Budowa RNA

Cząsteczki RNA są polimerami zbudowanymi z liniowych, nierozgałęzionych łańcuchów podjednostek, zwanych nukleotydami. Nukleotyd budują trzy części: cukier, grupa fosforanowa i zasada azotowa. W RNA cukrem jest ryboza, zasadami zaś są: adenina, cytozyna, guanina i uracyl. Cztery nukleotydy biorące udział w syntezie RNA to: adenozyno-5’-trifosforan (ATP), cytydyno-5’-trifosforan (CTP), guanozyno-5’-trifosforan (GTP) i urydyno-5’-trifosforan (UTP). Polinukleotyd RNA zawiera wiązanie 3’-5’-fosfodiestrowe, które jest mniej stabilne niż w DNA, dlatego polimery RNA rzadko składają się z więcej niż kilku tysięcy nukleotydów. W RNA mogą powstawać pary zasad: A łączy się z U podwójnym wiązaniem wodorowym, a G z C potrójnym wiązaniem wodorowym. Cząsteczki RNA występują w formie jednoniciowej i dwuniciowej. Cząsteczki dwuniciowego RNA (dsRNA) nie mogą tworzyć tak regularnej struktury jak w przypadku B-DNA, ze względu na występowanie grupy hydroksylowej przy 2 atomie węgla rybozy. Zazwyczaj jednak RNA występuje w postaci jednoniciowego (ssRNA), silnie pofałdowanego polinukleotydu zawierającego odcinki dwuniciowe i tworzącego skomplikowane struktury przestrzenne. Fragmenty dwuniciowe przybierają przeważnie strukturę helisy, której długość nie przekracza zazwyczaj kilkudziesięciu par zasad. W przeciwieństwie do DNA stosunek zasad azotowych purynowych do pirymidynowych w cząsteczce jednoniciowego RNA nie jest zachowany.

mRNA

mRNA jest pojedynczą cząsteczką RNA (ssRNA), która jest nośnikiem informacji genetycznej, zawartej w postaci sekwencji zasad azotowych w cząsteczce. Na jej podstawie polimeryzowane są aminokwasy według określonej kolejności – dzięki temu procesowi powstaje produkt końcowy ekspresji informacji genetycznej – białko. W nukleotydach mRNA zapisana jest kodem genetycznym sekwencja aminokwasów polipeptydów. Jeden kodon składa się z 3-ch nukleotydów. 64 kodony tworzące kod genetyczny można podzielić na grupy. Kodony wchodzące w skład jednej grupy kodują jeden aminokwas. Kod genetyczny ma 4 kodony przestankowe: kodon inicjacyjny (AUG) oraz kodony terminacyjne (UAG, UAA, UGA). Procesy syntezy i dojrzewania mRNA u organizmów prokariotycznych i eukariotycznych znacznie różnią się od siebie.

Podstawową różnicą pomiędzy mRNA bakteryjnym a eukariotycznym, jest to, że mRNA bakterii w zasadzie nie podlega dojrzewaniu – nie zawiera intronów. Pierwotny transkrypt syntetyzowany przez polimerazę RNA jest od razu dojrzałym mRNA i jeszcze przed zakończeniem transkrypcji rozpoczyna się translacja. mRNA jest syntetyzowany na matrycy DNA. Rybonukleotydy są dodawane do końca 3’ transkryptu RNA na zasadzie komplementarnego łączenia zasad. W czasie procesu elongacji łańcucha mRNA tworzy się pęcherzyk transkrypcyjny, wewnątrz którego znajduje się hybryda DNA-RNA. Pęcherzyk przesuwa się po matrycy i uwalniany jest transkrypt. Zakończenie transkrypcji może przebiegać z udziałem samodzielnych terminatorów lub białka Rho. mRNA bakteryjny jest policistronowy, co oznacza że zawiera informacje dotyczące budowy wielu różnych białek.

