1. Podział enzymów

   1. Każdy enzym jest charakteryzowany czteroliczbowym numerem EC (enzyme code)

   2. Pierwsza liczba: klasa

   3. Druga liczba: podklasa

   4. Trzecia liczba: grupa biokatalizatorów

   5. Czwarta liczba: umiejscowienie enzymu w grupie

      1. Oksydoreduktazy

         • Przenoszenie elektronów i jonów H₃O⁺ z substratu na cząsteczkę akceptora (dehydrogenazy), aktywację tlenu cząsteczkowego elektronami z wytworzeniem wody lub nadtlenku wodoru (oksydazy)

         • Przyłączenie tlenu do substancji organicznej z przeniesieniem protonów i elektronów (oksygenazy), utlenianie związków organicznych z udziałem nadtlenku wodoru (peroksydazy)

      2. Transferazy

         • Transfer z donora na akceptor grup: aminowych, fosforanowych, acylowych, glikozydowych z jednej grupy OH cukru na inną

      3. Hydrolazy

         • Przebiegająca z udziałem wody hydroliza wiązań estrowych (estrazy, lipazy), glikozydowych (glikozydazy), amidowych (amidazy), peptydowych (proteinazy, aminopeptydazy, karboksypeptydazy)

      4. Liazy

         • Rozpad substratu poprzez przebiegające bez udziału wody rozszczepienie wiązań pomiędzy: atomami węgla (dekarboksylazy), węgla i tlenu (hydratazy węgla i azotu (deaminazy) lub węgla i siarki

      5. Izomerazy

         • Zmiany lokalizacji grup chemicznych w cząsteczkach substratu

      6. Ligazy (syntetazy)

         • Synteza substancji poprzez tworzenie nowych wiązań między atomami węgla oraz tlenu, siarki lub azotu, odbywające się kosztem energii wyzwolonej podczas rozpadu ATP lub innego związku makroergicznego

2. Budowa enzymów

   1. Białka

   2. Rybozyny

      • Kwasy nukleinowe

      • Przejawiają aktywność enzymatyczną

      • Biorą udział w przekształcaniu kwasów nukleinowych wykazując charakterystyczną dla enzymów białkowych kinetykę i specyficzność działania oraz podatność na inhibicję

   3. Koenzymy

      • Niebiałkowe, małocząsteczkowe koenzymy

      • Zazwyczaj nukleotydy, nukleozydy, witaminy i ich pochodne

      • Uczestniczą między innymi w przenoszeniu grup chemicznych

      • Aktywują enzymy zmieniając ich strukturę

      • Biorą udział w transporcie elektronów usuniętych z substratu pod wpływem oksydoreduktaz

      • Niektóre ulegają podczas reakcji przekształceniu do formy przekazywanej w dalszym etapie szlaku metabolicznego do cząstki innego biokatalizatora gdzie są regenerowane

      • Trwale związane z cząsteczką białka (apoenzymy) są nazywane grupami prostetycznymi

   4. Centrum aktywne (kieszeń katalityczna)

      • Od jego struktury i budowy zależy zdolność katalityczna enzymu i jego specyficzność działania

      • Zazwyczaj we wgłębieniu cząsteczki białka

      • Zawiera jedno lub kilka miejsc wiążących substrat we właściwym dla przebiegu katalizowanej reakcji usytuowaniu przestrzennym oraz miejsce katalitycznie czynne

      • Zbudowany z reszt aminokwasów, niekiedy koenzymów lub jonów metali

      • Przyłączenie substratu zmienia strukturę kieszeni katalitycznej ułatwiają oddziaływanie na przekształcany fragment cząstki

      • Skutkiem są zmiany konfiguracji

   5. Miejsca regulatorowe (allosteryczne)

      • Charakteryzują się powinowactwem do końcowego produktu

      • Skutkiem jego przyłączenia do miejsca regulatorowego jest zmiana struktury bialka powodująca ograniczenie aktywności enzymu z małocząsteczkowymi białkami

3. Jednostki aktywności enzymów- od czego zależy aktywność enzymów

   1. pH

      • optymalne pH działania enzymu zależy od rodzaju stosowanego buforu oraz od kierunku przebiegu reakcji

      • ograniczony zakres

      • Każdy enzym charakteryzuje się optymalnym pH, przy którym wykazuje największą aktywność.

