5. TECHNIKA MROŻENIOWA
Technika mrożeniowa polega na utwardzeniu materiału biologicznego poprzez jego zamrożenie - można zatem materiał pokroić na odpowiednio cienkie skrawki bez uprzedniego zatopienia go w substancjach utwardzających i bez złożonej procedury przygotowawczej (odwadnianie, płyny poœrednie).
Technika mrożeniowa ma szereg istotnych zalet:
• jest krótkotrwała: przy maksymalnie uproszczonej procedurze czas od pobrania materiału do wykonania preparatu nadającego się do oglądania pod mikroskopem nie przekracza kilkunastu minut. Wykorzystuje się to np. przy œródoperacyjnych badaniach histopatologicznych;
• zachowuje w materiale biologicznym wszystkie składniki chemiczne - również lipidy, które ulegają wypłukaniu podczas zatapiania w parafinie, celoidynie czy niepolarnych żywicach;
• przebiega w niskiej temperaturze, która zapobiega denaturacji białek, zachowuje aktywnoœć enzymów wewnątrzkomórkowych i blokuje procesy autolityczne.
Dwie ostatnie zalety sprawiają, że technika mrożeniowa jest szeroko stosowana w histochemii i immunocytochemii.
5.1. Zamrażanie materiału
5.1.1. Fizyczne podstawy zamrażania materiału biologicznego
Jak wiadomo, przeciętnie ok. 70% masy materiału biologicznego stanowi woda, przy czym jej zawartoœć jest różna w zależnoœci od rodzaju tkanki (od 10% w koœci i zębinie do 85% w istocie szarej mózgu). Przemiana wody w lód zachodzi na drodze krystalizacji. Proces ten rozpoczyna się równoczeœnie w wielu oœrodkach krystalizacji i polega na stopniowym przyroœcie wielkoœci i masy tworzących się kryształów. Można sobie łatwo wyobrazić, że powstające i rosnące w komórkach kryształki lodu muszą uszkadzać strukturę komórek w tym większym stopniu, im większe będą rozmiary tych kryształków. W celu zachowania jak najmniej zmienionej struktury materiału biologicznego należałoby albo w ogóle wyeliminować proces krystalizacji wody, albo też stworzyć takie warunki, w których rozmiary tworzących się kryształów byłyby jak najmniejsze.
Istnieje zależnoœć pomiędzy liczbą oœrodków krystalizacji i wielkoœcią tworzących się kryształów lodu a temperaturą i szybkoœcią procesu zamrażania: największa liczba oœrodków krystalizacji i najmniejsze rozmiary kryształów powstają przy możliwie najszybszym zamrożeniu materiału do jak najniższej temperatury. W skrajnych przypadkach może nawet dojœć do tzw. witryfikacji wody, w której powstały lód ma strukturę amorficzną, a nie krystaliczną. Jest to zatem istotna przesłanka do wyboru sposobu zamrażania materiału biologicznego, który ma być poddany analizie mikroskopowej.
5.1.2. Zamrażanie w ciekłych gazach
Powyżej przedstawione warunki najlepiej spełnia zamrażanie materiału biologicznego w ciekłych gazach. Często używa się do tego celu ciekłego azotu (-196°C, 77°K), który jest stosunkowo tani i łatwo dostępny, natomiast posiada doœć istotną wadę: z uwagi na stosunkowo niskie przewodnictwo cieplne, przy zamrażaniu wytwarza się wokół tkanki warstwa pęcherzyków gazowego azotu, która stanowi izolację termiczną i opóŸnia proces zamrażania. Dlatego lepsze wyniki można uzyskać zamrażając materiał w ciekłych gazach o wyższym przewodnictwie cieplnym (freon, izopropan) oziębionych ciekłym azotem. Najdoskonalsze zachowanie struktury komórek obserwuje się po zamrożeniu materiału w ciekłym helu (-269°C, 4°K), jednak jego zastosowanie jest bardzo ograniczone z uwagi na niedostępnoœć i wysoki koszt.
Procedura zamrażania materiału biologicznego w ciekłym gazie z reguły polega na zanurzeniu stosunkowo niewielkiego fragmentu tkanki nałożonego na podstawkę z metalu o wysokim przewodnictwie cieplnym (miedŸ, aluminium) pod powierzchnię płynnego gazu. Zamrożenie materiału następuje w ułamku sekundy, jednak zazwyczaj należy go przetrzymać w gazie przez kilka-kilkanaœcie sekund w celu całkowitego wyrównania temperatury zamrażanej próbki i likwidacji wytworzonych w niej naprężeń wynikających ze strefowych różnic temperatury. Przy większych próbkach, naprężenia te mogą powodować pękanie zamrażanego materiału.
