Współczesne metody badania enzymów:

• Dichroizm kołowy:

• Służy do badania struktury drugorzędowej białek

• Większość cząsteczek jest asymetryczna - gdy absorbują światło, wykazują preferencje w stosunku do absorpcji, w prawo lub w lewo, kołowo spolaryzowanego światła

• Site-directed mutagenesis, deletional mutagenesis:

• Manipulując sekwencją aminokwasową można zidentyfikować grupy chemiczne biorące udział w wiązaniu ligandów i etapach katalizy

• NMR (spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego):

• Umożliwia badania struktur przestrzennych białek i ich dynamiki w roztworze

• Opiera się na zjawisku rezonansu między stanami spinowych poziomów energetycznych, a zewnętrznym polem magnetycznym - w wyniku tego możliwa jest absorpcja energii Spektrometria mas:

• Pozwala na analizę zjonizowanych form cząsteczek w fazie gazowej

• Pomiar masy cząsteczkowej odbywa się przez wyznaczenie przyśpieszenia uzyskanego przez jony w polu elektrycznym - zgodnie z III prawem Newtona pomiar przyśpieszenia przy znanej sile pozwala obliczyć masę

Orbitale atomowe:

• Wiązania chemiczne w cząsteczkach są pochodnymi wiązań między atomami, a ściślej - między orbitalami poszczególnych atomów, których oddziaływania tworzą orbitale molekularne

• Elektrony zajmują osobne, ściśle określone (dyskretne) orbitale otaczające jądro atomu

Energia swobodna Gibbsa (G):

• Ta forma energii jest zdolna do wykonania pracy w stałej temperaturze i ciśnieniu, jakie są np. W komórce

• Związek między zmianą energii swobodnej w reagującym systemie i entropią (w stałych warunkach ciśnienia i temperatury) jest dany równaniem, które łączy I i II zasadę termodynamiki - ΔG = ΔH - TΔS:

• ΔG - zmiana energii swobodnej systemu [cal] w czasie reakcji w stałej temperaturze (T) [K] i ciśnieniu - część zmiany całkowitej energii, która może być użyta do wykonania pracy, gdy system dąży do równowagi w stałej temperaturze, stałym ciśnieniu i stałej objętości

ΔG zmienia się wraz ze stężeniem substratów i produktów - tak jak ph roztworu słabego kwasu zmienia się ze stężeniem jego form protonodawcy i protonobiorcy

• ΔG⁰ - standardowa zmiana energii swobodnej, jest energią swobodną dla reakcji w warunkach standardowych w stężeniu 1 M (1 atmosfery dla gazów) wszystkich reagentów i produktów

ΔG⁰ jest stałą dla danej reakcji chemicznej (w określonej temperaturze) - tak jak pka słabego kwasu

Bilans energii swobodnej reakcji:

• Reakcja endoergiczna (ΔG⁰ > 0) - nie może przebiegać spontanicznie w kierunku zapisanym, ale przebiega w kierunku przeciwnym

• Brak zmian energii swobodnej (ΔG⁰ = 0) - reakcja nie zachodzi

• Reakcja egzoergiczna (ΔG⁰ > 1) - może przebiegać spontanicznie w kierunku zapisanym przy 1 M stężeniu wszystkich składników

Stan przejściowy reakcji reprezentuje barierę energetyczną, która musi zostać pokonana, żeby reakcja mogła przebiegać dalej:

• Im wyższa jest różnica energetyczna między stanem początkowym a przejściowym (energia aktywacji), tym trudniej przebiega reakcja

• Gdy układ uzyska wystarczającą energią dla osiągnięcia stanu przejściowego, to reakcja może przebiec do końca (albo powrócić do stadium początkowego)

• Energia aktywacji (E_a, ΔG^‡) - energia potrzebna do osiągnięcia stanu aktywacji:

• Różnica energii swobodnej między stanem reagentów a stanem przejściowym

• Wielkość energii aktywacji jest bezpośrednio powiązana z szybkością reakcji chemicznej - w miarę jak rośnie energia aktywacji, szybkość reakcji spada wykładniczo

Równowaga kwasowo-zasadowa:

• Kwasem jest każda substancja, która może oddawać protony - po ich oddaniu staje się ona skoniugowaną zasadą

• Zasadą jest każda substancja, która może akceptować protony w wyniku reakcji z kwasem Brønsteda-Lowry'ego

Pk_a jest ważną cechą, którą należy brać pod uwagę przygotowując roztwory do badań enzymatycznych:

• Ph, w jakim reakcja enzymatyczna jest prowadzona, może mieć znaczący wpływ na szybkość reakcji i na stabilność białka

• Roztwory buforujące, których wartość pk_a odpowiada optimum ph dla danej aktywności enzymatycznej, powinny być dodawane do roztworów enzymów, żeby utrzymać ph tych roztworów w pobliżu pk­_a buforu