W odróżnieniu od organizmów prokariotycznych wszystkie eukariotyczne mRNA mają czapeczkę przyłączoną na końcu 5’, większość z nich jest poliadenylowana przez dodanie serii adenozyn do końca 3’, wiele transkryptów zawiera introny i podlega procesowi składania, a niektóre są poddawane redagowaniu. Tworzenie się czapeczki to wieloetapowy proces, który rozpoczyna się w niedługim czasie po zajściu efektywnej inicjacji i oddaleniu się polimerazy od promotora. Pierwszym etapem tego procesu jest dodanie guanozyny do końca 5’ RNA. W drugim etapie następuje przekształcenie końcowej guanozyny w 7-metyloguanozynę. Czapeczka może być istotna dla eksportu mRNA z jądra, ale jej podstawową rolą jest udział w procesie inicjacji translacji. Proces elongacji łańcucha u eukariotów jest znacznie dłuższy, co jest spowodowane obecnością intronów oraz występowaniem nukleosomów. Praktycznie wszystkie eukariotyczne mRNA mają serię do 250 adenozyn na końcach 3’. Nukleotydy te nie są zakodowane w DNA, ale dodawane do transkryptu przez polimerazę RNA niezależną od matrycy zwaną polimerazą poli(A). Najczęściej poliadenylacja stanowi nieodłączną część procesu terminacji transkrypcji. Rola „ogona” poli(A) nie jest do końca znana. Zakłada się, że może mieć on wpływ na stabilność RNA oraz pełnić funkcje w inicjacji translacji. Powstały pre-mRNA u eukariotów podlega procesowi dojrzewania, który polega wycinaniu intronów. Eukariotyczny pre-mRNA może zawierać ponad 100 intronów, stanowiących znaczną część transkryptu. Muszą one zostać wycięte, a eksony połączone w odpowiedni sposób, aby transkrypt mógł funkcjonować jako dojrzały mRNA. Dwa podstawowe typy intronów to: GU-AG i AU-AC, które znajdują się w genach eukariotycznych kodujących białka. Szlak wycinania intronów można podzielić na dwa etapy:

1. Cięcie po stronie 5’ intronu

2. Cięcie po stronie 3’ intronu i połączenie eksonów.

Centralnymi składnikami aparatu do wycinania intronów typu GU-AG są snRNA zwane U1, U2, U4, U5 i U6. Są to krótkie cząsteczki u kręgowców mające długość od 106 do 185 nukleotydów. Wiążą silone z czynnikami białkowymi, tworząc małe jądrowe rybonukleoproteiny (snRNP), które łącznie z innymi czynnikami białkowymi tworzą serie kompleksów, które przeprowadzają dwa etapy reakcji składania, której dokładny mechanizm nie jest do końca znany.

Wycinanie intronów AU-AC przebiega identycznie jak GU-AG, ale bierze w nim udział odmienny zestaw czynników związanych z wycinaniem. Introny AU-AC zostały wykorzystane do badania modeli oddziaływań zachodzących w czasie wycinania intronów GU-AG. Badania te pomogły zdefiniować strukturę powstającą w wyniku łączenia się w pary komplementarnych zasad, wytworzoną pomiędzy U2 i U6 snRNA w kompleksie wycinającym introny GU-AG (Tarn i Steitz, 1996).

Redagowanie mRNA przebiegające na drodze modyfikacji chemicznych stwarza możliwość zmiany właściwości kodujących transkryptu, prowadząc do odpowiedniej zmiany sekwencji aminokwasowej zakodowanego białka.

Populacja cząsteczek mRNA obecnych w komórce w danym momencie jest wynikiem stanu równowagi między syntezą nowych mRNA w procesie transkrypcji i usuwaniem już istniejących mRNA w procesach degradacji. Bakteryjne mRNA są na ogół degradowane bardzo szybko z udziałem kompleksu multienzymatycznego zwanego degradosomem. Zawiera on endo- i egzonukleazy. Eukariotyczne mRNA są cząsteczkami żyjącymi dłużej od prokariotycznych. Szlaki degradacji u wyższych eukariotów są słabo poznane. Prawdopodobnie wstępem do degradacji mRNA jest utrata łańcucha poli(A) i usunięcie czapeczki.

rRNA

Stanowi około 80% ilości kwasów rybonukleinowych komórki.

Synteza rRNA przebiega podobnie do mRNA. Różnice występuję w obróbce pre-rRNA.

Bakterie syntetyzują trzy rodzaje rRNA, zwane: 5S rRNA, 16S rRNA i 23S rRNA, przy czym nazwy wskazują na wielkość cząstek mierzoną poprzez analizę sedymentacji. Trzy geny tych rRNA są połączone w jednostkę transkrypcyjną, która zwykle występuje w wielu kopiach. Aby uwolnić dojrzałe rRNA, prekursorowa cząsteczka RNA musi zostać pocięta. Cięcie przeprowadzają różne rybonukleazy w miejscach wyznaczonych przez regiony dwuniciowe powstałe przez łączenie komplementarnych zasad z różnych części pre-rRNA. Końce powstałe po cięciu są przycinane przez egzonukleazy.