Przy zamrażaniu bardzo małych próbek za pomocą ciekłego helu (do celów mikroskopii elektronowej), próbką taką, osadzoną na odpowiednim uchwycie, uderza się o powierzchnię metalowej płytki oziębionej w ciekłym helu. Wbrew pozorom takie brutalne postępowanie nie powoduje zniszczenia próbki, lecz zapewnia najszybszy przebieg procesu jej zamrożenia i witryfikację zawartej w niej wody.
5.1.3. Zamrażanie przy pomocy zestalonego dwutlenku węgla
Zestalony CO2 ("suchy lód") ma temperaturę -78,5°C. Proces zamrażania jest tu wolniejszy niż w przypadku stosowania ciekłych gazów i odbywa się przez przyciœnięcie kawałka "suchego lodu" do metalowej podstawki, na której znajduje się materiał. W tych warunkach ciepło odprowadzane jest z tkanki poprzez metal podstawki, a pełne zamrożenie materiału osiąga się po upływie kilkunastu do kilkudziesięciu sekund. Struktura tak zamrożonego materiału nadaje się do oglądania pod małymi i œrednimi powiększeniami mikroskopu œwietlnego - przy dużych powiększeniach można już dostrzec uszkodzenia spowodowane krystalizacją wody.
5.1.4. Zamrażanie w kriostacie
Nowoczesne kriostaty (p. str. 69) są wyposażone w listwę metalową chłodzoną do -20°C - -60°C i posiadającą otwory, w które można włożyć stoliki z umieszczonym na nich materiałem. Dzięki znacznemu przewodnictwu cieplnemu metalu stolika, materiał ulega zamrożeniu z szybkoœcią porównywalną do zamrażania przy użyciu zestalonego dwutlenku węgla.
5.1.5. Zamrażanie w mikrotomie mrożeniowym
Metoda ta została opisana na str. 68.
5.1.6. Krioprotekcja
Niekorzystne zjawisko uszkadzania struktury komórek przez kryształki lodu można wyeliminować przez uprzednie przepojenie tkanki substancją, której wodny roztwór w temperaturze krzepnięcia nie tworzy kryształów, lecz ulega żelifikacji. Postępowanie takie nosi nazwę krioprotekcji. Najpopularniejszymi metodami krioprotekcji jest przepojenie tkanki 15-30% roztworem sacharozy, 10-30% roztworem poliwinylopyrolidonu, 10-30% roztworem glicerolu lub 10% roztworem dwumetylosulfotlenku (DMSO).
Krioprotekcję stosuje się przede wszystkim przy zamrażaniu materiału do celów mikroskopii elektronowej: przed przygotowaniem ultracienkich skrawków mrożeniowych (p. dalej) lub preparatów wykonywanych metodą mrożenia i łamania (p. rozdz. 4.8.4). Jest również zalecana przy wolnym zamrażaniu do mikroskopii œwietlnej (przy użyciu zestalonego CO2 lub w kriostacie).
5.2. Przechowywanie zamrożonego materiału
Zamrożony materiał można przed skrojeniem przechować przez okres kilku tygodni pod warunkiem umieszczenia go w hermetycznym pojemniku (aby zapobiec wysychaniu) w temperaturze ok. -80°C. Jeszcze doskonalsze warunki stwarza przechowywanie materiału w ciekłym azocie, gdzie zachowuje swe własnoœci nawet przez kilka lat.
5.3. Krojenie skrawków z zamrożonego matriału
W technice mrożeniowej krojenie skrawków musi naturalnie odbywać się również w obniżonej temperaturze i dlatego niezbędne są do tego celu specjalne rodzaje mikrotomów.
5.3.1. Mikrotom mrożeniowy
Skrawanie na mikrotomie mrożeniowym jest najprostszą, lecz zarazem najbardziej niedoskonałą metodą krojenia zamrożonego materiału. Mikrotom mrożeniowy jest przyrządem, w którym dokonuje się zarówno zamrożenie, jak i pokrojenie materiału. Stolik przedmiotowy wykonany ze stali lub miedzi posiada wewnątrz system promienistych kanałów otwierających się na jego obwodzie. Z drugiej strony kanały te zbiegają się w jeden przewód zaopatrzony w zawór i podłączony do butli ze sprężonym dwutlenkiem węgla. Elementem ruchomym jest tu nóż, poruszający się po wycinku koła.