Oddziaływania elektrostatyczne (wiązania jonowe, mostki solne, pary jonowe):

Gdy dwie przeciwnie naładowane grupy znajdą się w bliskim sąsiedztwie, zostają przyciągane siłami Coulomba

Wiązania wodorowe:

Tworzą się, gdy atomy wodoru są wspólne dla dwóch naładowanych ujemnie atomów - atom z którym wodów jest związany kowalencyjnie to donor wiązania wodorowego, drugi atom to akceptor wiązania wodorowego

Siły van der Waalsa:

Rozmieszczenie elektronów wokół atomów nie jest ustalone, chmury elektronowe oscylują - wynikiem tego jest przejściowa asymetria rozmieszczenia elektronów

Łańcuchy boczne zawierają w sobie atomy, które są połączone z protonami mogącymi służyć jako donory dla tworzenia wiązań wodorowych - inne aminokwasy są akceptorami dzięki samotnej parze elektronowej na atomach łańcuchów bocznych:

• Oddziaływania te stabilizują strukturę białka

• Dodatkowo wiązania wodorowe mogą się tworzyć między łańcuchami bocznymi i ligandami (substratami, produktami, inhibitorami) i mają wtedy udział w energii wiązania między enzymem a wspomnianymi cząsteczkami

Kilka aminokwasów może być poddawanych potranslacyjnym modyfikacjom, które zmieniają ich budowę, a więc i reaktywność, w wyniku tworzenia wiązań kowalencyjnych - w niektórych wypadkach modyfikacje łańcuchów bocznych mają krytyczne znaczenie dla mechanizmu katalitycznego enzymów:

• Wiązania dwusiarczkowe (S-S):

• Tworzą się w wyniku oksydacji dwóch reszt SH cystein

• Mogą powstawać wewnątrzcząsteczkowo (w jednym peptydzie) lub mogą łączyć raze dwa peptydy - stabilizują w ten sposób pofałdowaną strukturę białek

• Fosforylacje - dodawanie reszty kwasowej nieorganicznego fosforanu:

• Proces odwracalnej fosforylacji defosforylacji (kinazy i fosfatazy) ogromnie wpływa na aktywność biologiczną enzymów, receptorów i białek zaangażowanych w tworzenie kompleksów białko-białko i białko-kwas nukleinowy

• Glikozylacje:

W wyniku glikozylacji białka mogą przłączać cukry w wyniku tworzenia wiązań kowalencyjnych między grupami OH seryny i treoniny (O-linked glycosylation) i z azotem łańcucha bocznego asparaginy

Wiele enzymów zawiera w swojej strukturze dwuwartościowe kationy Mg²⁺, Ca²⁺, Zn²⁺ i jony metali przejściowych (Fe, Cu, Ni, Co):

• Metale są matrycą dla fałdowania białka

• Domeny białek wiążących kwasy nukleinowe zawierają palce cynkowe, cynk jest centrum strukturalnym insuliny, a kalmodulina wiąże jony wapnia

• Metale biorą udział w reakcjach chemicznych katalizowanych przez enzym

• Stanowią cenra redox (hem-Fe, żelazo niehemowe, Cu)

Struktura trzeciorzedowa:

• Fałdowanie takie zbliża odległe aminokwasy, co pozwala na utworzenie reaktywnych chemicznie centrów, jak centra aktywne enzymów - np. Chymotrypsyna:

• Proteaza serynowa rozcinająca wiązanie peptydowe między określonymi resztami aminokwasowymi

• Wszystkie proteazy serynowe mają resztę seryny w centrum aktywnym - reszta ta funkcjonuje jako nukleofil w celu zaatakowania peptydu i rozpoczęcia katalizy

Centrum aktywne enzymów służy dwóm celom: wiązaniu cząsteczki substratu i doprowadzeniu do bliskiego sąsiedztwa chemicznie reaktywnych grup, co ułatwi przemianę substratów w produkty katalizowanej reakcji. Trójwymiarowa struktura centrum aktywnego enzymu jest stereochemicznie komplementarna do struktury cząsteczki substratu. Dopasowanie do siebie centrum aktywnego i substratu jest sposobem stabilizacji stanu przejściowego reakcji, co prowadzi do znaczącego zwiększenia szybkości reakcji.

W stanie przejściowym cząsteczka substratu jest związana w miejscu aktywnym enzymu. Istnieją tu 2 formy molekularne: jedna, gdy enzym i substrat tworzą ciasny kompleks enzym-substrat (ES) i druga, w której enzym i produkt są związane, enzym-produkt (EP).

