21.04.2009r.

Laboratorium z biotechnologii

Ćwiczenie nr 7

Temat:

Uwalnianie produktów wewnątrzkomórkowych.

1. Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest wydzielanie wewnątrzkomórkowej lipazy z pleśni z Mucor circinelloides różnymi metodami dezintegracji komórek.

2. Wykonanie ćwiczenia i opracowanie wyników

Do ćwiczenia wykorzystano szczep grzybów nitkowatych Mucor circinelloides z kolekcji Instytutu Biochemii Technicznej, hodowany na wytrząsarce w czasie 72h w temperaturze 30°C na podłożu zawierającym namok kukurydziany i olej oliwkowy.

Wydzielano enzym z komórki Mucor circinelloides różnymi metodami:

Metoda I

Odważono 0,5g biomasy przemytej wodą destylowaną, osad przeniesiono do szklanego naczynia i następnie dodano 5ml 0,05M buforu fosforanowego pH=7, inkubowano w cieplarce T=37°C, przez 15min i przesączono na sączkach - przegrodach celulozowych.

Metoda II

Odważono 0,5g biomasy przemytej wodą destylowaną, osad przeniesiono do szklanego naczynia i następnie dodano 4,5ml 0,05M buforu fosforanowego pH=7 i 0,5ml sulfaktanta - (bezbarwnego) roztworu cholanu sodu, inkubowano w cieplarce T=37°C, przez 15min i przesączono na sączkach - przegrodach celulozowych.

Metoda III

Odważono 0,5g biomasy przemytej wodą destylowaną, osad przeniesiono do moździerza i roztarto używając kulek ze szkła bezołowiowego z 4,5ml 0,05M buforu fosforanowego pH=7. Następnie całość przeniesiono do szklanego naczynia i dodano 0,5ml sulfaktanta - (bezbarwnego) roztworu cholanu sodu, inkubowano w cieplarce T=37°C, przez 15min i przesączono na sączkach - przegrodach celulozowych.

Metoda IV

Odważono 0,5g biomasy przemytej wodą destylowaną, osad przeniesiono do szklanego naczynia i dodano 4,5ml 0,05M buforu fosforanowego pH=7. Następnie homogenizowano przez 2 minuty homogenizerem mechanicznym. Całość przeniesiono do naczynia szklanego i dodano 0,5ml sulfaktanta - (bezbarwnego) roztworu cholanu sodu, inkubowano w cieplarce T=37°C, przez 15min i przesączono na sączkach - przegrodach celulozowych.

Metoda V

Odważono 0,5g biomasy przemytej wodą destylowaną, osad przeniesiono do naczyńka wykonanego z folii aluminiowej i dodano 4,5ml 0,05M buforu fosforanowego pH=7

i 2-krotnie zamrożono do temperatury -20°C i rozmrożono. Całość przenieść do naczynia szklanego i dodano 0,5ml sulfaktanta - (bezbarwnego) roztworu cholanu sodu, inkubowano w cieplarce T=37°C, przez 15min i przesączono na sączkach - przegrodach celulozowych.

Metoda VI

Odważono 0,5g biomasy przemytej wodą destylowaną. Osad przeniesiono do erlenmayerki i zalano 5ml acetonu. Zawartość mieszano przez 5 min i odsączono na sączku bibułowym. Przemywanie 3ml acetonu powtórzono jeszcze 2-krotnie. Odwodnioną grzybnię suszono pod wyciągiem na sączku przez 15min. Całość przenieść do naczynia szklanego i dodano 4,5ml 0,05M buforu fosforanowego pH=7 i 0,5ml sulfaktanta - (bezbarwnego) roztworu cholanu sodu, inkubowano w cieplarce T=37°C, przez 15min i przesączono na sączkach - przegrodach celulozowych.

Otrzymane przesącze zbadano na aktywność esterazową lipazy:

Jako substrat wykorzystano 50 μmol/cm³ roztwór octanu p-nitrofenolu, przed użyciem 5-krotnie rozcieńczonego, który pod wpływem esteraz oraz lipaz jest hydrolizowany z wydzieleniem

p-nitrofenolu, który wykazuje maksimum pochłaniania światła przy długości fali λ=399nm.