U eukariotów istnieje cztery rodzaje rRNA. Jeden z nich, 5S rRNA nie podlega dojrzewaniu, a pozostałe trzy rRNA (5,8S; 18S i 28S) powstają z jednej jednostki transkrypcyjnej jako pre-rRNA, który podlega dojrzewaniu poprzez cięcie i przycinanie końców.

rRNA jest podstawowym składnikiem rybosomów, gdzie sięga 65% zawartości. Resztę stanowią białka. Każdy rybosom można podzielić na 2 składniki:

1. Duża podjednostka (u eukariotów zawiera 3 cząsteczki rRNA – 28S; 5,8S i 5S, u prokariotów występują 2 cząsteczki rRNA – 23S i 5S).

2. Mała podjednostka (u obydwu grup zawiera 1 cząsteczkę rRNA: u eukariotów – 18S rRNA, a u prokariotów 16S rRNA).

Rybosomalny RNA zawiera typowe zasady azotowe z niewielką domieszką ich metylowych pochodnych. Jego masa cząsteczkowa osiąga 2 MDa. Jest pojedynczym łańcuchem, bardzo mocno poskręcanym, tworzącym pętle, z fragmentami dwuniciowymi, gdzie występują wiązania wodorowe między komplementarnymi zasadami.

Początkowo przypuszczano, że RNA pełni w rybosomie tylko rolę strukturalną, a jego struktura drugorzędowa jest szkieletem, do którego przyłączają się białka. W późnych latach 80-tych, gdy okazało się, że nie można zidentyfikować białek odpowiedzialnych za główną katalityczną aktywność rybosomu – tworzenie wiązania peptydowego, biolodzy molekularni wzięli pod uwagę możliwość, że w procesie syntezy białka cząsteczki rRNA mogą pełnić rolę enzymatyczną. Pierwsze dowody doświadczalne potwierdzające, że aktywność peptydylotransferazy w rybosomie może być zlokalizowana w rybozymie, pochodzą z badań nad 23S rRNA Escherichia coli. Wykazano, że preparaty tego rRNA mogą katalizować tworzenie wiązania peptydowego między dwoma aminokwasami połączonymi z dwoma cząsteczkami tRNAPhe. Do jednego tRNA przyłączona była normalna fenyloalanina, a do drugiego N-acetylofenyloalanina. W obecności 23S rRNA syntetyzowany był dipeptyd N-acetylofenyloalanina-fenyloalanina. Cząsteczki 23S rRNA używane w tym doświadczeniu były oczyszczane z rybosomów E.coli, a więc mogły zawierać niewielkie ilości białka, które mogłyby wykazywać aktywność katalityczną przypisywaną rRNA. Z tego powodu przeprowadzono drugą turę eksperymentów z użyciem rRNA syntetyzowanego w probówce. Taki RNA nigdy wcześniej nie spotkał się z żadnymi białkami, więc jego aktywności nie można było przypisać zanieczyszczeniom. W teście na tworzenie wiązania peptydowego wykazano, że syntetyczny rRNA ma aktywność peptydylotransferazy, co było ostatecznym dowodem potwierdzającym, że 23S rRNA jest rybozymem, czyli enzymem RNA.

W eukariotycznym pre-rRNA znane jest kilka przypadków obecności intronów, należą one do rodziny intronów grupy I. Szlak wycinania intronów tej grupy przebiega bez obecności białek, jest autokatalityczny: sam RNA ma aktywność enzymatyczną. Jest to przykład rybozymu. Aktywność samowycinania intronów grupy I tkwi w strukturze tworzącej się przez łączenie komplementarnych zasad w RNA. Rybozy składa się z rdzenia katalitycznego złożonego z 2-ch domen. Każda z nich zawiera dwa regiony dwuniciowe, a miejsca wycinania intronów zbliżają się do siebie poprzez oddziaływania między dwiema częściami struktury II-rzędowej. Możliwe, że w przypadku niektórych intronów stabilność rybozymu zwiększa się poprzez dołączenie niekatalitycznych czynników białkowych.