Enzym i substrat muszą się zetknąć (poprzez molekularne kolizje w roztworze), żeby utworzyć kompleks ES. Ten proces jest odwracalny, ale w warunkach laboratoryjnych tworzenia ES jest uprzywilejowane (ΔG dla typowego wiązania ES to -3 do -12 kcal/mol). Po związaniu substratu, struktura centrum aktywnego ułatwia tworzenie stanu przejściowego. Kompleks ES++ może powrócić do struktury ES lub przekształcić się w EP

E+S <-> ES <-> ES* <-> EP <-> E+P

Ponieważ cząsteczka wolnego enzymu pojawia się po stronie reagentów i produktów to można ja ominąć przy opisie termodynamicznym ogólnej reakcji. Energia swobodna reakcji (ΔG) zależeć będzie od [S]/[P]. ΔG=-RT ln ([P]/[S]). Jest to dokładnie ten sam sposób obliczania jak dla reakcji niekatalizowanej. ΔG zależy tylko od początkowego i końcowego stanu reakcji, nie od pośredników (ES, ES++, EP). ENZYM NIE ZMIENIA RÓWNOWAGI MIĘDZY PRODUKTAMI I SUBSTRATAMI.

W jaki sposób enzymy powodują przyspieszenie reakcji?

Wiele reakcji niekatalizowanych przebiega zbyt wolno, bo muszą pokonać dużą barierę energetyczną, aby osiągnąć stan przejściowy, jeśli jakimś sposobem bariera ta zostanie obniżona przez stabilizację stanu przejściowego to reakcja będzie przebiegać szybciej

OBNIŻENIE Ea O 4 kcal/mol ZWIĘKSZYŁO V 10³ KROTNIE. Tak działają enzymy. Zwiększają szybkość reakcji prze to, że stabilizują jej stan przejściowy obniżając barierę energetyczną, która jest do pokonania.

W dodatku siły wewnątrz centrum aktywnego enzymu mogą powodować ustawienie grup reaktywnych enzymu i cząsteczki substratu we właściwej orientacji dla przebiegu reakcji. W miejscu aktywnym wiązania wodorowe, elektrostatyczne, hydrofobowe i van der Vaalsa mogą odkształcać cząsteczkę substratu w kierunku stanu przejściowego. Muszą one być ukierunkowane, żeby odkształcenia wiązań miały odpowiednią orientację dla promowania stanu przejściowego. Inaczej mówiąc, interakcje w miejscu aktywnym mogą powodować perturbacje orbitali molekularnych substratu, przez ułożenie ich w jednej linii z grupami reaktywnymi w miejscu aktywnym enzymu tak, że przypominają one konfiguracją orbitali stan przejściowy. Koncepcja orbital steering (sterowanie orbitalami) - Koshaland, 1970r.. Po związaniu cząsteczki substratu w centrum aktywnym enzymu, dalsze etapy przebiegają z mniejszym, niż gdyby reakcja zachodziła w roztworze, SPADKIEM ENTROPII. Jest to jeszcze jedna korzyść energetyczna wpływająca na zwiększenie szybkości reakcji.

Centrum aktywne enzymy zajmuje tylko niewielką część molekuły. Ma strukturę przestrzenną co oznacza, że aminokwasy i kofaktory w centrum aktywnym są precyzyjnie utrzymywane, w ułożeniu jeden w stosunku do drugiego i w stosunku do struktury substratu. Ta trójwymiarowa konformacja jest wynikiem całkowitej trzeciorzędowej struktury białka. W większości wypadków wiązanie substratu z enzymem zachodzi przy pomocy wiązań niekowalencyjnych. Centrum aktywne enzymu mieści się zwykle w bruzdach i szczelinach cząsteczki białka. Powoduje to, że jest ono praktycznie izolowane od rozpuszczalnika, który zmniejszałby aktywność enzymatyczną enzymu.

Model wymuszonego dopasowania Koshlanda

Mechanizm oparty na dopasowaniu kształtu enzymu do substratu (lub odpowiedniej grupy substratów) i przekształceniu ich w produkty.

Model klucza i zamka Fishera

Enzym tzn. Jego miejsce aktywne musi być dopasowany swoim kształtem do substratu, by móc przekształcić go w produkt.

• Model trzypunktowego przyłączenia

Dehydrogenazy alkoholowe katalizują transfer wodoru grupy metylenowej na NAD, każdy enzym czyni to stereospecyficznie. Można to wyjaśnić sposobem przyłączania się do centrum aktywnego grup CH₃, OH i jednego H. Jeśli CH₃ i OH są zakotwiczone, to enzym przenosi proton znajdujący się w pobliżu NAD.

• Model indukowania molekularnych napięć (m. Koła tortur)

1. Wolny enzym i wolny substrat w roztworze.

2. Wiązanie z enzymem.

3. Zachodzące zmiany konformacyjne w enzymie - lepsze wiązanie substratu.

4. Enzym przechodzi dalsze dostosowanie konformacyjne, które indukuje napięcie w substracie - stan przejściowy.

5. Napięcie prowadzi do rozerwania wiązań i uwolnienia produktów A i B.

Enzym może zniekształcić substrat, wymuszając na nim konformację podobną do stanu przejściowego.