Otwarcie zaworu powoduje wydostawanie się gazu pod znacznym ciœnieniem przez otwory w stoliku przedmiotowym. Gwałtownie rozprężający się gaz oziębia stolik, co wywołuje zamrożenie (stosunkowo wolne) znajdującego się na nim materiału. Podczas skrawania następuje natychmiastowe rozmrożenie skrawków (nóż zazwyczaj nie jest chłodzony), które następnie przenosi się pojedynczo do naczyń z roztworami barwników, płucze, nakłada na szkiełka podstawowe i zamyka w œrodowisku rozpuszczalnym w wodzie (np. w żelu glicerolowym).
Gruboœć skrawków uzyskiwanych przy użyciu mikrotomu mrożeniowego wynosi 10-15 m. Niedoskonały sposób zamrażania, rozmrożenie podczas krojenia, a następnie manipulacja pojedynczymi skrawkami - wszystko to sprawia, że preparaty z mikrotomu mrożeniowego - o ile nie zostały poddane krioprotekcji - narażone są na znaczne uszkodzenia struktury komórek i tkanek. Niemniej jednak mikrotomów mrożeniowych używa się nadal - ze względu na prostotę obsługi - w laboratoriach wykonujących rutynowo duże iloœci preparatów mrożeniowych oraz w małych przyszpitalnych pracowniach histopatologicznych.
5.3.2. Kriostat
Kriostat jest najlepszym przyrządem krojącym skrawki mrożeniowe do celów mikroskopii œwietlnej. Można na nim uzyskiwać skrawki o gruboœci 4-10 m.
Kriostat składa się z komory chłodniczej oraz ze znajdującego się w niej mikrotomu. Komora oziębiana jest za pomocą sprężarkowego agregatu chłodniczego, zbliżonego do powszechnie stosowanych w lodówkach i zamrażarkach, ale o większej wydajnoœci. Termoregulator pozwala na dowolne ustawienie temperatury w komorze, w przedziale od 0 do -40°C. Mikrotom jest zazwyczaj nieco zmodyfikowanym mikrotomem rotacyjnym, którego elementy sterujące (napęd, regulacja gruboœci skrawków, regulacja odległoœci noża od materiału, itp.) zostały wyprowadzone na zewnątrz i umieszczone na obudowie komory. W bardziej udoskonalonych typach kriostatów nóż i stolik przedmiotowy są dodatkowo chłodzone (z możliwoœcią regulacji temperatury), a mikrotom ma napęd elektryczny.
Optymalna temperatura krojenia zależy od rodzaju materiału. Zbyt wysoka temperatura krojenia prowadzi do plastycznych odkształceń skrawków, natomiast przy temperaturze zbyt niskiej materiał jest kruchy i może się łamać podczas skrawania. Dla większoœci tkanek optymalna temperatura krojenia mieœci się w zakresie od -15 do -25°C.
Pojedyncze skrawki mrożeniowe mają tendencję do zwijania się podczas krojenia. Zapobiega temu przeŸroczysta płytka pokryta teflonem, która przylega do czołowej płaszczyzny noża pozostawiając niewielką szczelinę, w którą wsuwa się krojony skrawek (ryc. 5.1). Skrawki zbiera się z noża przez przyłożenie do nich szkiełka podstawowego lub nakrywkowego. Skrawek przylega do szkła i ulega natychmiast rozmrożeniu. Z uwagi na niewielką gruboœć, szybko wysycha (ok. minuty w temperaturze pokojowej), co zapobiega rozwinięciu się zmian autolitycznych w materiałach nie utrwalonych. Wysuszone skrawki nadają się zarówno do przechowywania (w szczelnie zamkniętym pojemniku, w lodówce), jak i do dalszej procedury (barwienie, reakcje histochemiczne).
5.3.3. Ultrakriomikrotom
Jest to przyrząd służący do skrawania ultracienkich (50-100 nm) skrawków mrożeniowych do badań w mikroskopie elektronowym. Skrawanie odbywa się w temperaturze ok. -80° - -100°C.
Ultrakriomikrotom jest zmodyfikowanym ultramikrotomem. Częœć krojąca (ramię wraz ze stolikiem przedmiotowym, nóż i jego umocowanie) znajdują się w niewielkiej, zamkniętej komorze, której temperatura regulowana jest zazwyczaj dozowanym dopływem ciekłego azotu znajdującego się w odrębnym pojemniku. Elektronicznie sterowane układy regulacyjnie pozwalają na niezależne od siebie ustawianie pożądanej temperatury komory, noża oraz stolika ze skrawanym bloczkiem.
