Anna Dylewska
Maja Ciepielska
Łukasz Sokołowski
Otrzymywanie steroli z zielonych części roślin.
Celem ćwiczenia było otrzymanie steroli z zielonych części szpinaku, ich składu jakościowego i ilościowego otrzymanych frakcji.
Steroidy - organiczne związki chemiczne, lipidy, których wspólną cechą jest występowanie w ich cząsteczkach szkieletu węglowego w formie czterech sprzężonych pierścieni, czyli steranu. Jedną z grup steroidów są sterole - organiczne związki chemiczne, alkohole, które powstają poprzez formalne podstawienie atomu węgla w pozycji 3 w szkielecie steroidu przez grupę hydroksylową. Syntetyzowane są z acetylo-CoA. Sterole roślinne - fitosterole - są składnikami błon komórek roślinnych.
Spożycie fitosteroli wpływa korzystnie na tzw. profil lipidów, powodując zmniejszenie ilości "złego cholesterolu" (frakcja LDL) we krwi.
Pierwszym etapem ćwiczenia była ekstrakcja. Pocięte liście mrożonego szpinaku zalaliśmy metanolem i homogenizowaliśmy. Metanol jest rozpuszczalnikiem o niskiej polarności i dobrze miesza się z wodą, co jest bardzo ważne w przypadku naszego materiału, który jest wilgotny. Także lipidy dobrze się w nim rozpuszczają. Całość ogrzewaliśmy w kolbie okrągłodennej, następnie oddzielaliśmy przesącz od osadu na lejku Buchnera. Przesącz zachowaliśmy, osad natomiast przenieśliśmy ponownie do kolby zalaliśmy tym razem mieszaniną rozpuszczalników chloroformu i metanolu w proporcji 2:1 i ogrzewaliśmy ponownie. Taki układ rozpuszczalników pozwolił nam wyekstrahować związki o niższej polarności. Następnie znów oddzielamy przesącz od osadu. I powtarzamy czynności z osadem raz jeszcze. Po ostatnim przesączaniu, osad odrzucamy.
Połączone przesącze zagęściliśmy do sucha na wyparce obrotowej, pozbywając się rozpuszczalników. Suchą pozostałość zalaliśmy mieszaniną butanolu z wodą i przenieśliśmy do rozdzielacza i przepłukaliśmy kilkukrotnie wodą nasyconą butanolem. W ten sposób pozbywaliśmy się nielipidowych związków polarnych (aminokwasów, cukrów, prostych związków fenolowych), które rozpuszczają się we frakcji wodnej. We frakcji butanolowej pozostają lipidy oraz związki o niższej polarności.
Kolejnym etapem była chromatografia kolumnowa, w której absorbentem był żel krzemionkowy. Surową frakcję lipidową rozpuściliśmy w małej objętości mieszaniny chloroform: metanol (99:1) i nanieśliśmy na kolumnę i rozwijaliśmy przy pomocy gradientu skokowego: używając najpierw 220 ml mieszaniny chloroformu z metanolem w proporcji 99:1 - niska siła elucyjna (otrzymujemy frakcję I), potem 130 ml mieszaniny chloroform metanol w proporcji 8:2 - wyższa siła elucyjna do związków o wyższej polarności, które są silniej absorbowane na złożu (otrzymujemy frakcję II). Obie frakcje zostały zatężone do sucha.
Wydajność na tym etapie wyszła nam wyższa od podanej w skrypcie:
Frakcja I - próba 12.8027 - tara 12.64 = 162 mg
Frakcja II - próba 13. 079 - tara 12.9 = 179 mg
Kolejnym etapem była hydroliza: zasadowa frakcji I - powinno nastąpić uwolnienie wiązania estrowego - w tej frakcji jak wiemy powinny znajdować się obok steroli w stanie wolnym, estry steroli. Kwasowa hydroliza frakcji II do wiązań glikozydowych - w tej frakcji powinny znajdować się sterole w postaci glukozydów i acyloglukozydów. Następnie do frakcji po hydrolizie dodajemy wody destylowanej i ekstrahujemy eterem etylowym. Eter etylowy nie miesza się z wodą, miesza się z rozpuszczalnikami organicznymi, dzięki niemu oczyszczamy frakcje z rozpuszczalnika i nierozpuszczalnych h soli, które pozostają w wodzie. Ekstrakty eterowe płykaliśmy wodą, by doprowadzić frakcję do pH obojętnego, by inne zbyt kwaśne lub zasadowe pH nie utrudniało chromatografii cienkowarstwowej, która była kolejnym etapem ćwiczenia.
Preparatywna chromatografia cienkowarstwowa- za pomocą tej metody nie możemy rozdzielić substancji różniących się tylko masą cząsteczkową, ale możemy rozdzielić substancje biorąc pod uwagę rodzaj grup funkcyjnych. Opłukane ekstrakty eterowe, zatężone do sucha i następnie rozpuszczone w niewielkiej ilości chloroformu nakładaliśmy ilościowo na płytkę z żelem krzemionkowym (wykonaliśmy płytkę, poprzez dokładne odtłuszczenie jej watą zwilżoną acetonem, a następnie zalanie zawiesiną żelu krzemionkowego i aktywowanie płytki w temp 120 stopni przez 30 min). Na brzegu płytki nałożyliśmy wzorzec cholesterolu. Płytkę rozwijaliśmy w układzie chloroform: metanol (95:5) - sterole są związkami wysokopolarnymi w związku z czym silnie absorbują się do złoża. Żel krzemionkowy wykazuje polarność, więc faza ruchoma rozpuszczalników nie powinnam mieć dużej polarności, ale jednocześnie odpowiednią siłę elucyjną.
Po rozwinięciu płytka została wysuszona i wywołana rodaminą - barwnik fluorescencyjny - i mogliśmy obserwować płytkę pod światłem UV. W przypadku frakcji I bez problemu mogliśmy odnaleźć pasmo żelu znajdujące się na wysokości wzorca cholesterolu. W przypadku frakcji drugiej konieczne było zastosowanie innej metody wywoływania - na brzeg płytki został naniesiony kwas siarkowy i od razu płytka została ogrzana - doprowadzamy do dehydratacji związków i po dłuższym czasie ogrzewania może nastąpić zwęglenie. Niszczy to cześć materiału, ale dzięki temu mogliśmy zidentyfikować położenie steroli, których nie mogliśmy zidentyfikować po samym spryskaniu rodaminą, w związku z przesunięciem/'przekrzywieniem' pasma wzorca.
Zidentyfikowane pasmo steroli wyskrobaliśmy, umieściliśmy w kolumience i eluowaliśmy, z obu frakcji oddzielnie, przy użyciu eteru etylowego i oddaliśmy próbki do pomiarów chromatografii gazowej. Nie wykonywaliśmy oznaczeń steroli metodą Liebermanna - Burhardta.
Wyniki chromatografii gazowej. Otrzymaliśmy wykresy z pomiarów obu frakcji. Niestety nie są one do końca prawidłowe. Skład jakościowy obu frakcji powinien być analogiczny, różnic należałoby się spodziewać w ilości. U nas natomiast we frakcji I znajdują się: cholesterol, kampesterol i stigmasterol, nie ma natomiast w ogóle sitosterolu, który znajduje się w nadzwyczajnie dużej ilości we frakcji II jako jedyny sterol. Może być to efekt zmiany metabolizmu rośliny pod wpływem mrożenia (otrzymaliśmy do badań zamrożone liście szpinaku).