1. Oksydoreduktazy - reakcje red-ox

2. Transferazy - przenoszenie grup chemicznych

3. Hydrolazy - hydrolityczne rozerwanie wiązań

4. Liazy - niehydrolityczne rozerwanie wiązań

5. Izomerazy - zmiany w ustawieniu atomów i cząsteczek

6. Ligazy - łączenie 2 lub więcej cząsteczek razem

Proteazy serynowe to enzymy, które katalizują rozpad wiązań peptydowych w peptydach i białkach. Ich mechanizm katalizy wymaga triady aminokwasowej w centrum aktywnym enzymów. Reszta serynowa działa jako główny nukleofil do ataku nukleofilowego na wiązanie peptydowe

Proteazy serynowe pełnią rolę nie tylko w procesach trawiennych, ale także w krzepnięciu krwi, zapaleniu i szeroko pojętej odpowiedzi immunologicznej.

Na podstawie właściwości strukturalnych, proteazy serynowe podzielono na 3 klasy: chymotrypsyn, subtylizyn i karboksypeptydaz II.

Kataliza kwasowo- zasadowa

Prawie każda reakcja enzymatyczna zawiera pewien typ transferu protonów wymagający udziału gr. Zasadowych i kwaśnych. W niektórych przypadkach protony i jony hydroksylowe działają bezpośrednio jako gr. Kwasowe i zasadowe co nosi nazwę specyficznej katalizy kwasowo- zasadowej. Częściej jednak substraty organiczne, kofaktory lub boczne łańcuchy aminokwasów enzymu pełnią taką rolę działając jako kwasy i zasady Broensteda- Lowry' ego w uniwersalnej katalizie kwasowo - zasadowej.

Anhydrazy węglanowe ( 7 izoform u człowieka; w erytrocytach a. Węglanowa II ) katalizują dehydratację HCO₃^- do CO₂ aby ten wydalić, gdy krew przepływa przez płuca. Enzymy te katalizuja też reakcję odwrotną przekształcenia CO₂ do HCO₃^- który znajdujemy w wydzielinach organizmu

Wahadło protonowe

Aby przezwyciężyć ograniczenia wynikające z szybkości przenoszenia protonów z cząsteczki wody związanej z cynkiem, w najbardziej aktywnych a. Węglanowych w toku ewolucjo powstało wahadło protonowe, które umożliwia przeniesienie protonów do buforu.

Kataliza nukleofilowa

W katalizie nukleofilowej tworzy się wiązanie kowalencyjne między nukleofilem enzymu i grupą na cząsteczce substratu w stanie przejściowym reakcji. To właśnie nukleofilowy atak reszty Ser na karbonyl substratu proteazy serynowej z utworzeniem pośrednika enzym- acyl jest przykładem katalizy tego typu.

Kataliza elektrofilowa

W katalizie elektrofilowej kowalencyjnej tworzą się pośredniki między kationowym elektrofilem enzymu i bogatą w elektrony częścią cząsteczki substratu. Łańcuchy boczne aa nie są dobrymi elektrofilami. Grupy elektrofilowe pochodzą od ko faktorów organicznych ( pierścień pirydynowy fosforanu pirydoksalu) czy od kationowych centrów metali.

Kinazy monofosforanów nukleozydów

Enzymy te katalizują przeniesienie koncowej grupy fosforanowej z trójfosforanu nukleozydu ATP na grupę fosforanową monofosforanu nukleozydu. Proces musi tak przebiegać żeby fosforan nie został przeniesiony na cząsteczkę wody; ATP zostałby wtedy zhydrolizowany. Enzymy te są nie aktywne gdy brak Mg2+ Mn2+

Rzędowość reakcji mówi nam o tym jak na szybkość reakcji wpływają stężenia substratów w danych warunkach. Reakcje pierwszego rzędu to reakcje, których szybkość jest proporcjonalna do stężenia jednego substratu.

Reakcje drugiego rzędu to takie , których szybkość jest proporcjonalna do stężenia produktu utworzonego przez dwa substraty , lub kwadratu stężenia jednego substratu.

Reakcje III-rzędu , są stosunkowo rzadkie, ich szybkość jest proporcjonalna do ilości produktu powstałego z trzech stężeń substratów.

Wszystkie enzymy wykazują efekt nasycenia , który zmienia się jednak ze względu na stężenie substratu potrzebne do wysycenia danego enzymu. Trzeba pamiętać, że w reakcjach chemicznych przebiegających przy pomocy katalizatorów również może zachodzić nasycenie substratem.