Rybosomowe RNA są modyfikowane w dwojaki sposób: poprzez dodawanie grup metylowych, głównie do grupy 2’-OH cukru w nukleotydzie, oraz przekształcenie urydyny do pseudourydyny. Takie same modyfikacje zachodzą w tych samych pozycjach we wszystkich kopiach rRNA, a pozycje te odpowiadają sobie w pewnej mierze u różnych gatunków. Funkcje tych modyfikacji nie są znane, chociaż większość z nich zachodzi w obrębie tych części rRNA, które uważa się za najbardziej istotne dla aktywności cząsteczek rRNA w rybosomach. Przypuszcza się, że zmodyfikowane nukleotydy mogą uczestniczyć w reakcjach katalizowanych przez rRNA, takich jak synteza wiązań peptydowych. Wykazano, że u eukariotów w procesie modyfikacji biorą udział krótkie RNA, nazwane snoRNA. Cząsteczki te mają długość 70 do 100 nukleotydów i znajdują się w jąderku, gdzie odbywa się dojrzewanie rRNA. Nukleotydy, które mają zostać zmetylowane, są wyznaczane poprzez tworzenie par z komplementarnymi zasadami w odpowiednich rejonach snoRNA. Tworzenie par nie zachodzi na całej długości snoRNA, a dotyczy jedynie kilku nukleotydów, które znajdują się zawsze bezpośrednio przed konserwatywną sekwencją, zwaną blokiem D. Pary zasad obejmujące nukleotyd, który ma być zmodyfikowany, są położone 5 pozycji przed blokiem D. Hipoteza zakłada, że blok D jest sygnałem rozpoznawczym dla enzymu metylującego, który jest w ten sposób kierowany do odpowiedniego nukleotydu (Bachellerie i Cavaillé, 1997). Odmienna rodzina snoRNA odgrywa analogiczną rolę naprowadzającą w przekształceniach urydyn w pseudourydyny (Maden, 1997). snoRNA tego typu nie mają bloków D, ale zawierają inne konserwatywne motywy, które mogą być rozpoznawane przez enzymy modyfikujące. Każdy z tych motywów ma zdolność do specyficznych oddziaływań na zasadzie komplementarności z miejscem docelowym, wyznaczając nukleotyd, który ma być zmodyfikowany. Dla każdej zmodyfikowanej pozycji nukleotydowej w pre-rRNA istnieją odmienne snoRNA, z wyjątkiem kilku miejsc, które znajdują się dostatecznie blisko siebie, aby oddziaływać z pojedynczym snoRNA. Oznacza to, że w jednej komórce musi występować kilkaset różnych snoRNA. Jedynie część snoRNA powstaje w wyniku transkrypcji standardowych genów snoRNA, większość natomiast jest kodowana przez sekwencje znajdujące się w obrębie intronów licznych genów i zostaje uwolniona poprzez cięcie intronów po zakończeniu procesu ich wycinania. System snoRNA ma zastosowanie jedynie w odniesieniu do rRNA eukariotycznego. Modyfikacji bakteryjnego rRNA dokonują enzymy, które bezpośrednio rozpoznają sekwencję i/lub strukturę regionów RNA zawierających nukleotydy, które mają podlegać modyfikacjom. Prawdopodobnie z tego prostego systemu modyfikacji powstał na drodze ewolucji bardziej skomplikowany proces kierowany przez snoRNA (Lafontaine i Tollervey, 1998).

tRNA

tRNA stanowi 10-12% ogólnej ilości kwasów rybonukleinowych w komórce. Jest on zbudowany z 70-90 nukleotydów. Charakteryzuje się wśród innych rodzajów RNA najmniejszą masą cząsteczkową, zawartą w granicach od 25 do 30 kDa. Bakterie zawierają 35-40, a eukarioty do 50 rodzajów cząsteczek tRNA. We wszystkich organizmach występuje przynajmniej kilka izoakceptorowych tRNA – są to różniące się od siebie cząsteczki tRNA, które są specyficzne w stosunku do tego samego aminokwasu. Transportujące RNA są najkrótszymi znanymi, funkcjonalnymi cząsteczkami RNA. Długość najkrótszych wynosi 74 nukleotydy, a najdłuższych rzadko przekracza 90 nukleotydów. Z powodu swoich małych rozmiarów oraz możliwości oczyszczenia poszczególnych rodzajów tRNA, cząsteczki te były jednymi z pierwszych zsekwencjonowanych kwasów nukleinowych. Sekwencje pierwszych cząsteczek tRNA poznano w 1965 roku dzięki doświadczeniom grupy Roberta Holleya z Cornell University w Nowym Jorku.

