Wojciech Budzyk
Piotr Hotloś
Agnieszka Kubacka
Sylwia Majka
gr. A
SPRAWOZDANIE
Metody oznaczania białek
Istnieje wiele metod pozwalających na mierzenie poziomu stężenia białek. Większość z nich opiera się na specyficznych właściwościach białek, można je rozpatrywać z punktu ich korzyści i wad. Efekt stosowania tych metod bywa różny, stąd powinniśmy poświęcić chwilę czasu na analizę, po to by wybrać tą najwłaściwszą.
Reakcja biuretowa
W roztworze zasadowym białka redukują jony miedzi. Uwidacznia się to poprzez niebieską barwę roztworu. Reakcję tą przeprowadza się najczęściej w obecności glikolu polietylenowego. Minusem tej metody jest to, że powinniśmy ją stosować głównie do roztworów, w których mamy dużą ilość białka, ponieważ nie jest zbyt czuła. Poza tym TRIS może zafałszowywać wynik tej reakcji. Inną, mniej znaną modyfikacją tej metody jest micro-biuret assay.
Metoda Bradforda
Metoda ta jest obecnie stosowana coraz częściej, głównie ze względu na prostotę oraz wysoką czułość. Coomasie Blue rozpuszczony w roztworze o pH poniżej 1 ma kolor czerwono-brązowy. Kiedy jednak wiąże się z białkiem uzyskuje kolor niebieski. Ilość białka może być dzięki temu mierzona przy długości fali 595 nm. Coomasie Blue w znacznej mierze przyłącza się do zasadowych, aromatycznych aminokwasów. Białka zawierają różną ich ilość, stąd wskazane jest utworzenie krzywej standardowej dla każdego badanego białka. Wadą tej metody jest to, że reagenty pozostają na szkle oraz plastikach laboratoryjnych. Można je stamtąd usunąć za pomocą SDS.
Metoda Lowry'ego
Metoda ta jest modyfikacją metody biuretowej. Podobnie jak w metodzie biuretowej tworzą się tutaj kompleksy miedziowo-białkowe. Jony miedziowe są następnie redukowane reagentem Folin-Ciocalteu, powodując powstanie intensywnej niebieskiej barwy. W porównaniu z metoda biuretową ta jest dużo bardziej czuła oraz powoduje zużycie znacznie mniejszej ilości próbki. Metoda ta jest jednak dużo bardziej skomplikowana.
Absorbancja w UV
Absorbancja jest najprostszą metodą do mierzenia koncentracji białka w roztworze. Białka absorbują najlepiej przy długości fali - 280 nm. Dzieje się tak z powodu zawartości aromatycznych aminokwasów, takich jak tryptofan czy tyrozyna. Natomiast przy 185 nm znajduje się szczyt absorbancji białek, który wynika z obecności wiązań peptydowych. Ekstynkcja białek przy 280 nm jest różna z powodu różnej zawartości aminokwasów aromatycznych, natomiast poniżej 220 nm w przypadku obecności różnych białek nie pozwala na ich rozróżnienie. Poza tym trudno jest zmierzyć absorbancję białka w obszarze około 185 nm ponieważ rózne formy tlenu również absorbują na tym obszarze. Współczynniki ekstynkcji białek są różne, zatem absorbancję w UV należy raczej traktować jako metodę jakościową, oczywiście z wyjątkiem oczyszczonych już białek, dla których współczynniki ekstynkcji są już znane. Jedną z wad tej metody jest to, że wiele innych związków chemicznych obecnych w próbce powoduje zafałszowanie wyników. Dzieje się tak np. w przypadku kwasów nukleinowych. Wprawdzie maksimum absorpcji tych związków znajduje się przy 260 nm, ale po części również zafałszowują wynik przy 280 nm.
Metoda z kwasem bicinchoninowym
Metoda ta jest kolejną modyfikacją reakcji biuretowej. Kwas bicinchoninowy tworzy z jonami miedziowymi stabilny kompleks, który maksimum absorbancji posiada przy 562 nm. Metoda ta jest czulsza od metody biuretowej i metody Lowr'ego oraz mniej wrażliwa na warunki zewnętrzne. Podobnie jak pozostałe metody oparte na reakcji biuretowej metoda ta wrażliwa jest na obecność związków redukujących np. kwasu askorbinowego.