Przy niskim stężeniu substratu początkowa szybkość reakcji v0 jest prawie proporcjonalna do stężenia substratu. W miarę jak rośnie stężenia substratu , szybkość początkowa rośnie wolniej , co znaczy , że nie jest już proporcjonalna do stężenia substratu, a jej rzędowość mieszana. Z dalszym wzrostem stężenia substratu reakcja staje się niezależna od jego stężenia i asymptotycznie osiąga stała szybkość . W tym zakresie stężenia substratem reakcja jest 0-rzędu. A o enzymie mówi się że jest nasycony substratem.

Vo=Vmax [S] /(Km +[S]): równanie Michaelisa Menten

Stała Michelisa równa stężeniu substratu przy którym początkowa szybkosć reakcji jest równa połowie szybkości maksymalnej. Miano tej stałej to mole/litr . Jest niezależna od stężenia enzymu.

Km nie jest stałą wartością , zależy od rodzaju substratu, zmienia się wraz z ph i temp. Dla enzymów mających więcej niż jeden substrat , każdy substrat ma swoją Km, jednak nie zależy od stężenia substratu!

Dlaczego oznaczamy Km?

1. Km wskazuje na panujące w komórce stężenie substratu.

2. Ponieważ Km jest wartością stałą dla danego enzymu, to można porównywać enzymy z różnych organizmów , albo z różnych tkanek tego samego organizmu , albo s tej samej tkanki na różnym stopniu rozwoju. Możemy więc określić czy enzym A jest identyczny z enzymem B czy też są to inne białka katalizujące taką samą reakcję .

3. Km wskazuje na dopasowanie alternatywnego substratu do enzymu. To znaczy, że substrat o najniższej wartości Km ma najwyższe powinowactwo do enzymu. Najlepszy substrat to taki, który charakteryzuje się najwyższą wartość Vmax/Km

Stała substratowa - stała dysocjacji kompleksu ES

Równanie Lineweavera-Burke'a 1/ v0 = Km/ V * 1 / [S] + 1 / V

Gdy 1/vo wykreśli się w zależności od 1/S to otrzyma się linię prostą

Wykres Eadie-Hofstee

Pożyteczną transformacją równania M-M jest pomnożenie obu stron równanie L-B przez Vmax i przekształcenie go do postaci :

Vo=-Km(vo/[S])+ Vmax

Wykres vo w zależności od vo/[S] nie tylko, że dostarcza Vmax i Km ale ułatwia dostrzeżenie odchyleń od liniowości, czego można nie zobaczyć na wykresie podwójnie odwrotnościowym L-B

Czynniki wpływajace na szybkość reakcji enzymatycznej

Odchylenia od norm ph zawsze zmniejszają szybkość reakcji enzymatycznej

Optimum większości enzymw to 25-40 stopni cejsjusza, a ph w granicach 7, choc zdazają się odstępstwa

Wpływ temperatury na aktywność enzymów.

Reakcje enzymatyczne tak jak reakcje chemiczne zwiększają swoja szybkość pod wpływem temperatury ( 2-krotnie/ 10C) jednak enzymy są białkami i ulegają denaturyzacji pod wpływem wysokiej temperatury. Dlatego zwiększenie efektywności katalizy ze wzrostem temperatury jest znoszone przez denaturacje białka.

Czynniki wpływające na szybkość reakcji:

Temperatura, siła jonowa, stężenie anionów i kationów, ph.

Jedna jednostka międzynarodowa (1U) to taka ilość enzymu, która katalizuje utworzenie 1mola produktu na min w określonych warunkach.

Liczba obrotów (aktywność cząsteczkowa) to liczba moli substratu przemienionego w ciągu min przez mol enzymu (jednostki/mol enzymu) w warunkach optymalnych.

Stężenie enzymu w nieoczyszczonym preparacie podaje się jako specyficzną aktywność (jed/mg białka). Mierzy się ją przy nasycającym stężeniu substratu (v~V_max) i optymalnych warunkach ph i temperatury dla maxymalnej aktywności. Aktywność specyficzna białka enzymatycznego rośnie w miarę tego jak coraz większą masę białka enzymatyczngo stanowi nasz enzym, czyli w miarę jak postępuje oczyszczanie.

Utrata aktywności enzymu jest spowodowana jego niestabilnością. Dla każdego enzymu trzeba znaleźć empirycznie warunki przechowywania. Warunki optymalne dla stabilności białka nie są tożsame z warunkami dla optymalnej aktywności enzymu. Enzym trzeba przechowywać w warunkach promujących stabilność, a pomiar enzymatyczny w warunkach dla optymalnej aktywności. Długie przechowywanie w -70C, przechowywanie w -20C w 50% roztworze glicerolu, co powoduje, że enzym utrzymuje się w fazie płynnej i jest niewrażliwy na zamrażanie i rozmrażanie (cykliczne rozmrażania lodówek).

