Analiza żywności – kolokwium wykładowe. 3.12.2015

Żywność – produkty roślinne i zwierzęce, które są spożywane przez ludzi.

Pożywienie – produkty pochodzenia zwierzęcego i roślinnego, a także substancje syntetyczne, które w stanie naturalnym lub po obróbce kulinarnej są przyjmowane doustnie, po czym są trawione w przewodzie pokarmowym i wchłaniane do krwioobiegu i stają się źródłem energii, materiałem budulcowym lub współdziałają w procesie metabolicznym.

Do żywności nie zalicza się:

• pasz

• żywych zwierząt, z wyjątkiem tych gatunków, które mogą być przygotowane, opakowane lub podane do spożycia

• roślin przed zbiorem

• środków farmaceutycznych

• kosmetyków

• tytoniu i wyrobów tytoniowych

• substancji odurzających

Dozwolone substancje dodatkowe – substancje nie spożywane odrębnie jako żywność, niebędące typowymi składnikami żywności, posiadające wartość odżywczą lub nie, których celowe użycie technologiczne w czasie produkcji, przetwarzania, przygotowania, pakowania, przewozu i przechowywania spowoduje zamierzone lub spodziewane rezultaty w środku spożywczym, albo w produktach będących jego komponentami.

Analiza – postępowanie badawcze polegające na fizycznym lub myślowym rozłożeniu całości na części i badanie cech i właściwości poszczególnych składowych.

Analiza chemiczna jakościowa i ilościowa jest archetypem analizy żywności.

Ocena – postępowanie wartościujące, które polega na wyznaczeniu stopnia zaspokojenia potrzeb lub oczekiwań przypisanych danemu przedmiotowi lub zjawisku.

Funkcje analizy i oceny żywności:

• poznawcza (analiza) – poznanie metod, składu i właściwości składników pokarmowych i artykułów żywnościowych

• kontrolna (ocena) – zapewnienie należytego bezpieczeństwa żywności oraz jakości handlowej.

Oznaczenie zawartości suchej substancji lub wody.

Zawartość wody ma wpływ na: jakość, wartość odżywczą, trwałość przechowalniczą. W surowcach i produktach żywnościowych woda może występować jako:

• woda wolna – rozpuszczalnik i wypełniacz wolnych przestrzeni w danym materiale porowatym.

• woda związana, która może występować jakoś: woda higroskopijna powlekająca powierzchnie wolne produktu; woda kapilarna, występująca w naczyniach włoskowatych i podlegająca zjawiskom kapilarnym; woda krystaliczna; woda konstytucyjna.

Przez suchą substancję danego produktu rozumiemy pozostałość po usunięciu wody.

Zawartość suchej substancji [%] = 100-zawartość wody

Zawartość wody [%]= 100-zawartośd suchej substancji

W analityce rozróżnia się dwa pojęcia suchej substancji:

Sucha substancja całkowita – składa się ze składników rozpuszczalnych w wodzie i substancji nierozpuszczonych np. celulozy.

Sucha substancja rozpuszczalna – w wodzie czyli ekstrakt.

Metody oznaczania wody w produktach spożywczych.

• Termograwimetryczne (termicznego suszenia)

• Refraktometryczne

• Chemiczne (Fischera i pokrewne)

• Destylacji azeotropowej

• Spektrofotometryczne w bliskiej podczerwieni

• Dielektryczne

• Rezonansu NMR

Metody termicznego suszenia.

Polega na usunięciu wody z badanego materiału przez suszenie w podwyższonej temperaturze pod normalnym lub zmniejszonym ciśnieniem w warunkach umownych, w których pozostałe składniki nie ulegają rozkładowi i przy złażeniu że woda jest jednym składnikiem lotnym.

Większość produktów suszy się w temperaturze w temperaturze 100-105^oC pod ciśnieniem normalnym 4-6h .

W przypadku produktów termostabilnych (zboża i ich przetwory) 130 ^oC przez 1-2h. Produkty termolabilne stosuje się temperaturę 60-70 oC oraz obniżone ciśnienie (ok. 100mm Hg). Dużym usprawnieniem są wagosuszarki.

Metody densymetryczne.

Polegają na przygotowaniu roztworu podstawowego i oznaczeniu jego gęstości, która na podstawie tablic przelicza się na zawartość ekstraktu.

Metody refraktometryczne.

Opiera się na pomiarze współczynnika załamania światła (refrakcji) światła. Wartość refrakcji stanowią :

- suma refrakcji poszczególnych atomów wchodzących w skład związku i ich udziałów procentowych,

- refrakcja grup funkcyjnych, wiązań, konfiguracji.

W wodnych roztworach cukrów prostych lub złożonych współczynnik refrakcji rośnie wraz ze wzrostem stężenia. Dla wody wynosi: n_D²⁰=1,3330 zaś dla sacharozy n_D²⁰=1,57.

