Ogólna charakterystyka przemian jakie zachodzą w tkankach roślinnych po zranieniu:

• Rola amoniakoliazy fenyloalaniny (reakcja na wzorach).

Amoniakoliaza fenyloalaniny przyczynia sie pośrednio do ciemnienia enzymatycznego. Enzym ten katalizuje kluczową reakcję szlaku fenylopropanoidowego: dezaminację fenyloalaniny do kwasu trans cynamonowego. Produktami szlaku fenylopropanoidowego są kwasy fenylopropenowe - m.in. substraty oksydazy polifenolowej.

Reakcja powstawania kwas cynamonowego z fenyloalaniny:

Amoniakoliaza fenyloalaniny zlokalizowana jest w cytozolu i posiada budowę tetrameryczną.

• Rola oksydazy polifenolowej.

Przyczyną ciemnienia enzymatycznego są reakcje katalizowane przez enzym oksydazę o-difenolową (polifenolooksydaza, oksydaza katecholowa, katecholaza).

W wyniku zniszczenia kompartymentacji komórek, dochodzi do zetknięcia enzymu

z substratami, którymi są związki fenolowe. W komórkach nieuszkodzonych enzym występuje w formie nieczynnej. W momencie zadziałania stresu mechanicznego zranienia dochodzi do aktywacji enzymu (mechanizmy aktywacji nie do końca zostały rozpoznane, sugeruje się ograniczoną proteolizę i zmiany konformacyjne białka enzymatycznego, stwierdzono wzrost rozpuszczalności enzymu po aktywacji). Ponadto po zniszczeniu błon biologicznych enzym styka się ze swoimi substratami, które zwykle w nienaruszonych komórkach zlokalizowane są w wakuoli.

• Charakterystyka oksydazy polifenolowej.

- budowa enzymu: Oksydaza polifenolowa jest miedzioproteiną. W centrum aktywnym posiada dwa atomy miedzi, połączone, każdy z osobna, z trzema resztami histydyny białka enzymatycznego wiązaniem koordynacyjnym. Enzym może występować w trzech formach redoks. W formie utlenionej met, w której jony Cu2+ połączone są za pomocą cząsteczki wody; w formie zredukowanej deoksy, w której jednego jonu Cu+ dołączona jest koordynacyjnie cząsteczka wody, drugi jon Cu+ ma wolne miejsce koordynacyjne; w formie utlenowanej oksy Cu2+-O2-Cu2+.

- lokalizacja w komórkach roślinnych: w chloroplastach, mitochondriach i peroksysomach w postaci związanej z błonami, enzym także obecny w cytozolu w formie rozpuszczalnej.

-reakcje katalizowane : Wyróżnia się 2 aktywności enzymu- polifenolooksydazy:

1. Aktywność katecholazowa (nazwa enzymu katecholaza, oksydaza o-difenolowa). Katalizuje reakcje utlenienia o- difenoli z udziałem tlenu cząsteczkowego do o-chinonów, produktem reakcji jest też woda.

Substraty tej reakcji: wszystkie związki fenolowe, w których grupy -OH znajdują się w położeniu orto np. katechol. W owocach i warzywach bardzo powszechnym substratem jest kwas chlorogenowy (kwas 5' kawowochinowy).

1. Aktywność krezolazowa ( enzym często tyrozynaza, ze względu na to, że substratem jest tyrozyna). Polega na wstawieniu tlenu do pierścienia aromatycznego w pozycji orto do istniejącej grupy -OH, czyli przekształcenie monofenoli w o-difenole. Powstałe o-fenole ulegają następnie zwykle utlenieniu do chinonów.

Schemat przedstawia reakcje katalizowane przez tyrozynazę. Forma deoksy (Ed) przechodzi w formę oksy (Eox) po przyłączeniu cząsteczki tlenu.

Enzym w formie oksy ( Eox) może reagować z :

- o-difenolami (D)

- monofenolami (M).

W wyniku reakcji z monofenolami powstają o-difenole, które mogą być uwalniane do środowiska, w wyniku czego powstaje forma met enzymu (Em). O-difenole mogą być utlenione do chinonów, generując formę deoksy enzymu (Ed).

Gdy forma oksy (Eox) przereaguje z o-difenolem powstanie chinon i forma met enzymu (Em). Forma met jest zdolna do utleniania o-difenolu do chinonu. Forma met może też związać monofenol (M) tworząc kompleks końcowy EmM, który nie ulega dalszym przemianom.

-optiumum pH mieści się w granicach 4-7

• Sposoby zapobiegania reakcji ciemnienia enzymatycznego.

Ciemnienie enzymatyczne pojawia się w obecności trzech składników:

1. tlenu

2. aktywnego enzymu

3. jego substratów

Pozbycie się jednego ze składników zapobiegnie zajściu reakcji. Zastosowanie związków redukujących, zdolnych do redukcji chinonów do wyjściowych fenoli też może być skutecznym sposobem zapobiegania reakcji ciemnienia enzymatycznego.

Sposoby zapobiegania:

1. cieplna denaturacja PPO (oksydaza polifenolowa)

2. chemiczna inhibicja PPO. Bardzo efektywnymi inhibitorami są siarczyny, ale ich stosowanie jest ograniczane, ze względu na to, że mogą być przyczyną powstawania obcego smaku i zapachu po ogrzaniu, przyczyniają się do strat witaminy B1 a także reakcji alergicznych osób cierpiących na astmę. Siarczyny mogą bezpośrednio inaktywować enzym, mogą też tworzyć produkty (monosulfoniany) z fenolami, których oksydaza polifenolowa nie jest zdolna utleniać. Ponadto siarczyny reagują z chinonami tworząc bezbarwne produkty i zapobiegając dalszym nieenzymatycznym przemianom chinonów w barwniki melaninowe. Środki zakwaszające, np. kwas cytrynowy, hamują aktywność enzymu poprzez obniżanie pH do wartości poniżej optimum (optymalne wartości pH dla większości oksydaz o-difenolowych mieszczą się w granicach 4-7). Ponadto obniżenie pH do wartości niższej od 5 hamuje też istotnie reakcje, w wyniku której powstają barwniki melaninowe na drodze nieenzymatycznej (czyli etapy ciemnienia następujące po wytworzeniu chinonów). Związki chelatujące (np. EDTA albo wspomniany kwas cytrynowy) wpływają hamująco na aktywność polifenolooksydazy poprzez wiązanie jonów miedzi znajdujących się w centrum aktywnym.

3. związki redukujące o-chinony do związków fenolowych hamują ciemnienie enzymatyczne. Kwas askorbinowy i D-izoaskorbinowy są używane w celu zapobiegania ciemnieniu enzymatycznemu od wielu lat. Uważa się również, że kwas askorbinowy może bezpośrednio wpływać na aktywność PPO, poprzez redukowanie jonów miedzi w centrum aktywnym enzymu.

4. wykluczenie tlenu. Najprostszym sposobem wykluczenia obecności tlenu jest zanurzenie w wodzie pokrojonych owoców czy warzyw (tak np. postępuje się z obranymi ziemniakami przed gotowaniem albo smażeniem). Można pakować owoce lub warzywa minimalnie przetworzone próżniowo. Można powlekać je jadalnymi powłokami nieprzepuszczalnymi dla tlenu albo zanurzać w roztworze kwasu askorbinowego, który jak wiadomo, utleniając się efektywnie usuwa tlen ze środowiska.