      • Silnie kwaśne czy zasadowe środowisko (skrajne wartości pH) z reguły działają denaturująco na enzymy, które są białkami, niszcząc nieodwracalnie ich aktywność.

      • Niewielkie odchylenie od wartości optymalnej nie powoduje denaturacji, ale obniża szybkość katalizowanej reakcji.

      • Wpływ pH wiąże się ze zmiana stopnia dysocjacji samego enzymu (dysocjacja grup -NH2 i -COOH obecnych w łańcuchu polipeptydowym i głównie w centrum aktywnym) – co wpływa negatywnie na powstanie kompleksu enzym – substrat.

      • Optimum pH dla większości enzymów występuje przy wartościach bliskich odczynu obojętnego lub słabo kwaśnego.

      • Są jednak enzymy, które przejawiają aktywność jedynie w środowisku kwaśnym (pepsyna pH 1,5-2,2) lub środowisku zasadowym (trypsyna pH 8-9).

   2. temperatura

      • Wraz ze wzrostem temperatury zwiększa się szybkość reakcji enzymatycznej.

      • Po osiągnięciu optimum dalszy wzrost powoduje spadek szybkości reakcji.

      • Wysoka temperatura niszczy nieodwracalnie enzym, ponieważ jest on substancją białkową i wzrost powyżej optymalnej dla jego działania temperatury powoduje stopniową denaturację i zanik własności katalitycznych.

      • Temperatura optymalna dla działania enzymów jest zależna od ich pochodzenia: dla enzymów zwierzęcych jest zbliżona do temperatury ciała (36-40°), dla enzymów roślinnych jej zakres wynosi 20-30°C.

      • Przy niskich temperaturach aktywność enzymów ulega zahamowaniu, lecz proces ten jest odwracalny.

   3. stężenie enzymu i substratu

      • Większość enzymów wymaga do uzyskania pełnej aktywności różnych czynników chemicznych przyspieszających, a nawet umożliwiających ich działanie.

      • Czynniki te nazywamy aktywatorami.

      • Działanie aktywatorów polega na ułatwieniu powstawania układu enzym – substrat.

      • Aktywatorami enzymów mogą być jony metali lub aniony współdziałające z białkiem enzymu, związki regulujące potencjał redox środowiska, od których zależy budowa centrów aktywnych, bądź też związków odszczepiających pewne grupy chemiczne, blokujące centra aktywne enzymu, np. a-amylaza wymaga jonów Cl-, natomiast oksydaza polifenolowa jest aktywowana przez Cu2+, liczne peptydazy przez jony Mn2+, Co2+, Zn2+.

      • Czynniki hamujące działanie enzymów noszą nazwę inhibitorów.

      • Mechanizm działania inhibitorów jest różny, najczęściej polega na łączeniu się ich z centrum aktywnym enzymu lub z koenzymem czy grupą prostetyczną powodując ich unieczynnienie.

   4. obecność aktywatorów i inhibitorów

      • W miarę wzrostu stężenia substratu szybkość reakcji rośnie, osiągając maksymalną wydajność wtedy gdy wszystkie cząsteczki enzymu są połączone z substratem.

      • Tak więc w miarę zwiększania się stężenia substratu wysycenie centrów aktywnych enzymu stopniowo wzrasta i przy pełnym wysyceniu szybkość osiąga swe maksimum.

      • Dalsze zwiększanie ilości substratu nie powoduje zwiększenia szybkości reakcji, może nawet ją zmniejszyć nieznacznie.

4. Inhibitory i ich działanie

   1. Powodują utratę aktywności katalitycznej

   2. Działanie inhibitorów jest skutkiem specyficznego, odwracalnego lub nie przyłączenia się ich cząsteczek do centrum aktywnego lub innego fragmentu łańcucha polipeptydowego biokatalizatora

   3. Inhibitory o działaniu nieodwracalnym wiążą się z enzymem kowalencyjnie, co praktycznie uniemożliwia ich usunięcie

   4. Inhibicja odwracalną powodują substancje, które można łatwo oddzielić od cząsteczek enzymu

   5. Podział:

      1. Kompetycyjne

         • Podobne strukturalnie do substratu i konkurują ze jego cząsteczkami o centrum aktywne enzymu

         • Nie powodują trwałej inaktywacji preparatu

         • Mogą być łatwo usunięte np. przy dużym stężeniu substratu

      2. Niekompetycyjne

         • Łączą się z odległymi od centrum aktywnego obszarami cząsteczek białka

         • Zmieniają strukturę centrum aktywnego w stopniu uniemożliwiającym katalizowanie reakcji

   6. Niektóre inhibitory stosuje się jako leki, a niektóre blokują ważne fizjologicznie enymy i są silnymi truciznami

5. Regulacja reakcji enzymatycznych

   1. Sama produkcja enzymu na etapach translacji , jak i wcześniejszej transkrypcji , podlega ścisłej kontroli i może być zwiększana (uruchamiana) lub zmniejszana (zatrzymana) przez komórkę w odpowiedzi na zmiany w środowisku zewnętrznym komórki, tak samo jak kontrolowana jest w ten sposób produkcja każdego innego białka.