Jeżeli w roztworach znajduje się kilka substancji o różnych współczynnikach załamania to refrakcji roztworu będzie wypadkowa tych współczynników załamania.

Metody chemiczne.
Umożliwiają oznaczenie całkowitej ilości wody, zarówno wolnej jak i związanej. Stosowane są dwie metody:

• Karla Fischera (oraz modyfikacje tej metody) oraz metoda z węglikiem wapnia.

Oznaczenie polega na bezpośrednim miareczkowaniu metanolowego roztworu próbki badanego produktu odczynnikiem K. Fischera (metanolowy roztwór jodu, tlenku siarki (IV) i pirydyny) i obliczeniu procentowej zawartości wody na podstawie objętości odczynnika Fischera zużytego w trakcie miareczkowania. Warunkiem uzyskania prawidłowego wyniku jest nieobecność w produkcie innych substancji mogących reagować ze składnikami odczynnikami Fischera adsorbującymi jod.

H₂O + I₂ + SO₂ + 3C₅H₅N + CH₃OH 2C₅H₅NHI + C₅H₅NSO₄HCH₃

Tlenek siarki (IV) redukuje jod w roztworze metanolu i pirymidyny stechiometrycznie do ilości wody w próbce; obecność pirymidyny jest konieczna do zobojętnienia nadmiaru kwasu siarkowego (VI) tworzącego się w początkowym etapie reakcji. Metoda ta jest dokłada, zwłaszcza w przypadku produktów z niewielką zawartością wody i daje większe wyniki niż metoda suszarkową.

Metoda destylacji azeotropowej.

Polega na oddestylowaniu wody z badanej próbki w postaci mieszaniny azeotropowej i zmierzeniu objętości wydzielonej wody z azeotropu po jej skropleniu (czynnik azeotropujący: ksylen, toluen).

Oznaczenie zawartości cukrów.

Metody oznaczania cukrów:

• Metody densymetryczne – opierają się na zależności między gęstością cieczy i zawartością sacharydu.

• Metody refraktometryczne – opierają się na pomiarze współczynnika załamania światła.

• Metody polarymetryczne – wykorzystują zdolność skręcania płaszczyzny przez cząsteczki sacharydów.

• Metody absorpcyjne – opierają się na pomiarze absorpcji związków barwnych powstających w wyniku reakcji chemicznej sacharydów.

• Metody chemiczne (miareczkowe) – wykorzystuje się właściwości redukcyjne sacharydów.

• Metody enzymatyczne

• Metody chromatograficzne (TLC, HPLC, GC)

Metody chemiczne (miedziowe) oznaczania cukrów.

Metody chemiczne stosuje się do oznaczania:

• cukrów prostych i ich mieszanin,

• disacharydów redukujących i ich mieszanin,

• disacharydów nieredukujących po uprzedniej hydrolizie.

Metody te polegają najczęściej na redukcji soli miedzi (II) w środowisku alkalicznym przez cukry redukujące. Uzyskane wyniki analizy interpretuje się następująco:

- w przypadku indywidualnego węglowodanu np. laktozy w mleku, wynik oznaczenia jest równoznaczny z oznaczeniem jego zawartości w danym produkcie,

- w przypadku mieszaniny cukrów prostych wynik oznaczenia jest wyrażany jako suma cukrów redukujących,

- w przypadku mieszaniny cukrów redukujących i sacharozy wynik oznaczenia jest wyrażany jako suma cukrów redukujących występujących w analizie i zawartości cukrów redukujących powstałych z hydrolizy sacharozy do monosacharydów.

Oznaczanie cukrów

- w produktach spożywczych właściwości redukujące wykazują aminokwasy (cysteina, kwas asparaginowy), białka, niektóre kwasy organiczne, aldehydy, zasady purynowe. Aby ograniczyć wpływ tych związków stosuje się odbiałczanie i klarowanie roztworów zawierających cukry.

- jeżeli produkt oprócz cukru zawiera alkohol przed oznaczeniem stosuje się destylację w celu usunięcia alkoholu.

PŁYNY KLARUJĄCE: płyny Carreza, płyny Herlesa.

Metoda Fehlinga.

Polega na miareczkowym oznaczeniu ilości cukru redukującego w roztworze potrzebnej do całkowitej redukcji jonów miedzi Cu²⁺ zawartej w roztworze odczynników Fehlinga I i II o znanym mianie. (Koniec miareczkowania rozpoznaje się po zaniku barwy niebieskiej). Jest to metoda subiektywna.