Oznaczenie wykonano w następujący sposób:

Do probówek wprowadzano po 0,1ml każdego z ekstraktu oraz 0,8ml 0,05M buforu fosforanowego o pH=7

Tabela nr 1 - zestawienie otrzymanych wyników:

Metoda/Grupa	I	II	III	IV	aktywność
MI - bufor	0,180	0,222	0,112	0,14
MII - cholan	0,216	0,244	0,145	0,237
MIII - rozcieranie	0,557	1,898	0,433	1,138
MIV - homogenizer	0,242	1,054	0,580	1,184
MV - wymrażanie	0,208	0,773	0,167	0,401
MVI - aceton	0,894	1,333	0,500	1,084

K=0,076 [jA*ml/μmol]

A=K*c => c=A/K

c₁=0,18/0,076=2,37μmol/ml

Tabela nr2 - zestawienie otrzymanych stężeń p-nitrofenolu:

Metoda/Grupa	I [μmol/ml]	II [μmol/ml]	III [μmol/ml]	IV [μmol/ml]	aktywność
MI - bufor	2,37	2,92	1,47	1,84
MII - cholan	2,84	3,21	1,91	3,12
MIII - rozcieranie	7,33	24,97	5,70	14,97
MIV - homogenizer	3,18	13,87	7,63	15,58
MV - wymrażanie	2,74	10,17	2,32	5,28
MVI - aceton	11,76	17,54	6,58	14,26

Akt. = c*2*R*10^-6 / t

t-czas reakcji enzymatycznej =15min R-rozcieńczenie =50 (wzięto 0,1ml z 5ml)

2-wzięto do reakcji 0,5g biomasy 10^-6 - μmole

Akt.₁ = 2,37*2*50*10^-6 /15=1,58*10^-5 mol/(g*min)

umol/ml*t

Metoda/Grupa	*10^-6	*10^-6	*10^-6	*10^-6	aktywność *10^-6
MI - bufor	15,80	19,47	9,80	12,27	12,62
MII - cholan	18,93	21,40	12,73	20,80	20,38
MIII - rozcieranie	48,87	166,47	38,00	99,80	74,34
MIV - homogenizer	21,20	92,47	50,87	103,87	71,67
MV - wymrażanie	18,27	67,80	15,47	35,20	26,74
MVI - aceton	78,40	116,93	43,87	95,07	86,76

3. Wnioski

Najbardziej efektywną z badanych metod uwalniania produktów wewnątrzkomórkowych jest przemywanie acetonem. Najmniej efektywną zaś, sączenie po samym inkubowaniu biomasy w buforze fosforanowym. Podobną aktywność wykazuje enzym wydzielony metodą rozcierania i homogenizacji.

enzym wewnątrzkomórkowy,

metoda nie jest specyficzna na lipazy

metoda oznaczenia esteraz

odczytujemy poziom esteraz

cholan sodu usuwa częściowo ze ściany komórkowej substancje lipidowosacharydowo - tworzą się kanały -

lipaza wypływa z komórki

dodanie cholanu do nasyconej wodą biomasy - nie ma sensu

jeżeli zastosujemy dezintegrację mechaniczną, a potem do komórki dodamy cholan sodu - dostęp duży do komórki - możemy wydzielić lipazę

użycie mechanicznych - kulki, homogenizer

dobra jest dezintegracja mechaniczna i cholan - dobra metoda (sulfaktanty)

zamrażanie i wymrażanie - w zależności jak bardzo zamrożono,

metoda - trwa długo - trzeba mieć pewność że woda zamarzła w komórce (potrzeba godzinę, albo dwie)

aceton -wymywa kompleksy polisacharydowolipidowe - ze ściany komórkowej, tworzą się naturalne kanały, gdzie wchodzi aceton i następuje wymienianie wody - woda wypływa na zewnątrz, pozostaje lipaza in situ na matrycach komórkowych,

bardzo łatwo wnika cholan sodu i wypływa kompleks cholan-enzym

dobra metoda do przygotowania większej ilości

nie mamy dobrych warunków żeby odróżnić

wszystkie metody prowadzą do dezintegracji ściany komórkowej

wszystkie są dobre do wydzielenia enzymu z komórki, pod warunkiem, że użyjemy cholanu

jak wyznaczyć aktywność

współczynnik kierunkowy prostej dla p-nitrofenolu K=0,067 [jA*ml/uM]

ze steżenia ilość p-nitrofenolu

c-steżęnie p-nitrofenolu wyznaczamy sobie ilość /g grzybni na minutę

drobnoustroje które równocześnie wytwarzają enzymy wewnątrzkomórkowe - lipazy i lipidy

badanie micelium do badań - tłuste - bo lipidy wydzielane przez grzyb nitkowaty, cenne lipidy, zawierające karotenoidy, (do kosmetyków? - doskonałe właściwości), zaleta - co tydzień można zbierać