   2. Sortowanie i rozdzielanie enzymów do docelowych kompartmentów (także poza komórkę) i utrzymywanie ich tam, jest sposobem na kontrolę ich aktywności w przestrzeni. Enzymy działają wtedy na szlakach metabolicznych umiejscowionych w różnych przedziałach komórkowych, nie interferują z innymi szlakami, a ich aktywność może być także szybko zmieniona poprzez globalną zmianę charakterystyki środowiska kompartmentu w którym się znajdują (np. obniżenie pH w lizosomie ). Różne kompleksy enzymatyczne zawarte w różnych przedziałach komórkowych, a co za tym idzie podział syntezy na etapy, jak również oddzielenie syntezy od rozkładu, umożliwia dokładną kontrolę szlaku metabolicznego na każdym etapie przez różne czynniki^[77].

   3. Aktywność enzymów może być regulowana przez specjalne cząsteczki – inhibitory (patrz: Inhibicja) i aktywatory . Jest to najbardziej bezpośredni sposób modulacji ich aktywności.

   4. Enzymy mogą być regulowane poprzez ich modyfikacje potranslacyjne . Modyfikacje takie mogą obejmować kowalencyjne zmiany struktury cząsteczki, np. dodawanie dodatkowych grup funkcyjnych : fosforylacja , mirystylacjaczy glikozylacja . Przykładowo związanie insuliny z odpowiednim receptorem uwalnia kaskadę fosforylacji wielu enzymów i w rezultacie syntezę glikogenu ^[78]. Innym przykładem potranslacyjnych modyfikacji enzymów jest modyfikacja łańcucha polipeptydowego enzymu poprzez jego skracanie, przycinanie. Przykładowo chymotrypsyna , proteolityczny enzym trawienny, jest produkowany wtrzustce i wydzielany do światła dwunastnicy w formie nieaktywnej, jako chymotrypsynogen. Tam następuje jego aktywacja poprzez skrócenie łańcucha polipeptydowego i uwolnienie aktywnej cząsteczki dojrzałego enzymu. Produkcja enzymu w formie proenzymu zabezpiecza trzustkę i inne tkanki, zanim dotrze do jelita, przed strawieniem^[79]. Nieaktywny prekursor enzymu nazywany jest proenzymem (dawniej zymogenem). Gdy aktywacja enzymu jest wieloetapowa, mówi się wtedy o preproenzymach^[80]. Przycinanie proenzymu do formy aktywnej zachodzi z udziałem innych enzymów lub czasami sam enzym jest w stanie katalizować reakcję aktywacji swoich form proenzymatycznych^[81].

   5. Niektóre enzymy mogą stać się aktywne (nieaktywne), gdy znajdą się w innym środowisku, np. po przeniesieniu ze środowiska cytoplazmy o właściwościach redukujących do środowiska przestrzeni peryplazmatycznej o właściwościach utleniających, z wysokiego pH do niskiego pH, itp. Przykładem może być hemaglutynina – glikoproteina o właściwościach antygenowych – na powierzchni wirusów grypy , która zmienia konformację, gdy znajdzie się w kwaśnym środowisku pęcherzyka komórkowego gospodarza, powodując aktywację wirusa^[82].