Skład płynów Fehlinga:

I: 69,28 CuSO₄ x 5 H₂O/l

II: 346g winianu sodowo-potasowego i 100g NaOH/l

Metoda Lane-Eynona

Jest modyfikacją metody Fehlinga; różnica polega na dodaniu pod koniec miareczkowania błękitu metylenowego (wskaźnika) którego barwa zanika w momencie gdy w roztworze jony miedzi (II) przereagowały do Cu₂O. Metoda ta jest powszechnie stosowana w przemyśle cukierniczym.

Oznaczenie cukrów redukujących metodą Bertranda.

Metoda Bertranda polega na ilościowym zredukowaniu jonów Cu²⁺ do Cu₂O przez cukry w środowisku zasadowym w temp. wrzenia, przy użyciu mieszaniny płyn ów Bertranda I i II. Po czym po dokładnym oddzieleniu osadu Cu₂O od mieszaniny reakcyjnej na lejku Schotta w warunkach bez dostępu tlenu do osadu, oraz przemyciu osadu przegotowaną wodą, działa się na osad Cu₂O odczynnikiem Bertranda III.

Pod wypływem kwasu siarkowego, zawartego w odczynniku, następuje Cu₂O i utlenienie jonów Cu⁺ do Cu²⁺ z równoczesną redukcją żelaza Fe³⁺ do Fe²⁺. Powstałe jony Fe²⁺ są oznaczane przez miareczkowanie mianowanym roztworem manganianu (VII) potasu. Przebieg reakcji jest następujący:

Cu₂O + Fe₂(SO₄)₃ + H₂SO₄ -> 2CuSO₄ + 2FeSO₄ + H₂O
10FeSO₄ + 2 KMnO₄ + 8H₂SO₄ -> 5Fe₂(SO₄)₃ + K₂SO₄ + 2MnSO₄ + 8H₂O

Skład odczynników Bertranda:

-płyn Bertranda I – zawiera 40 g CuSO₄·5H₂O

- płyn Bertranda II – zawiera 150 g NaOH i 200 g C₄H₄KNaO₆ (winian potasowo-sodowy)

- płyn Bertranda III – zawiera 50 g Fe₂(SO₄)₃ i 200 g stężonego H₂SO₄

Metody polarymetryczne.

Metody polarymetryczne wykorzystują zdolność skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego przez cząsteczki sacharydów, w których obecne są asymetryczne atomy węgla.

Atomami asymetrycznymi mogą być atomy pierwiastków czterowartościowych np. węgiel krzem, jeżeli wszystkie ich wartościowości są wysycone różnymi podstawnikami.

Mutarotacja – zmiany skręcalności płaszczyzny światła spolaryzowanego roztworu spowodowane wzajemnym przekształceniem się anomerów.

Oznaczenie sacharozy w produktach cukrowniczych.

Polaryzacja bezpośrednia – metodę tę stosuje się do produktów i półproduktów cukrowniczych zawierających duży udział suchej substancji (charakteryzujących się wysoką czystością produktu).

Polaryzacja inwersyjna – metodę tą stosuje się w celu wyeliminowania wpływu niecukrów na polarymetryczne oznaczenie sacharozy.

Skala cukrowa

26g sacharozy w kolbie o pojemności 100ml i spolaryzowana w rurce 200 mm daje polaryzację +100^oS.

Ten sam roztwór (26g sacharozy/100 ml) po inwersji wykazuje polaryzację -33,5^oS. Łączna zmiana wynosi 133,5^oS.

Zatem można z prostej proporcji obliczyć zawartość sacharozy w badanej próbce:

Oznaczenie skrobi metodą polarymetryczną.

Polega na uzyskaniu tzw. pseudoroztworu skrobi w środowisku stężonego kwasu solnego lub 50% roztworu chlorku wapnia o pH=2,5. Po przesączeniu pseudoroztworu na sączku, klarowny płyn przenosi się do rurki polarymetrycznej i mierzy kąt zmiany płaszczyzny polaryzacji. Na podstawie pomiaru polarymetrycznego w oparciu o wzór Biota oblicza się zawartość skrobi (X) w % z równania:

W przypadku użycia sacharymetru do pomiaru skręcalności, zawartość skrobi (X) w % oblicza się ze wzoru:

Białka – oznaczenie zawartości białka.

Znaczenie współczynnik 6,25

Białka zawierają prawie stałą ilośd azotu, która wynosi (15-18%), przeciętnie natomiast 16%, co stanowi 6,25 wszystkich pierwiastków (100:16 = 6,25).

