Wyodrębnianie i charakterystyka skrobi z bulw ziemniaka

Wyodrębnianie skrobi

1. Obranego i pokrojonego ziemniaka (104,7 g) zhomogenizowano w mikserze z 600 ml 1 % roztworu NaCl. Homogenat przesączono przez gazę, a pozostałość powtórnie zhomogenizowano w 100 ml 1 % roztworu NaCl i przesączono. Połączone przesącze przeniesiono do cylindra miarowego i pozostawiono w lodówce na 30 minut, a następnie zdekantowano i odrzucono płyn znad osadu.

Podczas homogenizacji dochodzi do rozbicia komórek i uwolnienia z nich amyloplastów, czyli organelli odpowiedzialnych za magazynowanie skrobi. Roztwór do homogenizacji był izotoniczny w stosunku do amyloplastów, dzięki czemu nie uległy one uszkodzeniu i osadziły się na dnie cylindra.

2. Osad przemyto trzykrotnie porcjami po 300 ml 1 % roztworu NaCl, jednokrotnie 300 ml 0,01 M NaOH, a na końcu trzykrotnie porcjami po 500 ml zimnej wody destylowanej, każdorazowo mieszając i dekantując roztwór znad osadu.

Pod wpływem 0,01 M NaOH błony amyloplastów ulegają rozerwaniu, w skutek czego znajdująca się w amyloplastach skrobia zostaje uwolniona do środowiska.

3. Otrzymaną wilgotną skrobię zważono.

Uzyskano 6,90 g wilgotnej skrobi.

Rozdział skrobi na amylozę i amylopektynę

1. Do 330 ml 0,157 M NaOH dodano 2 g wilgotnej skrobi zawieszonej w 26 ml wody destylowanej. Mieszaninę podgrzewano w łaźni wodnej o temperaturze 60^oC, delikatnie mieszając, aż roztwór stał się klarowny, a na ściankach naczynia nie były widoczne ziarna skrobi. Do mieszaniny dodano 94 ml 5 % roztworu NaCl, a następnie całość zobojętniono 1 M HCl do pH ok. 7 i pozostawiono na noc w ciemności, w temperaturze pokojowej.

W 0,157 M roztworze NaOH, w temperaturze 60^oC, amyloza i amylopektyna osiągają maksymalną rozpuszczalność (tworzą roztwory koloidalne). Zmiana siły jonowej (dodatek 5 % roztworu NaCl) powoduje, że część cząsteczek wody, które tworzyły otoczkę hydratacyjną amylopektyny zaczyna hydratować jony Na⁺ i Cl^-, co prowadzi do spadku rozpuszczalności amylopektyny i jej wypadnięcia z roztworu w postaci żelu. Amyloza natomiast w dalszym ciągu tworzy roztwór koloidalny.

2. Roztwór amylozy odciągnięto pipetą znad żelu amylopektyny i zachowano. Objętość żelu amylopektyny zmierzono.

Objętość żelu amylopektyny wyniosła 102 ml.

3. 80 ml żelu amylopektyny odwirowano przez 10 minut przy 6000 obr./min. Supernatant odrzucono, natomiast osad zawieszono w 100 ml 1 % NaCl i ponownie odwirowano. Osad amylopektyny zawieszono w 20 ml wody destylowanej. 2 ml zawiesiny wysuszono i zważono.

Masa 2 ml zawiesiny amylopektyny - jak się później okazało niecałkowicie dosuszonej - wyniosła 139 mg. Po dosuszeniu masa 2 ml zawiesiny amylopektyny wyniosła 36,6 mg.

Oczyszczanie amylozy

1. Do roztworu amylozy dodano 70 ml n-butanolu, zamieszano i pozostawiono w lodówce na 2 tygodnie.

Dodatek rozpuszczalnika o mniejszej polarności niż woda, jakim jest n-butanol, prowadzi do osłabienia oddziaływań amylozy z rozpuszczalnikiem, w skutek czego spada jej rozpuszczalność i wypada ona z roztworu.

2. Całość odwirowano przez 5 minut przy 3000 obr./min., supernatant odrzucono a osad zawieszono w 100 ml wody nasyconej butanolem, ponownie odwirowano i odrzucono supernatant. Osad amylozy zawieszono w 20 ml wody destylowanej. 2 ml zawiesiny wysuszono i zważono.

Masa 2 ml zawiesiny amylozy po wysuszeniu wyniosła 15,2 mg.

Oznaczanie liczby jodowej amylopektyny i amylozy

1. Do kolb miarowych na 50 ml dodano:

• do pierwszej: 72 μl roztworu amylopektyny (5 mg amylopektyny według pierwszego pomiaru masy; jak się okazało po dosuszeniu preparatu i ponownym jego zważeniu, stanowiło to 1,32 mg amylopektyny), 0,5 ml wody destylowanej i 0,5 ml 1 M NaOH

• do drugiej: 100 μl wodnego roztworu amylozy (0,76 mg amylozy), 0,9 ml wody destylowanej i 0,5 ml 1 M NaOH

• do trzeciej: 1 ml wody destylowanej i 0,5 ml 1 M NaOH

Kolby ogrzewano przez 3 minuty we wrzącej łaźni wodnej.

