoznawania. Aktywności metylazy i restryktazy nie mogą działać równocześnie. Enzym "przełącza" się w zależności od substratu.

Enzymy restrykcyjne rozpoznające tę samą sekwencję DNA a przecinające DNA w odmiennych miejscach nazywamy neoschizomerami.

Enzymy restrykcyjne, różniące się sekwencją swojego polipeptydu i pochodzące z odmiennych organizmów, a rozpoznające tę samą sekwencję DNA i przecinające DNA w takim samym miejscu nazywamy izoschizomerami. Interesującą własnością izoschizomerów jest to, że pomimo tej samej specyficzności substratowej, z reguły mają zupełnie odmienną sekwencję i strukturę trzeciorzędową. Wskazuje to na ich osobne pochodzenie ewolucyjne.

Rozdział cząsteczek DNA na podstawie wielkości

Elektroforeza to metoda separacji makrocząsteczek. Pod wpływem przyłożonego napięcia cząsteczki te, obdarzone ładunkiem elektrycznym, wędrują w polu elektrycznym. Prędkość przemieszczania zależy od ładunku makrocząsteczki, jej rozmiaru, kształtu, a także oporów ruchu środowiska. Technika ta jest najczęściej stosowana do rozdzielenia DNA i jego analizy w żelu, a także do rozdzielania RNA czy białek.

Małe fragmenty DNA poruszają się szybko przez żel, duże fragmenty DNA – powoli. Normalnie DNA nie jest widoczny w trakcie tego procesu, dlatego do próbki DNA dodawany jest barwnik.

Wyróżnia się dwa rodzaje żeli:

• żele agarozowe – przygotowywane są z agarozy (wielocukier); stosowane do rozdzielania fragmentów DNA powyżej 500 pz;

• żele poliakrylamidowe – charakteryzują się większą rozdzielczością; używane do rozdzielania mniejszych fragmenty DNA (poniżej 500 pz).

Mapy restrykcyjne

Mapa restrykcyjna to rozmieszczenie w DNA miejsc rozpoznawanych przez różne enzymy restrykcyjne z uwzględnieniem odległości między nimi wyrażonej w liczbie nukleotydów. W celu utworzenia takiej mapy przeprowadza się trawienie DNA przy użyciu różnych restryktaz, stosowanych pojedynczo oraz w kombinacjach (w ilościach wystarczających lub niewystarczających do pełnego strawienia preparatu). Analiza produktów trawienia DNA rozdzielonych elektroforetycznie na żelu umożliwia ustalenie położenia oraz odległości pomiędzy sekwencjami wrażliwymi na działanie zastosowanych enzymów.

Sekwencjonowanie DNA

– technika odczytywania sekwencji, czyli kolejności par nukleotydowych w cząsteczce DNA.

Sekwencjonowanie dokonuje się obecnie głównie za pomocą zautomatyzowanych sekwencjonatorów. Manualne sekwencjonowanie stosuje się przy opracowywaniu nowatorskich metod, w niektórych laboratoriach dla krótkich fragmentów lub podczas ćwiczeń.

Przykład sekwencji DNA (początek operonu laktozowego E. coli z GenBank):

GACACCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGG

gdzie: A – deoksyadenozyna; C – deoksycytydyna; G – deoksyguanozyna; T – tymidyna

Sekwencjonowanie DNA to analiza, której celem jest poznanie kolejności ułożenia nukleotydów (tworzących informację genetyczną jednostek budujących nić DNA) wzdłuż nici DNA w komórkach danego osobnika.

Sekwencje Powtórzone

METODA SHOTGUN

• losowa fragmentacja DNA

• wybór fragmentów o odpowiednej wielkości

• wstawianie do wektora

• sekwencjonowanie

• składanie sekwencji w komputerze

Denaturacja i renaturacja DNA

Denaturacja DNA (topnienie DNA, mięknięcie DNA) – separacja podwójnej nici DNA na dwie pojedyncze nici wskutek zerwania więzi wodorowych pomiędzy nićmi.

Dwuniciowa helikalna struktura DNA jest względnie stabilna dzięki wiązaniom wodorowym między zasadami oraz oddziaływaniu nakładających się zasad. Dodatkowo helisa ulega solwatacji, powodującej wytwarzanie się powłoki hydratacyjnej z cząsteczek wody wokół DNA. Oddziaływania te trzeba przezwyciężyć, jeżeli chce się przeprowadzić proces topnienia DNA lub jego denaturacji.

Dwie nici DNA ulegają wyraźnemu rozdzieleniu po inkubacji w roztworach o pH>12 i pH<2, ze względu na jonizację zasad. Jonizacja przynosi w efekcie zmianę właściwości tworzenia wiązań wodorowych przez zasady, która prowadzi do zaburzenia normalnych wiązań wodorowych typu Watsona-Cricka między A i T oraz C i G. Dodatkowo przy bardzo wysokim lub niskim pH powłoka hydratacyjna otaczająca cząsteczkę DNA ulega zaburzeniu, powodując destabilizację nakładania się par zasad. Traktowanie DNA kwasem prowadzi do depurynacji i depirymidyzacji – utraty zasad przez trawienie wiązania glikozydowego. Wiązanie fosfodiestrowe w miejscach pozbawionych zasad staje się bardziej podatne na hydrolizę, wobec tego silne kwasy wywołują degradację DNA. Ze względu na to, że pojedyncze nici DNA są stosunkowo stabilne w środowisku alkalicznym, denaturację przeprowadza się zazwyczaj właśnie w takich warunkach.