Cząsteczki tRNA charakteryzują się specyficznym ułożeniem nukleotydów i określoną strukturą przestrzenną. Pomimo tego, że dana cząsteczka tRNA jest specyficzna wyłącznie dla określonego aminokwasu, struktura wszystkich tRNA jest zbliżona. W strukturze II rzędowej przyjmuje ona postać liścia koniczyny, w III rzędowej wszystkie cząsteczki tRNA przypominają kształtem literę L. Cząsteczki tRNA zawierają wiele nietypowych, modyfikowanych zasad, zazwyczaj 7-15 na molekułę, co stanowi około 10 do 20% wszystkich nukleotydów. Wśród nietypowych zasad charakterystyczne dla wszystkich cząsteczek tRNA są: 5,6-dihydrourydyna oraz pseudourydyna, mogą występować także pochodne metylowane, na przykład 2-metylo-guanozyna, O2,-metylo-cytydyna oraz 1-metylo-adenozyna.

W strukturze II rzędowej tRNA można wyróżnić 5 zasadniczych regionów. Są to:

1. Domena akceptorowa, składająca się z ramienia i pętli akceptorowej, z charakterystyczną sekwencją 5’-CCA-3’, do której przyłączany zostaje aminokwas.

2. Domena antykodonowa (ramię i pętla antykodonowa, zawiera 3 nukleotydy zwane antykodonem, które w czasie translacji łączą się z mRNA.

3. Domena dihydrourydyny (ramię i pętla DHU).

4. Domena TΨC zbudowana z ramienia oraz pętli, w której występuje charakterystyczny układ zasad: rybotymidyna (T), pseudourydyna (Ψ) oraz cytozyna (C).

5. Ramię zmienne znajdujące się pomiędzy domeną antykodonową a domeną TΨC. Ramię to zawiera różną ilość nukleotydów. Podobieństwa między cząsteczkami tRNA dotyczą nie tylko konserwatywnej struktury II-rzędowej. W niektórych pozycjach cząsteczek tRNA zawsze występują te same nukleotydy, a w innych zawsze występuje puryna lub zawsze pirymidyna. Zmodyfikowane nukleotydy prawie zawsze występują w tych samych pozycjach. Wiele konserwatywnych nukleotydów występujących zawsze w danej pozycji pełni ważną rolę w tworzeniu struktury III-rzędowej. W strukturze III-rzędowej tRNA wyróżniamy dwie główne domeny: I – domenę akceptorową (tzw. domena minihelisy, w skład której wchodzi ramię akceptorowe oraz pętla TΨC oraz II – domenę antykodonową, zbudowaną z ramienia i pętli antykodonowej oraz ramienia i pętli DHU. Wiele dowodów wskazuje na to, że te dwie domeny tRNA powstały niezależnie od siebie w procesie ewolucji. Każda z tych domen oddziałuje z innymi częściami rRNA rybosomu.

Zasadniczym etapem w procesie translacji jest selekcja tRNA przez syntetazy aminoacylo-tRNA. Enzymy te determinują poprawność wyboru aminokwasu w biosyntezie białka. Ich podstawową funkcją jest swoiste rozpoznanie, a następnie kataliza dwuetapowej reakcji estryfikacji tRNA. Enzymy te podzielono na dwie klasy, zgodnie z obecnością w nich krótkich charakterystycznych sekwencji aminokwasowych. Małe aminokwasy są z reguły rozpoznawane przez syntetazy klasy II, większe i bardziej hydrofobowe – przez enzymy klasy I. Te dwie klasy różnią się strukturą domeny białkowej. W klasie I miejsce katalityczne enzymu tworzy pięć na przemian ułożonych helis α, tzw. struktura Rossmanna. Centrum aktywne syntetaz klasy II tworzy siedem antyrównolegle ułożonych struktur β-daszkowych oraz trzy helisy α.

tRNA odgrywają zasadniczą rolę w translacji. Tworzą one połączenia między mRNA i syntetyzowanym polipeptydem. Jest to połączenie zarówno fizyczne, jak i informacyjne: tRNA wiąże się jednocześnie z mRNA i wydłużającym się polipeptydem oraz gwarantuje, że sekwencja aminokwasów syntetyzowanego polipeptydu jest zgodna z sekwencją zapisaną kodem genetycznym w nukleotydach mRNA.

mtRNA

W skład tej grupy RNA wchodzą cząsteczki RNA występujące w mitochondriach i stanowiące odpowiednik mRNA, rRNA i tRNA. Do mtRNA należą mt mRNA, kodujący 13 białek, mt rRNA oraz mt tRNA. W cząsteczkach mt tRNA kręgowców czasami brakuje niektórych elementów struktury. Na przykład ludzki mitochondrialny tRNASer nie ma ramienia D.