Metody oznaczenia białek

Ilościowe oznaczenie zawartości białka można przeprowadzić:

Metodami bezpośrednimi – polegającymi na wytrąceniu białka z roztworu i wagowym oznaczeniu wytrąconego osadu lub oznaczeniu refraktometrycznemu, nefelometrycznym lub kolorymetrycznym białek będących w roztworze. Należą do nich:

• Metoda biuretowa

• Metoda Lowry’ego

• Metoda Bradforda

• Spektrofotometria w zakresie nadfioletu

• Promieniowanie w zakresie podczerwieni

• Metody immunoenzymatyczne

Metodami pośrednimi – opierającymi się na ilościowym oznaczeniu azotu przeliczeniu go na białko. Zalicza się do nich metodę Kjeldahla.

Oznaczenie białka surowego metodą Kjeldahla.
Polega ona na przeprowadzaniu mineralizacji produktu ze stężonym kwasem siarkowym (VI) „na mokro”, zalkalizowaniu roztworu, a następnie oddestylowaniu i ilościowym oznaczeniu powstałego amoniaku.

Spalenie w kolbie Kjedahla.

Oznaczenie azotu białkowego i niebiałkowego

Azot występujący w badanym produkcie można podzielić na dwie frakcje:

• Azot białkowy

• Azot niebiałkowy

Metody stosowane do oznaczania tych frakcji azotu opierają się na wytrąceniu białek z badanego roztworu i określeniu ilości azotu w osadzie i przesączu.

• Azot oznaczony w osadzie odpowiada azotowi białkowemu.

• Azot oznaczony w przesączu odpowiada azotowi niebiałkowemu.

Do wytrącania białek stosuje się jony miedzi (II), ołowiu (II), cynku, żelaza (III), kwas trichlorooctowy, metafosorowy V, taninę oraz alkohol etylowy (zazwyczaj 70%).

Oznaczanie różnych rodzajów białka

• Białko surowe – otrzymujemy z wyliczenia azotu ogólnego

• Białko czyste – otrzymujemy z wyliczenia azotu białkowego

• Białko strawne (przyswajalne) – oblicza się z różnicy białka czystego i nieprzyswajalnego

• Białko nieprzyswajalne – oznacza się po trawieniu pepsyną i kwasem solnym.

Metody bezpośrednie oznaczania białka

Metoda biuretowa

Służy do oznaczania białek i peptydów zawierających co najmniej 2 wiązania peptydowe, które tworzą w środowisku alkalicznym barwne kompleksy z jonami miedzi. Zawartość białka oznacza się przez pomiar zabarwienia roztworu przy długości fali λ=540 nm. Intensywność barwy w reakcji biuretowej jest proporcjonalna do liczby wiązań peptydowych.

Nazwa reakcji pochodzi od biuretu – związku powstającego w wyniku kondensacji dwóch cząsteczek mocznika, zawierającego w swej cząsteczce wiązania amidowe.

Stosowanie tej metody jest ograniczone obecnością soli amonowych, które również daje reakcje barwną z jonami miedzi; reakcji przeszkadza również siarczan (VI) magnezu, ponieważ wytrącający się w środowisku nierozpuszczalny wodorotlenek magnezu maskuje właściwy odczyn.

Metoda Lowry’ego

Jest to metoda kolorymetryczna oraz przebiega w 2 etapach:

1. Przyłączenie jonów miedzi do wiązań peptydowych (reakcja biuretowa).

2. Redukcja odczynnika Folina-Ciocalteu’a do barwnych tlenków przez tyrozynę, tryptofan, cysteinę i prawdopodobnie przez histydynę zawartych w oznaczanym białku. W wyniku reakcji powstaje barwny niebieski kompleks. Pomiar absorbancji wykonuje się przy długości fali 750 nm.

Metody oparte na wbudowaniu barwnika

Barwniki organiczne jak np. oranż G, czerń amidowa 10 B, mogą być ilościowo wbudowane do białek. Barwniki i białko w pewnych warunkach, zwykle poniżej punktu izoelektrycznego reagują ilościowo tworząc nierozpuszczalne kompleksy, które można oddzielić przez wirowanie.

Natężenie barwy roztworu zależy od ilości barwnika niezwiązanego z białkiem (barwnik dodawany jest w nadmiarze) czyli jest odwrotnie proporcjonalne do ilości białka w analizowanej próbce.

Czerń amidowa – aparat Pro – Milk do szybkiego oznaczenia białka w przemyśle mleczarskim.

Spektrofotometria w zakresie nadfioletu – do oznaczania białek na podstawie absorbancji jaką wykazują aminokwasy aromatyczne fenyloalanina, tryptofan, tyrozyna.

Promieniowanie w zakresie podczerwieni – wykorzystuje selektywne pochłanianie promieniowania przez grupy białek.

Metody immunoenzymatyczne – polegają na utworzeniu połączeń specyficznych przeciwciał z analizowanym białkiem oraz enzymem. Enzym ten reagując z bezbarwnym substratem przeprowadza go w barwny związek, którego stężenie można oznaczyć spektrofotometrycznie.