Do krojenia służą noże szklane napylone warstewką wolframu lub noże diamentowe. Skrawki zbiera się bezpoœrednio z powierzchni noża za pomocą platynowej pętli o œrednicy 1-2 mm, wypełnionej roztworem sacharozy w buforowanej soli fizjologicznej. Na powierzchni tej kropli skrawki ulegają rozmrożeniu i rozprostowaniu; przenosi się je na siatki pokryte błonką formvarową, niekiedy dodatkowo napyloną warstewką węgla (skrawki mrożeniowe są bardzo delikatne, bez podtrzymującej je błonki uległyby zniszczeniu pod wpływem strumienia elektronów).
Po skontrastowaniu lub przeprowadzeniu ewentualnych dodatkowych reakcji cyto- lub immunocytochemicznych, skrawki na siatce pokrywa się warstewką metylocelulozy, która zapobiega ich deformacji. Z tego samego powodu podczas całej procedury nie wolno dopuœcić do wyschnięcia skrawków.
Technika mrożeniowa na poziomie mikroskopu elektronowego stosowana jest raczej rzadko. Pozwala ona na uniknięcie artefaktów związanych z konwencjonalnym zatapianiem, umożliwia także wykonanie na skrawkach niektórych reakcji histochemicznych i immunocytochemicznych nieosiągalnych w przypadku materiału zatopionego w żywicach.
5.4. Mrożenie z substytucją (podstawianiem)
Jest to metoda przygotowania materiału do zatapiania w parafinie lub żywicach, pozwalająca na zachowanie - dzięki wstępnemu zamrożeniu - składników materiału rozpuszczalnych w œrodowisku wodnym. Zamrożony materiał zanurza się w alkoholu lub acetonie oziębionym do -60°C. W ciągu kilku dni następuje wymiana lodu zawartego w tkance na użyty rozpuszczalnik, który równoczeœnie utrwala materiał. Dalsze etapy procedury (przepajanie płynami poœrednimi i zatapianie) odbywają się już w temperaturze pokojowej, ale w bezwodnym œrodowisku. Pozwala to na wykrywanie takich związków jak fosforany, ATP i glikogen; metoda ta nie powoduje również denaturacji białek i zachowuje aktywnoœć enzymatyczną (najlepiej, gdy proces zatapiania przeprowadza się w niskich temperaturach). Mrożeniu z substytucją można także poddawać skrawki kriostatowe - uzyskuje się wówczas znacznie lepsze zachowanie aktywnoœci enzymów niż w przypadku skrawków suszonych bezpoœrednio po skrojeniu.
5.5. Liofilizacja
Liofilizacja jest to proces suszenia zamrożonego materiału biologicznego w próżni oraz w obniżonej temperaturze. Przeprowadza się ją w specjalnych urządzeniach (liofilizatorach).
5.5.1. Fizyczne podstawy procesu liofilizacji
W trakcie normalnego suszenia materiału biologicznego zawarta w nim woda przechodzi stopniowo w parę wodną, która ulatnia się z powierzchni materiału. W tym procesie wytwarza się granica fazy wodnej i gazowej, w obrębie której działają siły napięcia powierzchniowego, powodujące przesunięcia i zniekształcenia mikroskopowej struktury materiału. Z tej właœnie przyczyny nie stosuje się suszenia w procesie przygotowania tkanek do badań mikroskopowych.
Wytworzenie wokół materiału œrodowiska charakteryzującego się znacznie obniżonym ciœnieniem (<10-3 Torr) oraz temperaturą niższą od temperatury krzepnięcia wody w tych warunkach powoduje, iż suszenie tkanki zachodzi na drodze sublimacji wody, tzn. jej przejœcia bezpoœrednio ze stanu stałego w stan gazowy, z pominięciem fazy ciekłej. Zapobiega to występowaniu sił napięcia powierzchniowego i w konsekwencji zniekształceniom strukturalnym tkanki. Powstała w trakcie sublimacji para wodna usuwana jest bezpoœrednio przez pompę próżniową lub też zostaje wychwycona przez dodatkowy higroskopijny pochłaniacz.