Renaturacja

Szybka zmiana warunków, taka jak gwałtowne ochłodzenie próbki DNA po denaturacji termicznej, powoduje przejście rozdzielonych nici w nieuporządkowaną strukturę solenoidu. W tej konformacji 2 nici nie mogą na powrót utworzyć podwójnej helisy. Jednak jeżeli DNA ochładza się powoli, to małe komplementarne obszary przeciwnych nici DNA mogą się łączyć, dając krótkie obszary podwójnej helisy. Po takiej inicjacji pozostała część helisy szybko ulega renaturacji.

MANIPULOWANIE IN VITRO

-zastąpienie genu (aktywny jest tylko gen zmutowany)

-nokautowanie genu(nie ma żadnego aktywnego genu)

-dodanie genu(aktywne są obydwa geny)

ORGANIZMY TRANSGENICZNE

=Organizmy Modyfikowane Genetycznie, są to organizmy, których materiał genetyczny został wzbogacony o obce geny przeniesione z innego gatunku, wprowadzone do komórek przy pomocy metod inżynierii genetycznej. Ogólnie mówiąc modyfikacja polega na wszczepieniu do genomu modyfikowanego organizmu fragmentu DNA z innego organizmu, który odpowiedzialny jest za daną cechę, lub też na modyfikacji genu, lub usunięciu go całkowicie z organizmu.

Przenoszony gen to tzw. transgen - stąd organizmy transgeniczne. Po przeniesieniu transgenu jest on na stałe włączony do genomu gospodarza i od tej pory już będzie obecny u wszystkich organizmach potomnych - nie utraci transgenu.

W Ustawie o organizmach transgenicznych zapisana jest definicja: Organizm modyfikowany genetycznie to organizm inny niż organizm człowieka, w którym materiał genetyczny został zmieniony w sposób nie zachodzący w warunkach naturalnych wskutek krzyżowania lub naturalnej rekombinacji

Modyfikacje roślin polegają przede wszystkim na wprowadzeniu lub usunięciu z nich określonych genów. Transgeniczne rośliny uzyskuje się przez wprowadzenie obcego DNA do protoplastów komórek lub za pośrednictwem infekujących roślinę bakterii. Modyfikacje mają przede wszystkim na celu:

* zwiększenie odporność na herbicydy(środki ochrony roślin), szkodniki, infekcje wirusowe,

bakteryjne i grzybowe,

* zwiększenie tolerancji na stres abiotyczny (głównie zmiany klimatyczne),

* przedłużenie trwałości owoców,

* poprawę składu kwasów tłuszczowych oraz aminokwasów białek,

* unormowanie stężenia fitoestrogenów,

* zwiększenie zawartości suchej masy,

* zmianę zawartości węglowodanów, karotenoidów i witamin,

* usunięcie toksyn czy związków utrudniających przyswajanie składników ,zwiększając np. zawartość substancji niezbędnych dla zdrowia,

Najczęściej modyfikowanymi roślinami są: kukurydza, pomidory, soja, ziemniaki, bawełna, melony, tytoń, buraki cukrowe.

Pierwszym organizmem transgenicznym był tytoń, a pierwszym wprowadzonym do obrotu pomidor Flavr Savr, który lepiej znosił transport i dłużej zachowywał świeżość. Nie wiadomo jednak, jakie mogą być skutki spożywania transgenicznych roślin.

Modyfikacje zwierząt mają na celu głównie uzyskanie zwierząt o pożądanych cechach w hodowli. Rozróżniamy nastepujace przykłady modyfikacji organizmów zwierzęcych :

• modyfikacje mające na celu wytwarzanie w organizmie zwierząt genetycznie zmienionych białek wykorzystywanych jako leki - czyli wykorzystywanie ich jako bioreaktorów. Modyfikowane w tym celu są głównie krowy, kozy, owce, gdyż pożądane białka wytwarzane są w gruczołach mlecznych i wydzielane z mlekiem. Produkowana jest antytrombina - ludzki enzym - czynnik krzepliwości krwi, pozwala na kontrolę powstawania zakrzepów, produkcja antytrypsyny - stosowanej w leczeniu rozedmy płuc, erytropoetyny - leczenie anemii.

• modyfikacje polegające na wprowadzeniu genów produkujących hormon wzrostu w celu uzyskania szybszego wzrostu zwierząt hodowlanych..

W ten sposób modyfikowane są głównie ryby: karpie, łososie, ale także na zwierzęta gospodarskie : świnie, króliki, owce.

• modyfikacje dzięki którym krowy dają więcej mleka, oraz mleko jest specjalnie przystosowane do produkcji serów.Taka modyfikacja powoduje to, iż z mleka łatwiej jest uzyskać ser - można go uzyskać więcej z tej samej objętości mleka oraz szybciej.

• modyfikacje mające na celu zwiększenie odporności na choroby.

• Oraz inne modyfikacje tj. :

- modyfikacje do celów naukowych zwierząt laboratoryjnych - myszy, szczurów,

- owce wytwarzające wełnę toksyczną dla moli i nie kurczącą się w praniu,

- lepsza jakość mięsa, mleka,

- transgeniczne koty dla alergików - ich sierść nie powoduje alergii,

- transgeniczne rybki akwariowe z genami z meduzy, dzięki którym fluoryzują w ciemności.