6. Metoda Lowry’ego

   1. Oznaczenie czystości preparatu enzymatycznego

      1. Odczynnik A: 2% roztwór Na2CO3 w 0,1 M

      2. Odczynnik B₁: 1% CuSO4

      3. Odczynnik B₂: 2% roztwór winianu sodowo-potasowego

      4. Odczynnik C: zmieszać 0,5 ml odczynnika B_1, 0,5ml odczynnika B₂ oraz 50ml odczynnika A

         • Odczynnik C przygotować 30 min przed oznaczeniem

      5. Odczynnik D: odczynnik Folina- Cicalteu’a (1:1,5)

      6. Roztwór pepsyny2= roztwór pepsyny 1 rozcieńczony 100x

   2. Wykonanie

      1. Oznaczanie zawartości pepsyny

         • Do 1 ml badanej próby (pepsyny 2) dodać 5 ml odczynnika C

         • Wykonać 3 powtórzenia

         • Wymieszać

         • Zawartość probówek pozostawić w T pokojowej na 10 min

         • Dodać 0,5ml odczynnika

         • Po 30 min zmierzyć absorbancję przy długości fali 660 nm wobec próby odniesienia (zamiast pepsyny 1 ml wody

      2. Przygotowanie krzywej wzorcowej albuminy

         • Do probówek dodać kolejno 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 i 1ml wzorcowego roztworu albuminy

         • Uzupełnić wodą do 1 ml

         • Przygotować próbę ślepą- zamiast białka 1 ml wody destylowanej

         • Do wszystkich dodać 5 ml odczynnika C

         • Wymieszać

         • Probówki zostawić w T pokojowej na 10 min

         • Dodać 0,5ml odczynnika D

         • Po 30 min zmierzyć absorbancję przy długości fali 660 nm wobec próby ślepej

      3. Obliczenia

         • Z krzywej wzorcowej odczytać zawartość białka w rozcieńczonych próbach

         • Obliczyć ilość białka w całej masie nierozcieńczonego roztworu pepsyny

         • Określić czystoś preparatu wg wzoru (próba/75)*100%

7. Metoda Ansona

   1. Oznaczanie aktywności pepsyny wobec hemoglobiny

      1. Hydroliza

         • Do 4 probówek szklanych w 3 powtórzeniach dodać kolejno 0,2; 0,3; 0,4; 0,5ml roztworu pepsyny

         • Dodać po 1 ml 5% roztworu hemoglobiny

         • Dopełnić do 5ml buforem o pH 2,2

         • Inkubować przez 30 min w T 37*C

         • Równolegle inkubować 3 próby kontrolne zawierające: roztwór pepsyny 0,5ml i dopełniony do 4 ml buforem o pH 2,2

         • Po inkubacji wszystkich prób dodać po 5ml 20% roztworu TCA

         • Do prób kontrolnych dodać jeszcze 1ml roztworu hemoglobiny

         • Próby trzymać w T pokojowej przez 5 min mieszając

         • Przesączyć przez bibułę do kolbek stożkowych

      2. Oznaczenie produktów hydrolizy (tyrozyny i tryptofanu)

         • Do 0,5ml klarowanego przesączu dodać 2ml wody destylowanej

         • Dodać 5 ml 0,5 M NaOH

         • Dodać 0,5ml rozcieńczonego (1:1,5) odczynnika Folina-Cicalteu

         • Natychmiast wymieszać

         • Po 10 min odczytać absorbancję przy dł fali 720nm wobec 1 próby odniesienia (ślepej)

         • Próba ślepa zamiast ekstraktu 0,5ml 10% TCA

         • Pomiar 3 prób kontrolnych i 12 badanych

      3. Przygotowanie krzywej wzorcowej tyrozyny

         • Do probówek dodać kolejno 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 ml wzorcowego roztworu tyrozyny

         • Uzupełnić partię do 0,5ml objętości 0,2 N roztworem HCl

         • Próbę ślepą przygotować dodając 0,5 ml 0,2N roztworu HCl

         • Do prób kontrolnych i właściwych dodać 2 ml wody destylowanej

         • Dodać 5 ml 0,5 M roztworu NaOH

         • Dodać 5 ml rozcieńczonego (1:1,5) odczynnika Folina-Ciocalteu

         • Wymieszać

         • Po 10 minutach odczytać absorbancję przy długości fali 720 nm wobez próby ślepej

         • Wykreślić krzywą kalibracyjną w uk absorbancję od ilości tyrozyny

      4. Obliczenia

         • Z krzywej wzorcowej tyrozyny należy wyznaczyć równanie krzywej kalibracji

         • Do absorbancję prób badanych odjąc absorbancję próby kontrolnej i z krzywej wzorcowej odczytać zawartość tyrozyny

         • Przy obliczaniu tyrozyny należy uwzględnić rozcieńczenie i zrobić x 10 bo 10 krotnie

         • Aktywność proteolityczną wyrazić w mikromolach tyrozyny/mg białka x 30 min