Stan wzbudzony cząsteczki trwa <50ns, a cząsteczka musi znaleźć sposób na pozbycie się naddmiaru energii, aby wrócić do stanu podstawowego konfiguracji elektronowej.Większość tej energii ulega rozproszeniu do otoczenia w postaci ciepła.Pewne cząsteczki mogą powracać do stanu podstawowego w wyniku emisjinadmiaru energii w postaci światła.Emitowany foton ma mniejenergii niż światło wzbudzające dlatego maksimum fluorescencji wypada przy dłuższej fali niż maksimum absorbcji.

Podstawowa strategia wykorzystania izotopów do pomiarów szybkości reakcji to inkorporacja w strukturę substratu składnka radioaktywnego, który po katalizie można odzyskać w produkcie. Dzięki temu mozna mierzyć ilość radioaktywności we frakcjach substratu i produktu wnioskując z tego o ubytku substratu i przyroście produktu.

H.Bequerel. Najstarszą metodą detekcji radioaktywności jest autoradiografia.- klisza fotograficzna położona na z pietnem radioaktywnym ciemnieje.

Do separacji cząsteczek wykorzystuje się różnice w ich wielkości, masie, ładunku elektrycznym lub powinowactwie do innych cząsteczek

Dializa

Pozbawia białka substancji niskocząsteczkowych stosowanych na różnych etapach oczyszczania.

Stosowane są tu półprzepuszczalne pory maja pory wystarczająco duże, żeby mogły przez nie przechodzić małe cząsteczki. Białka i inne duże cząsteczki pozostają w worku dializacyjnym.

Chromatografia jonowymienna

Polega na wymianie zdolnych do wymiany jonów (+ lub -) jonitu na inne jony o tym samym ładunku zawarte w roztworze. Jonity to substancje wielkocząsteczkowe, w których wyodrębnia się matryce w postaci gąbczastej sieci przestrzennej oraz grupy chemicznie czynne, g. Funkcyjne, kwasowe lub zasadowe, połączone z jonami o znaku przeciwnym. Rodzaj grup funkcyjnych decyduje o tym, czy wymieniają się aniony czy kationy. Kationy wymieniają kationy, które oddysocjowują od anionów. Aniony wymieniają aniony, które oddysocjowują od kationów.

Do rozdzielenia składników mieszaniny o różnych cząsteczek można stosować struktury porowate (żele), pełniące w procesie rozdziału rolę sita. Jony oraz substancje drobnocząsteczkowe dyfundują łatwo wgłąb ziaren żelu. Innymi słowy roztwór zalegający we wnętrzu żelu jest całkowicie dostępny dla tych substancji. Natomiast większe substancje nie wchodzą do wnętrza ziarenek żelu na skutek zatrzymywania ich przez gęstą sieć substancji żelowej.

SDS-PAGE do rozdziału peptydów i białek na podstawie ich mas cząsteczkowych. SDS (detergent anionowy) nadaje im podobną gęstość ładunku (-). Nałożona na żel mieszanina białek i peptydów migruje do anody w polu elektrycznym podłączonym do żelu. Migrację cząsteczek opóźnia spolimeryzowany żel. Stopień opóźnienia zależy od masy cząsteczkowej białek. W tym samym czasie małe cząsteczki przebędą dalszą drogę, a duże krótszą.

Chromatografia powinowactwa

Wykorzystuje powinowactwo białek do specyficznych grup chemicznych. Izolacja czynników transkrypcyjnych dzięki zdolności wiązania tych białek do wiązania specyficznych sekwencji DNA. Izolacja białek otrzymywanych na drodze ekspresji klonowanych genów. (etykietka His + kolumna niklowa).

Wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa HPLC

Nośniki muszą być odporne na ściskanie (n. Krzemionkowe). W wysokim ciśnieniu do 5000 psi można zastosować szybki przepływ, czas<godz. HPLC wykorzystuje się np. W chromatografii jonowymiennej, w filtracji żelowej. Filtracja żelowa HPLC zapewnia bardzo dobrą rozdzielczość białek

Chromatografia oddziaływań hydrofobowych HIC

Jest wykorzystywana do separacji i oczyszczania makrocząsteczek białkowych. Białka adsorbują się na złożu dzięki występowaniu oddziaływań hydrofobowych fragmentów białka z silnie hydrofobowymi grupami ligandów trwale umocowanych na powierzchni nośnika pozbawionego ładunku elektrycznego.

Ogniskowanie izoelektryczne

Technika ta wykorzystuje różnice pi białek. Gdy mieszaninę białek podda się elektroforezie w gradiencie ph w żelu bez SDS, to każde białko będzie migrowało do momentu osiągnięcia pozycji, w której ph żelu jest równe pi białka. Po ogniskowaniu wycina się pasek żelu wzdłuż którego rozdzielano białko i wpolimeryzowuje się w górną część żelu zawierającego SDS. Przeprowadza się elektroforezę w kierunku prostopadłym do kierunku ogniskowania w celu uzyskania dwuwymiarowego obrazu plam.