lipazy - triacyloglicerolohydrolazy hydrolizują glicesterazy , esterazy specyficzne, działają na substancje nierozpuszczalne w wodzie

enzymy wytwarzane przez drobnoustroje, pozakomórkowe - wydzielane do środowiska,

interesujące właściwości - bardzo hydrofobowe, oczyszczone, rozpuszczają się w rozpuszczalnikach organicznych, termostabilne w rozpuszczalnikach organicznych, w eterze naftowym ogrzewanie długo, 100st. niewiele obniża aktywność,

synteza biodisel acydolizy metody chemiczne - duże zanieczyszczenie, u nas w kolumnie - odpowiednia forma lipazy - lepsze dla środowiska,

enzym silnie związany w komórce, prawdopodobnie z membranami, nie znajduje się w przestrzeni peryplazmatycznej, nie chce samoistnie wypłynąć z komórki, unikalne enzymy, tylko u nas na wydziale,

nie możemy stosować ultradźwięków,

rozmrażanie i zamrażanie - też zła metoda,

nie odważamy 1g, tylko 0,5g

badamy przesącz

czy rzeczywiście wypływa z buforu o pH=7 nasza lipaza najwyższa aktywności

pranie w pH ok.12

enzym modyfikowany genetyczne - stosowany w proszkach do prania,

nasz naturalny szczep - jak się nauczymy to

pH może być ujemne -2,2 do 16,5 - szerszy

dodajemy sulfaktanta - cholan sodu - dobry detergent na lipazy

enzymy dobrze związane z rejonami w komórce, żeby tłuszcz który zjemy zemulogwać i rozłożyć, wytwarzany w organizmie - naturalnie, działa tak - częściowo usuwa kompleksy polisacharydowo-białkowe, które są w ścianie komórkowej, enzym wypłynie poza komórkę,

dezyntegracja mechaniczna, może być więcej enzymy wydostającego się z komórki, moździeże, roztarto w moździerzu używając kulek ze szkła bezołowiowego, do wydobywania substancji wewnątrzkomórkowych, (ołów - inhibitor enzymów) 0,25-0,3mm wielkość kulek, odważono 0,5 g wsypać troszkę kulek - niewiele, na czubku, rozcierając tak żeby tłuczek toczył się po kulkach, przeniesiono do innego naczynia, dodano cholanu, inkubowano w temperaturze, odsączono na sączku biubłowym

dezintegracja mechaniczna - ostrze tnie biomasę, naczynka - po filmach fotograficznych, nie potrzeba chłodzić w łaźni, nowy homogenizator, po homogenizacji, dodać cholanu, wymieszać, inkubować,

micelium, 4,5ml buforu, do zamrażarki - po zamrożeniu wyjęto i rozmraża w dłoni i drugi raz zamrożono, w środku komórki - temperatura zamarzania - obniżona, po dwukrotnym rozmrożeniu i odmrożeniu dodano 0,5 ml cholanu sodu, przesączono - próba do analizy

odwodnienie próby acetonem w kolbie erlenmayerka 100ml, wlać 2-3 ml acetonu, bagietką rozprowadzono biomasę, aceton usuwa kompleksy lipopolisacharydowe, przez kanały aceton wpływa do komórki, na koniec jeśli 3 razy wymieszano, ugniatanie bagietką, przez lejek wylewa się aceton, biomasa - zawraca się do kolby i ponownie dodaje acetnu,

biomasę - na sączek , wyjmuje z lejka, pod wyciągiem ustawić, suchą biomasę - odwodnioną, ekstrakcja lipazy - 4,5ml buforu, 0,5ml cholanu

6 probówek z ekstrakcji +1 z wodą

0,1 ml pobrać 0,8ml buforu i z probówkami przyjść i pobrać - na końcu substrat 0,9ml - buforu i 0,1ml substratu -

aktywność lipazy względem octanu p-nitrofenolu

będziemy hydrolizować octan p-nitrofenolu (r-r bezbarwny) - metoda pośrednia

kwas octowy i p-nitrofenol (barwa żółta ) powstaje - badanie spektrofotometrem - przy długości fali 399

rozcieńczenie 5-krotnie wodą

zadania kalkulatory

kolokwium g.16

S-4

zadania

+teoria niezbędna

czasami ćwiczenie nie wychodzi - dowód na istnienie diabła , a jak diabła to i wyżej :P

1

---