siRNA

Interferencja RNA (RNAi) jest jednym z mechanizmów regulacji ekspresji genów. Kluczowym składnikiem tego układu regulacyjnego jest dwuniciowy RNA (dsRNA), powodujący degradację homologicznych cząsteczek RNA. Ogół procesów komórkowych, prowadzących ostatecznie do wspomnianej degradacji RNA, określa się jako interferencję RNA. RNAi jest składową ogółu procesów posttranskrypcyjnego wyciszania ekspresji genów, który pierwotnie odkryto u roślin. Wprowadzenie dodatkowych kopii genów syntazy chalkonowej w celu zwiększenia ilości pigmentu w kwiatach petunii wbrew oczekiwaniom spowodowało, iż kwiaty tej rośliny były częściowo lub całkowicie pozbawione zabarwienia. W istocie nie nastąpiła ekspresja dodatkowo wprowadzonego genu, a supresja endogennego genu wytwarzającego pigment. Było to jedno z pierwszych doświadczeń wskazujących na istnienie zjawiska wyciszania ekspresji genów.

Cząsteczki RNA indukujące mechanizmy RNAi charakteryzują się specyficzną strukturą oraz specyficznymi właściwościami chemicznymi. Natywne siRNA, będące produktami nukleolitycznej degradacji długiego dsRNA przez rybonukleazę DICER, mają charakterystyczną budowę. Obie nici RNA o długości 21-23 nukleotydów, tworzą dupleks na odcinku 19 nukleotydów, pozostawiając na każdym końcu 3’ po dwa lub więcej niesparowane nukleotydy. Antysensowna nić siRNA tworzy komplementarny dupleks z docelowym mRNA. Modyfikacje w obrębie tej nici siRNA powodują obniżenie wydajności procesu RNAi lub też całkowity zanik tego zjawiska. siRNA posiadają na końcach 3’ wolną grupę hydroksylową, a na końcach 5’ grupę fosforanową. Wprowadzenie modyfikacji końca 5’ przez przyłączenie grupy 3-aminopropylofosforanowej lub grupy O-metylowej nie ogranicza efektywności procesu RNAi, jeśli modyfikacja dotyczy nici sensownej, natomiast modyfikacja nici antysensownej prowadzi do zaniku procesu RNAi. Wskazuje to, że koniec 5’ nici antysensownej siRNA pełni istotną funkcję w procesie RNAi. Sugeruje się, że miejsce hydrolizy mRNA jest zależne od położenia końca 5’ nici antysensownej siRNA, a 5’-terminalna grupa fosforanowa jest „molekularnym punktem odniesienia”, od którego mierzone jest miejsce hydrolizy mRNA (Tuschl i wsp.). Podstawienie 3’-terminalnej grupy hydroksylowej nici sensownej i antysensownej siRNA resztą fluoresceiny, puromycyny czy biotyną, lub też wprowadzenie 3’-terminalnego 2’,3’-dideoksynukleotydu lub grupy 3-aminopropylofosforanowej nie powoduje zahamowania efektu RNAi. Natomiast modyfikacja nici sensownej za pomocą 2’-O,4-C-etyleno-tymidyny i 2-hydroksy-etylofosforanu tymidyny nie wpływa na jakość RNAi, zaś modyfikacja tymi samymi czynnikami nici antysensownej lub obydwu nici powoduje całkowite zahamowanie RNAi.