Aktywność enzymów może być hamowana na wiele sposobów

-Inhibicja nieodwracalna (sarin- nerve gas, Ser w centrum aktywnym) tworzenie kowalencyjnych wiązań między określonymi grupami enzymu i inhibitora. Suicide inhibition. Inhibitory ciasno wiązane.

-Inhibicja odwracalna: współzawodnicza (analogi stanu przejściowego) i niewspółzawodnicza. Inhibitory odwracalne wiążą się z enzymami szybko i szybko dysocjują. Wiążą sią specyficznie z wysokim powinowactwem do enzymu

Mierząc obniżanie się szybkości początkowej reakcji wraz ze wzrostem stężenia inhibitora można wyznaczyć K_i (stała inhibicji)

Inhibicja kompetycyjna

Inhibitor wiąże się bezpośrednio do miejsca wiązania substratu lub na tyle blisko żeby zablokować to miejsce. Zatem inhibitor kompetycyjny musi mieć strukturalne podobieństwo do substratu, lub co więcej być analogiem stanu przejściowego reakcji. Zwiększenie stężenia substratu powoduje zmniejszenie inhibicji na skutek współzawodnictwa inhibitora i substratu o miejsce wiązania. W wyniku współzawodnictwa dwóch ligandów o to samo miejsce wiązania na cząsteczce enzymu zmniejsza się
proporcjia cząsteczek enzymu wiążących substrat i obserwuje się zmniejszenie v₀ szybkości początkowej reakcji. Inhibitor kompetycyjny „redukuje" stężenie
aktywnych cząsteczek enzymu. Pozostałe cząsteczki wolnego enzymu mogą tak samo efektywnie katalizować
reakcję jak pod nieobecność inhibitora. Dlatego inhibitor współzawodniczy powoduje obniżenie powinowactwa enzymu do substratu (wzrost k_mapp),
k_mapp= (1+[I]/K_i)ale nie zmienia V_max.
Enzym jest w pełni aktywny przy wystarczająco dużym stężeniu
substratu, gdy wszystkie miejsca aktywne są wypełnione substratem. Szybkość maksymalna reakcji jest niezmieniona, ale w obecności inhibitora dużo większe stężenie
substratu jest potrzebne do osiągnięcia danego ułamka V_max.

Inhibicja niekompetycyjna

Inhibitor tego typu wiąże się z enzymem w miejscu innym niż to wiążące substrat i hamuje reakcję przez jeden z wielu różnych mechanizmów. Inhibitor niewspółzawodniczy nie zmienia Km natomiast obniża V_max. Inhibitor obniża stężenie funkcjonalnego enzymu. Reszta enzymu zachowuje się jak bardziej rozcieńczony jego roztwór

Inhibicja akompetycyjna

Inhibitor akompetycyjny wiąże się w miejscu innym niż miejsce wiążące substrat, ale raczej do kompleksu enzym-substrat niż do wolnego enzymu.

Inhibicja mieszana

Jest wiele przykładów inhibitorów, które prezentują mieszaninę cech charakterystycznych dla wymienionych wcześniej 3 typów. Te inhibitory zmieniają zarówno V_max jak i K_M, ale na różny sposób, zależnie od ich oddziaływania z cząsteczką enzymu.

Inhibitory nieodwracalne, które kowalencyjnie wiążą się z enzymem pozwalają na badanie grup funkcyjnych enzymów istotnych dla katalizy. Inhibitory nieodwracalne to:

A) związki reagujące ze specyficznymi grupami,

B) reaktywne analogi substratów (znaczniki powinowactwa = affinity labels),
c) inhibitory wywołujące samobójstwo enzymu.

Reaktywne analogi substratów

Bardziej specyficzne w stosunku do centrum aktywnego są reaktywne analogi substratów, cząsteczki podobne do
substratów, kowalencyjnie wiążące się do reszt w centrum aktywnym enzymu.

Inhibitory wywołujące samobójstwo enzymu
(suicide inhibitors). Inhibitor wiąże się do enzymu jak substrat, co początkowo prowadzi do normalnego mechanizmu katalitycznego. Tworzy się aktywny intermedia, który hamuje enzym przez modyfikację kowalencyjną. Kowalencyjnie zmodyfikowana grupa enzymu jest aktywna katalitycznie, na co wskazuje fakt, że enzym uczestniczy we własnej nieodwracalnej inhibicji.

Penicylina blokuje ostatni etap biosyntezy ścian bakteryjnych, reakcję tworzenia wiązań poprzecznych między różnymi łańcuchami peptydoglikanu prowadzoną przez transpeptydazę glikopeptydową. Czteroczłonowy pierścień β-laktamowy penicyliny jest napięty, powoduje to jego siną reaktywność. W czasie wiązania do transpeptydazy reszta Ser w centrum aktywnym atakuje karbonylowy atom węgla pierścienia laktamowego tworząc pochodną penicyloiloseryny. Transpeptydaza katalizuje własną inaktywację, inhibitor powoduje samobójstwo enzymu.