Ogrzewanie amylozy i amylopektyny w roztworze NaOH zwiększa ich rozpuszczalność, ale jednocześnie niszczy (odwracalnie) ich strukturę przestrzenną.

2. Po oziębieniu dodano 0,5 ml 1 M HCl, 0,2 g kwaśnego winianu potasu, 40 ml wody destylowanej oraz 0,5 ml odczynnika skrobiowego. Uzupełniono wodą do 50 ml, wymieszano i pozostawiono w temperaturze pokojowej w ciemności przez 20 minut.

Przywrócenie neutralnego pH i obniżenie temperatury powodują odtworzenie struktury przestrzennej amylozy i amylopektyny, co umożliwia wiązanie przez nie cząsteczek jodu. Kompleks amylozy z jodem ma barwę niebieską, natomiast kompleks amylopektyny z jodem - barwę fioletową.

3. Zmierzono absorbancję prób pierwszej i drugiej przy długości fali 680 nm wobec próby trzeciej (próba ślepa).

Absorbancja próby pierwszej (amylopektyna) wyniosła 0,03, natomiast próby drugiej (amyloza) - 0,325.

4. Obliczono liczbę jodową (L. J.) dla amylopektyny i amylozy wedlug wzoru:

L. J.= A x 4 / C , gdzie C - zawartość węglowodanu w próbie w mg/100 ml

A - absorbancja próby przy długości fali 680 nm

Liczba jodowa dla amylopektyny wyniosła:

0,03 x 4 / 2,6352 = 0,046

Liczba jodowa dla amylozy wyniosła:

0,325 x 4 / 1,52 = 0,86

Liczba jodowa dla amylozy jest ok. 19 razy większa niż liczba jodowa dla amylopektyny. Wynika z tego, że amyloza wiąże ok. 19 razy więcej cząsteczek jodu niż amylopektyna.

Za wiązanie cząsteczek jodu odpowiedzialne są struktury helikalne. Obecne są one zarówno w strukturze przestrzennej amylozy, jak i amylopektyny, natomiast jest ich więcej w przypadku amylozy, dlatego wiąże ona więcej cząsteczk jodu niż amylopektyna.

Określenie składu jakościowego skrobi

1. Do 5 mg mokrej skrobi dodano 0,5 ml 2 M HCl, całość umieszczono na 2 h we wrzącej łaźni wodnej. Po wyjęciu oziębiono i dodano 0,5 ml wody destylowanej.

2. Przeprowadzono dejonizację hydrolizatu na jonicie Dowex 2 w formie OH^-.

3. Przeprowadzono chromatografię podziałową na płytce celulozowej. Na płytkę nałożono:

ścieżka 1 - 0,9 % roztwór wzorcowy glukozy

ścieżka 2 - 0,9 % roztwór wzorcowy galaktozy

ścieżka 3 - 0,7 % roztwór wzorcowy ksylozy

ścieżka 4 - 2,0 % roztwór wzorcowy fruktozy

ścieżka 5 - 2,0 % roztwór wzorcowy ramnozy

ścieżka 6 - 0,9 % roztwór wzorcowy kwasu galakturonowego

ścieżka 7 - zdejonizowany hydrolizat skrobi

Płytkę rozwijano przez noc w układzie rozpuszczalników butanol : toluen : pirydyna : woda (5:1:3:3, v/v).

4. Wysuszoną płytkę wywołano poprzez spryskanie jej roztworem azotanu srebra w acetonie, a następnie roztworem NaOH w metanolu i dla odbarwienia tła roztworem tiosiarczanu sodu.

Znajdujące się na płytce jednocukry w warunkach alkalicznych redukują jony srebra Ag⁺ do metalicznego srebra, które wytrąca się w miejscu w którym obecne są na płytce cukry.

5. Obliczono wartości współczynnika Rf dla plam z poszczególnych ścieżek płytki.

Rf

ścieżka 1 0,24 glukoza

ścieżka 2 0,19 galaktoza

ścieżka 3 0,35 ksyloza

ścieżka 4 0,27 fruktoza

ścieżka 5 0,46 ramnoza

ścieżka 6 0,05 kwas galakturonowy

ścieżka 7 0,24 hydrolizat skrobi

Wartość Rf dla cukru powstałego w wyniku hydrolizy skrobi była równa wartości Rf dla wzorca glukozy, tak jak się spodziewano, jako że skrobia zbudowana jest wyłącznie z reszt glukozy.

Małgorzata Janczrska, Paulina Turcza

---