Zaproponowano co najmniej dwa mechanizmy, według których może zachodzić proces wyciszania ekspresji genów. W pierwszym z nich inicjacja RNAi następuje przez konwersję dwuniciowego RNA do 21-23-nukleotydowych fragmentów za pomocą wielodomenowej rybonukleazy DICER, wywodzącej się z rodziny RNazy III. Produkty hydrolizy – krótkie dupleksy RNA, zwane siRNA, włączone są w kompleks nukleazowy RISC i kierują go do docelowej sekwencji mRNA. Endorybonukleaza obecna w kompleksie RISC wykorzystuje antysensowną nić siRNA do odnalezienia i degradacji komplementarnej sekwencji mRNA, dlatego też siRNA nazywany jest dupleksem kierującym. Nukleolityczne właściwości kompleksu RISC są istotą procesu RNAi. Przyłączenie siRNA aktywuje RISC, który następnie rozpoznaje i degraduje komplementarny mRNA, blokując w ten sposób ekspresję genu. Drugi mechanizm RNAi, zaproponowany przez Lipardi i wsp., Sijen i wsp., Nishikura i wsp., polega na tzw. „degradacyjnym PCR”. W mechanizmie tym próbuje się wytłumaczyć katalityczny charakter RNAi u nicienia Caenorhabditis elegans. Stwierdzono, że jedynie kilka cząsteczek dsRNA wystarcza do degradacji mRNA. Inaktywacja ekspresji danego genu u tego nicienia utrzymuje się podczas podziałów komórkowych, przenoszona jest do nietransfekowanych komórek i tkanek, jak również pojawia się w następnym pokoleniu. Polimeraza RNA zależna od RNA (RdRP) na matrycy mRNA syntetyzuje nić komplementarną, tworząc nowy dwuniciowy RNA, rozpoznawany i hydrolizowany przez rybonukleazę DICER. W ten sposób tworzona jest nowa generacja siRNA. Starterem w reakcji polimeryzacji jest antysensowna nić siRNA. W reakcji tej szczególne znaczenie ma grupa hydroksylowa obecna na końcu 3’ nici antysensownej siRNA.

Obniżenie poziomu białka wywołane przez egzogenne podanie siRNA jest przejściowe, trwa zwykle 5-7 dni po transfekcji. Podanie plazmidów i wywołanie ekspresji RNA wewnątrz komórki powoduje dłuższy efekt wyciszania. Możliwość stabilnej ekspresji siRNA otwiera drogę do zastosowania zjawiska RNAi w terapii genowej, na przykład w leczeniu infekcji wirusowych. Wysoki koszt syntezy chemicznej RNA bez gwarancji, że wybrane sekwencje wywołają wydajne wyciszenie ekspresji docelowego genu, powoduje, że poszukuje się alternatywnych sposobów uzyskiwania siRNA. Jedną z metod syntezy dużej liczby transkryptów krótkich interferujących RNA jest metoda z udziałem polimerazy RNA z faga T7 (Donze i wsp.). Otrzymywane w ten sposób siRNA wywołują efekt wyciszenia genów egzo- i endogennych w różnych komórkach ssaków. Nici RNA, sensowną i antysensowną, o długości 21 nukleotydów każda, generowano w osobnych reakcjach polimeryzacji na matrycy DNA kodującego wybrany fragment danego genu. Tą metodą otrzymano RNA o strukturze typu spinki (shRNA), o długościach dupleksu 22-29 nukleotydów, z czteronukleotydową pętlą UUAA. Uzyskane transkrypty shRNA wprowadzano do komórek owadów i ssaków. Wykazano, że shRNA w cytoplazmie hydrolizowane są przez enzym DICER do postaci 22-nukleotydowych siRNA, wywołując degradację docelowego mRNA (Paddison i wsp.). Inną metodą uzyskiwania siRNA w warunkach in vitro jest metoda z wykorzystaniem RNazy III z E.coli. Powstałe w wyniku jej działania krótkie fragmenty (e-siRNA) mają taką samą strukturę jak natywne siRNA. Kontrolowana reakcja enzymatycznej hydrolizy prowadzi do wydajnego generowania siRNA o długości 20-25 nukleotydów. e-siRNA wytwarzane w ten sposób wydajnie obniżają ekspresję egzogennych i endogennych genów w różnych liniach komórkowych. Planowanie sekwencji siRNA, które mogą interferować z ekspresją wybranego genu wymaga wiedzy na temat sekwencji kodującego mRNA. RNAi jest procesem cytoplazmatycznym, dlatego też siRNA nie może być skierowane na sekwencje intronowe pre-mRNA, którego dojrzewanie zachodzi w jądrze. Musi być skierowane na sekwencje kodujące genu. siRNA o sekwencjach homologicznych do różnych miejsc mRNA tego samego genu, mogą indukować zróżnicowany poziom ekspresji genu. Selekcja sekwencji docelowej dokonywana jest doświadczalnie metodą prób i błędów. Najlepiej wybierać sekwencję odległą o 50-100 nukleotydów od miejsca inicjacji translacji. Najlepiej jest wybierać sekwencje siRNA posiadające na końcach 3’ reszty urydylowe. Zawartość G-C w projektowanych sekwencjach nie powinna przekraczać 30-40%. Należy unikać sekwencji bogatych w G zdolnych do tworzenia struktur tetrapleksowych.