Do badania inhibicji odwracalnej stosujemy równania typu Michaelisa-Menten wtedy gdy:

• Inhibitory wiążą się i są uwalniane z enzymu z prędkościami wysokimi w porównaniu z liczbą obrotów enzymu, oraz

• Stężenie wolnego inhibitora jest zasadniczo równe całkowitemu stężeniu inhibitora, co znaczy, że stęż. Kompleksu EI jest bardzo małe w porównaniu ze stęż. Inhibitora

Inhibitory ciasno związane wiążą się z enzymem z tak wysokim powinowactwem, że wiązanie inhibitora przez enzym w istotny sposób zmienia stężenie wolnego inhibitora. W sytuacji kiedy I_t~E_t a prędkość ustalenia równowagi między E,I i EI jest szybka

Wiele inhibitorów ciasno wiązanych ustanawia równowagę wiązania z inhibitorem w czasie łatwo mierzalnym. Powstawanie produktu w reakcji hamowanej inhibitorem powoli wiązanym nie przebiega liniowo. Jest ono raczej krzywoliniowe z powodu powolnego wiązania inhibitora. I_t>>E_t a prędkość ustalenia równowagi między E,I i EI jest powolna

Inhibitory ciasno powoli wiążące: I_t~E_t a prędkość ustalenia równowagi między E,I i EI jest powolna

Allosteryczna regulacja aktywności enzymów.

Kontrola aktywności enzymu za pomocą produktu. Z analizy kinematyki enzymatycznej wynika, że im wyższe stężenie substratu tym szybciej zachodzi reakcja. Odwrotnie, wysokie stężenie produktu, który także wiąże się z enzymem powoduje hamowanie przemiany substratu w produkt.

Kowalencyjne modyfikacje aktywności:

Fosforylacja, acetylacja, ubikwitynacja, karbonylacja, sulifzacja

• Fosforylacja i defosforylacja białek błonowych jest podstawą przekazywania sygnałów do wnętrza komórki i dalej do jądra. Fosforylowane są łańcuchy boczne seryny, treoniny, tyrozyny, histydyny

Aktywacja proteolityczna

• Specyficzna hydroliza jednego wiązania jest odpowiedzialna za aktywację chymotrypsyny.

• Enteropeptydaza daje początek aktywacji zymogenów trzustki, aktywując trypsynę, która następnie aktywuje inne zymogeny.

• Kaskada krzepnięcia krwi.

Hemoglobina wykorzystuje 90% swych możliwości przenoszenia tlenu, a mioglobina w podobnych warunkach tylko 7% potencjału. Cząsteczka hemoglobiny jest zbudowana z czterech łańcuchów polipeptydowych, a mioglobiny z jednego. Hemoglobina swoją efektywność zawdzięcza oddziaływaniom między łańcuchami, które powodują, że związanie tlenu w swoistym miejscu jednego łańcucha zwiększa prawdopodobieństwo, że pozostałe łańcuchy zwiążą tlen również. Takie zjawisko nosi nazwę kooperatywnego wiązania ligandów

Zdolność hemoglobiny i mioglobiny do wiązania tlenu zależy od hemu, grupy prostetycznej, zawierającej atom żelaza. Jon żelaza może tworzyć dwa dodatkowe wiązania po jednym z każdej płaszczyzny hemu.

Hemoglobina składa się z dwóch łańcuchów α i dwóch łańcuchów β. Białko funkcjonuje jako para dimerów αβ.

Efekt Bohra

Powinowactwo Hb do tlenu zmniejsza się wraz z obniżaniem ph z 7,4 do 7,2 czyli wzrasta wtedy jej zdolność do uwalniania tlenu.

Dwutlenek węgla (cząsteczka obojętna) przenika biernie przez błony komórkowe a także jest transportowany przez przenośniki błonowe do wnętrza komórek. Są dwa mechanizmy stymulacji uwalniania z hemoglobiny przez CO2. Zgodnie z pierwszym przy wysokich stężeniach CO2 dochodzi do obniżenia ph w erytrocytach. Z CO2 i H2O powstaje kwas węglowy. Dysocjuje on na HCO3- i H+ co prowadzi do obniżenia ph i stabilizacji stanu T hemoglobiny.

Wg drugiego mechanizmu bezpośrednie oddziaływanie chemiczne między CO2 i Hb stymuluje uwalnianie tlenu.

Stężenie inhibitora wymagane do osiągnięcia połowy całkowitej inhibicji to IC₅₀- Inhibitor Concentration giving 50% inhibition. Ten typ doświadczenia stosuje się do: badania wiązania ligandów do receptorów, śledzenia
procesów komórkowych po związaniu ligandów, wpływu różnych czynników na proliferacje i wzrost komórek.

---