5.5.2. Przebieg procesu liofilizacji
Po zamrożeniu tkanki umieszcza się ją w uprzednio wychłodzonej komorze liofilizatora, a następnie wytwarza się w komorze próżnię (im niższe ciœnienie, tym szybszy proces liofilizacji). Ustalono, że najkorzystniejsza temperatura liofilizacji dla fragmentów tkankowych mieœci się w przedziale od -30°C do -40°C. Przy niższych temperaturach proces zachodzi zbyt wolno, a przy wyższych istnieje niebezpieczeństwo uszkodzenia struktury tkanki na skutek rekrystalizacji lodu.
We wstępnym okresie procesu liofilizacji sublimuje woda znajdująca się w obwodowych rejonach tkanki. Wytwarza się w ten sposób "sucha otoczka" będąca izolatorem cieplnym i opóŸniająca proces sublimacji wody znajdującej się w głębszych partiach materiału. Na tym etapie liofilizacji konieczne jest wtórne ogrzanie tkanki, które przyspieszy sublimację, inaczej bowiem cały proces trwałby zbyt długo. W tym celu komora liofilizacyjna wyposażona jest w termoelektryczny element grzewczy, umieszczony w pewnej odległoœci od materiału i emitujący promieniowanie cieplne. Takie ogrzewanie nie powoduje przechodzenia lodu zawartego w tkance w wodę, gdyż między elementem grzewczym a zamrożoną tkanką wytwarza się gradient temperatury (ryc. 5.2), pozwala natomiast na skrócenie czasu liofilizacji. Zakończenie procesu liofilizacji sygnalizuje wyraŸny spadek ciœnienia w komorze, spowodowany brakiem ulatniającej się z materiału pary wodnej.
Liofilizowana tkanka zachowuje swą strukturę mikroskopową i skład chemiczny z tym, że wszystkie przestrzenie normalnie zajęte przez wodę są puste i mogą być następnie wypełnione materiałem zatapiającym.
Liofilizatory tkankowe używane do przygotowania materiału biologicznego do badań mikroskopowych (a także innych, np. biochemicznych) charakteryzują się niewielkimi rozmiarami, w przciwieństwie do urządzeń liofilizujących np. produkty spożywcze.
5.5.3. Przygotowanie materiału liofilizowanego do badań mikroskopowych
Po zakończeniu procesu liofilizacji i stopniowym doprowadzeniu do normalnych wartoœci temperatury i ciœnienia w komorze liofilizacyjnej, materiał można z niej wyjąć i przechowywać w suchym otoczeniu (nie jest zbyt higroskopijny). Wbrew utartemu przekonaniu, liofilizacja nie jest sposobem utrwalania, a zatem wysuszony materiał należy utrwalić. Stosuje się w tym celu utrwalacze w postaci par, które z łatwoœcią przenikają przez liofilizowaną, a więc "porowatą" tkankę. Najczęœciej liofilizowany materiał utrwala się w parach formaldehydu, w podwyższonej temperaturze (50-80°C).
Po utrwaleniu materiał można bezpoœrednio zatopić, np. w parafinie, bez uprzedniego odwadniania i przepajania płynami poœrednimi. Aby doprowadzić do należytego przepojenia liofilizowanej tkanki parafiną lub innym œrodowiskiem zatapiającym, proces zatapiania należy przeprowadzić w podciœnieniu (rzędu 0,1 Torr).
5.5.4. Zastosowanie liofilizacji
W przypadku materiału, który ma zostać pokrojony na skrawki, technika liofilizacji ma dwie istotne zalety:
• unika się utrwalania w płynach, które powoduje powstanie tzw. artefaktów prądowych (spychanie organelli i wtrętów wewnątrzkomórkowych do jednego bieguna komórki w wyniku "prądu" utrwalacza dyfundującego przez komórkę w okreœlonym kierunku;
• liofilizacja zachowuje w tkankach wszystkie wysokocząsteczkowe substancje chemiczne.
Z uwagi na powyższe zalety, liofilizacja znajduje zastosowanie w badaniach histochemicznych, stanowiąc metodę z wyboru przy wykrywaniu amin biogennych (p. rozdz. 6.7).
Liofilizację stosuje się także w procedurach nie związanych z koniecznoœcią póŸniejszego pokrojenia materiału: poddaje się jej ultracienkie skrawki mrożeniowe oraz odlewy mikrokorozyjne (p. rozdz. 4.9.2).
Podpisy pod ilustracje
Ryc. 5.1. Zasada działania płytki zapobiegającej zwijaniu i fałdowaniu się skrawków w kriostacie
Ryc. 5.2. Gradient temperatury wytwarzający się podczas ogrzewania materiału w trakcie liofilizacji