Zjawisko RNAi odgrywa bardzo ważną rolę w prawidłowym funkcjonowaniu komórki i całego organizmu. Zaburzenia tego procesu powodują szereg niekorzystnych zmian w organizmie.

Indukowany RNAi stanowi obronę przed wirusami, ochronę genomu przed transpozonami oraz współuczestniczy w regulacji ontogenezy. RNAi wpływa na stabilność genomu poprzez ograniczenie integracji transpozonów, które wbudowując się mogą przerwać ciągłość genów. Inhibicja ekspresji genów poprzez RNAi może przebiegać na różnych poziomach. dsRNA u roślin indukuję metylację fragmentów genomu, a w przypadku modyfikacji sekwencji promotora następuje zablokowanie transkrypcji genu. RNAi może także modulować strukturę chromatyny. Opisano pierwsze udane eksperymenty wykorzystujące siRNA skierowane przeciwko genom białek rev i tat w liniach komórkowych transfekowanych prowirusem HIV-1, jak również genom receptora komórkowego cd4, białka strukturalnego gag czy białka regulatorowego nef. Działania anty-HIV mają także na celu hamowanie replikacji wirusa w komórkach gospodarza. Po zastosowaniu siRNA w limfocytach zaobserwowano obniżenie poziomu wirusa HIV w komórkach do 30-50 razy. Inhibicja infekcji wirusowej przez RNAi dotyczy także innych wirusów jak: RSV, który wywołuje szereg chorób układu oddechowego oraz wirusa polio. Ekspresja siRNA w wektorach retrowirusowych pozwala na kierowanie ich do komórek pierwotnych, co do tej pory było nieosiągalne. Wysoka specyficzność siRNA stwarza nadzieję ich zastosowania do wyciszania onkogenów. RNAi wykorzystuje się również jako narzędzie do badania własności genów u różnych organizmów poprzez „knock-out” mRNA i obserwacje funkcjonalnego efektu inhibicji ekspresji całych grup genów na poziomie komórki czy całego organizmu.

miRNA

Wspomniana wcześniej nukleaza DICER jest w stanie wytwarzać różną od siRNA klasę cząsteczek RNA. Są to miRNA (microRNA) – krótkie cząsteczki RNA o długości 21-23 nukleotydów. W odróżnieniu od siRNA są to cząsteczki jednoniciowe. miRNA występują powszechnie u roślin, bezkręgowców i kręgowców. Jednymi z odkrytych jako pierwsze były lin-4 i let-7, określone wtedy jako stRNA (small temporal RNA). Niewiele wiadomo na temat biogenezy miRNA. W komórkach ssaków dojrzewanie miRNA przebiega w co najmniej dwóch etapach. Początkowo powstają długie transkrypty (pri-miRNA), których cięcie prowadzi do prekursorów o długości około 70 nukleotydów (pre-miRNA). Do tego momentu RNA pozostaje na terenie nukleoplazmy. Prekursory są następnie eksportowane do cytoplazmy, gdzie nukleaza DICER przecina je, produkując cząsteczki długości 21-23 nukleotydów. Pierwotnie przyjmowano, że funkcje siRNA i miRNA nie zachodzą na siebie. siRNA przypisano rolę w mechanizmach RNAi – specyficznej degradacji homologicznych transkryptów, zaś miRNA miało hamować translację nie wpływając jednak na stabilność transkryptów. Niedawne doniesienia burzą tak ścisły rozdział funkcji między te dwie klasy cząsteczek RNA. Okazuje się, że funkcja, jaką spełniać będzie dany miRNA, zależy w dużej mierze od stopnia jego komplementarności z docelowym transkryptem. Z jednej strony miRNA mogą zachowywać się jak siRNA, kiedy dostępny jest w pełni komplementarny transkrypt. Z drugiej strony miRNA mogłoby hamować translację, wiążąc docelowe transkrypty w procesie o mniejszych wymaganiach względem komplementarności oddziałujących cząsteczek.

Występowanie miRNA stwierdzono także u roślin. Są to, podobnie jak u zwierząt, cząsteczki o długości około 20-24 nukleotydów. Prekursory roślinnych miRNA, o ile istnieją, są prawdopodobnie około trzy razy dłuższe, niż ich odpowiedniki u zwierząt. Możliwe, że ulegają one bardziej gwałtownym przekształceniom posttranskrypcyjnym niż pre-miRNA u zwierząt. W przeciwieństwie do miRNA organizmów zwierzęcych i człowieka, miRNA roślin jest w pełni komplementarne do potencjalnych docelowych mRNA.