Maria Klechniowska i Sara Banerjee

Otrzymywanie steroli z zielonych części fasoli.

Sterole są to organiczne związki chemiczne, alkohole należące do steroidów. Powstają poprzez formalne podstawienie atomu węgla w pozycji 3 w szkielecie steroidu przez grupę hydroksylową. Do steroli należy większość steroidów. Ze względu na pochodzenie steroli można je podzielić na: fitosterole, zoosterole, mikosterole, oraz sterole syntetyczne.
Fitosterole - są to sterole pochodzenia roślinnego; do tej grupy należą m. in. 
β-sitosterol, stigmasterol, kampesterol. Są one składnikami strukturalnymi błon komórek roślinnych, a ich budowa przypomina cholesterol. Sterole w roślinach wyższych występują w czterech formach: steroli wolnych, estrów steroli, glukozydów steroli oraz acyloglukozydów steroli. Aby otrzymać sterole oraz określić ich skład jakościowy i ilościowy w ćwiczeniu, należało przeprowadzić:

1. Standardową metodę izolowania związków lipidowych z materiału biologicznego polegającą na ich ekstrakcji najpierw metanolem, a następnie mieszaniną chloroform :metanol. Różna polarność związków umożliwiła pozbycie się wody (zw. polarny), następnie roztwór o niskiej polarności umożliwił wyekstrahowanie steroli (jednak zanieczyszczonych). (procedura: zhomogenizowałyśmy 50g drobno pociętych i zalanych metanolem świeżych liści fasoli, homogenat ogrzałyśmy w łaźni wodnej w temp. 80°C pod chłodnicą zwrotną, oziębiłyśmy i przesączyłyśmy na lejku Buchnera, następnie osad zalałyśmy mieszaniną chloroform-metanol, ogrzałyśmy w łaźni wodnej i powtórzyłyśmy tę czynność, przesącze zagęściłyśmy na wyparce w celu pozbycia się rozpuszczalnika). Suchą pozostałość rozpuściłyśmy w mieszaninie butanol-woda, co umożliwiło pozbycie się nielipidowych związków polarnych. Używając rozdzielacza otrzymałyśmy ekstrakt butanolowy, który zatężyłyśmy w celu pozbycia się rozp.
   Masa otrzymanej surowej frakcji z liści fasoli wyniosła 120mg.

2. Chromatografię adsorpcyjną (wyk. techniką kolumnową) pozwalającą na rozdzielenie mieszaniny związków lipidowych, wykorzystującą różnice w sile ich adsorpcji na powierzchni odpowiedniego nośnika. Zastosowanym adsorbentem był żel krzemionkowy, a kolumnę rozwijałyśmy używając mieszaniny rozpuszczalników chloroform : metanol w stosunku objętościowym 99:1 zbierając frakcję pierwszą a następnie w 8 : 2 otrzymując frakcję II.
   Siła elucyjna chloroformu jest mniejsza niż metanolu, dlatego Fr I zawierała słabiej zaadsorbowane związki, mniej polarne, czyli sterole wolne oraz estry steroli.
   Metanol jest rozp. o większej sile elucyjnej, toteż przy drugim układzie rozpuszczalników umożliwił on wyparcie z powierzchni adsorbenta silniej związanych z nim związków (bardziej polarnych), czyli acyloglukozydów i glukozydów steroli. (obie frakcje zatężyłyśmy do sucha na wyparce w celu pozbycia się rozpuszczalników)
   Wydajność z liści fasoli Fr. I 38 mg, Fr II 50 mg

3. - Hydrolizę zasadową frakcji I (umożliwiła rozpad wiązań estrowych) dodając do frakcji roztworu 10% NaOH w 80% metanolu, ogrzewaniu przez 3 godz. w temp. 80°C. Po zakończeniu hydrolizy próbki ekstrahowałyśmy 3-krotnie eterem etylowym i doprowadziłyśmy wodą do pH 7
   Wydajność
   - Hydrolizę kwasową frakcji II (umożliwiła rozpad wiązań glikozydowych), dodając do frakcji 7% HCl w 80% metanolu, ogrzewaniu przez 2 godz w tem. 80°C. Po zakończeniu hydrolizy również ekstrahowałyśmy 3-krotnie eterem etylowym i doprowadziłyśmy wodą do pH7.
   Obie frakcje zatężyłyśmy do sucha w celu pozbycia się eteru.

4. Chromatografia cienkowarstwowa: Ekstrakty, uprzednio rozpuszczone w niewielkiej objętości chloroformu naniosłyśmy na płytki z żelem krzemionkowym, a następnie rozwijałyśmy je w układzie chloroform : metanol (95 : 5). Po rozwinięciu i wysuszeniu płytek spryskano je roztworem Rodaminy G-6,  barwnikiem fluorescencyjnym, który interkalując w miejsca produktów obu hydroliz pozwala na zlokalizowanie położenia steroli (na podstawie porównania z położeniem wzorca - cholesterolu) uwidaczniając je pod lampą UV.
   Pasma żelu zawierające sterole wyskrobałyśmy z płytek i eluowałyśmy eterem etylowym.
   Po wysuszeniu otrzymane preparaty posłużyły do wykonania chromatografii gazowej oraz do oznaczenia steroli metodą Liebermanna-Burtharda.

5. Dzięki chromatografii gazowej stwierdziłyśmy obecność we frakcji I cholesterolu, kampesteroli, stigmasterolu i fitosterolu. Chromatograf frakcji II nie wykazał steroli we frakcji (przyczyna bliżej nieokreślona, ze względu na wiele możliwości niepowodzenia na poszczególnych etapach).
   Obliczenia na podstawie analizy chromatografu frakcji I:
   powierzchnia dla 1 ug = 2060
   suma powierzchni pików dla steroli = 24777069
   do badania pobrano 4 ul; objętość całej próby to 0,8ml.
   
   

Cholesterol: 1 ug - 24 000000

x ug - 358 272 x=0,15 ug

4 ul - 0,15ug

800 ul - x x=30 ug

Kampesterol: 92,7ug

Stigmasterol: 613 ug

Sitosterol: 1328 ug

Oznaczanie steroli metodą Liebermanna-Burtharda
*wyznaczenie krzywej kalibracyjnej tylko dla frakcji I

Pomiar absorbancji Zawartość cholesterolu

1. 0,043 0.5 mg

2. 0,048 0.5 mg

3. 0,093 1 mg

4. 0,097 1 mg

Frakcja I

5. 0,043 VI - 0,05 -> zawartość steroli = 0,5 mg/g św. masy

---