Paulina Krzemińska 14.12.2011r.

Opis doświadczenia 7:
Lecytyny i cholesterol z żółtka jaja kurzego - izolacja i wykrywanie.

Etapy procesu izolacji:

1. Oddzieliłam żółtko od białka, a następnie zalałam żółtko mieszaniną etanol-eter dietylowy. Etanol spowodował denaturację pozostałości białka, natomiast w eterze rozpuściły się lipidy.

2. Odsączyłam zawiesinę na sączku karbowanym do kolby kulistej, po to aby pozbyć się zdenaturowanego białka i aby oczyścić roztwór lecytyn, kefalin i cholesterolu. Odparowałam eter dietylowy - część zatężonego roztworu zachowałam do analizy chromatograficznej (2).

3. Wkropliłam zatężony roztwór do zlewki z acetonem w celu wydobycia lecytyn i kefalin. Następnie osad lecytyn i kefalin odsączyłam na sączku karbowanym i część osadu zachowałam do analizy na płytce TLC (X); zachowałam także część przesączu do analizy TLC.

4. Pozostałą część osadu rozpuszczam w etanolu, po czym dodaję etanolowego roztworu chlorku kadmu, aby oddzielić kefaliny i lecytyny - lecytyna tworzy krystaliczny kompleks z CdCl₂(3).

5. Odsączyłam kompleks lecytyn na sączku karbowanym do kolby kulistej, a następnie odparowałam rozpuszczalnik i pobrałam część osadu kompleksu lecytyny z CdCl₂ do analizy chromatograficznej.

Chromatografia cienkowarstwowa TLC:

Następujące próbki nanoszę na szklane płytki pokryte żelem krzemionkowym:

W - wzorzec cholesterolu w chloroformie;

2 - wydzielone lecytyny, kefaliny i cholesterol;

X - surowy osad lecytyn i kefalin;

3 - kompleks lecytyn z CdCl₂;

4 - pozostałość po wydzieleniu lecytyn.

Każdą z płytek rozwijam w dwóch układach:

- chloroform-MeOH-woda 65:25:4

- toluen-octan etylu 7:3

Następnie wywołuję płytki w następujący sposób:

1. spryskanie 0,1% roztworem ninhydryny w etanolu i wysuszeniu w piecu w 120 ^oC.

Spryskanie ninhydryną służy wykryciu wolnych grup aminowych.

2. umieszczenie płytki w komorze z jodem.

W ten sposób wykrywa się wiązania podwójne nienasyconych kwasów tłuszczowych. Plamki mają brunatny kolor na żółtym tle.

3. spryskanie 5% roztworem kwasu siarkowego i wysuszeniu w piecu w 120 ^oC.

Kwas siarkowy barwi cholesterol na kolor ciemnoczerwony.

Opracowanie wyników chromatografii:

1. Wywoływacz: ninhydryna

1. Układ: chloroform-metanol-woda

Obserwacje:

	W	2	X	3	4
Plamki / wartości Rf	-	Rf1=0,47 Rf2=0,17	Rf1=0,47 Rf2=0,20	Rf1=0,45 Rf2=0,20	Rf1=0,50 Rf2=0,17
Wnioski	W próbkach 2, X, 3 oraz 4 obserwujemy plamki pochodzące od związków zawierających wolną grupę aminową. Próbka czwarta nie powinna dawać pozytywnego wyniku, ponieważ powinna zawierać jedynie lecytynę (ona zawiera czwartorzędową sól amoniową), stąd można wnioskować, iż próbka została niewystarczająco oczyszczona i zawiera kefaliny.

2. Układ: toluen-octan etylu

Obserwacje:

	W	2	X	3	4
Plamki / wartości Rf	-	Rf=0	Rf=0	Rf=0	Rf=0
Wnioski	Wszystkie próbki zawierają plamki, jednak układ rozpuszczalników był zbyt słaby, aby silnie adsorbowane na płytce związki ruszyły się z miejsca.

2. Wywoływacz: pary jodu

1. Układ: chloroform-metanol-woda

Obserwacje:

	W	2	X	3	4
Plamki / wartości Rf	Rf1=0,77	Rf1=0,83 Rf2=0,24 Rf3=0,48	Rf2=0,24 Rf3=0,48	Rf2=0,23 Rf3=0,45	Rf1=0,83 Rf2=0,24 Rf3=0,47
Wnioski	Pojawienie się plamek świadczy o występowaniu wielu związków zawierających wiązanie podwójne. Cholesterol, którego wartość Rf w poszczególnych próbkach oznaczyłam nr 1, znajdował się w próbce W, 2 oraz 4. Powinien on znajdować się też w próbce X, lecz nie zauważyłam plamki w oczekiwanym miejscu. Wartości Rf oznaczone przeze mnie numerem 2 i 3 świadczą o obecności nienasyconych kwasów tłuszczowych.

2. Układ: toluen-octan etylu

Obserwacje:

	W	2	X	3	4
Plamki / wartości Rf	Rf1=0,4	Rf1=0,35 Rf2=0	Rf2=0	Rf2=0	Rf2=0
Wnioski	Plamka, którą przyporządkowałam cholesterolowi (i oznaczyłam numerem 1) pojawiła się tylko w przypadku próbki W i 2. Powinnam ją zaobserwować również w próbce X i 4, ale niestety dla przybliżonej wartości Rf brak było śladów plamek. Poza plamką o Rf1 pojawiły się również plamki na starcie (oznaczyłam je wartością Rf2), które odpowiadają nienasyconym kwasom tłuszczowym.

3. Wywoływacz: kwas siarkowy (VI)

1. Układ: chloroform-metanol-woda

Obserwacje:

	W	2	X	3	4
Plamki / wartości Rf	Rf1=0,8	Rf1=0,86	Rf1=0,86	-	Rf1=0,86
Wnioski	Wszystkie próbki po wywołaniu dały plamki, jednak analizując je, wzięłam pod uwagę tylko plamki najintensywniejsze, zabarwione na czerwono. Symbolizują one reakcję zachodzącą pomiędzy kwasem siarkowym, a cholesterolem, w której powstaje czerwony produkt odwodnienia (kolor jest spowodowany sprzężonymi wiązaniami podwójnymi). Słusznie, w próbce 3 nie widzimy czerwonej barwy, ponieważ tam mamy tylko kompleks lecytyn z CdCl2. Próbka 3 nie jest zabrudzona cholesterolem.

2. Układ: toluen-octan etylu

Obserwacje:

	W	2	X	3	4
Plamki / wartości Rf	Rf1=0,41	Rf1=0,44	Rf1=0,43	-	Rf1=0,43
Wnioski	Sytuacja wygląda podobnie jak w bardziej polarnym układzie rozpuszczalników. Czerwone plamki obserwujemy dla próbek W, 2, X oraz 4. Próbka 3 nie zawiera cholesterolu.

---