METODY OZNACZANIA AKTYWNOŚCI ENZYMÓW

AMYLAZA

METODY TURBIDYMETRYCZNE i NEFELOMETRYCZNE

Oparte są na pomiarze światła przepuszczonego lub światła rozproszonego przez mętny roztwór skrobi po enzymatycznej degradacji. Metody te są trudne do standaryzacji i cechuje je brak precyzji.

W oznaczaniu aktywności amylazy stosowano półsyntetyczne substraty np.

• amylopektyny sprzężone wiązaniem kowalentnym z barwnikiem

lub

• zsieciowana nierozpuszczalna w wodzie skrobia znakowana barwnikiem.

W pierwszym przypadku pod działaniem amylazy sprzężony z barwnikiem substrat zostaje rozłożony na drobniejsze cząsteczki. Za pomocą alkoholowego roztworu taniny zostają wytrącone z mieszaniny reakcyjnej białka surowicy, nierozłożony substrat oraz wielkocząsteczkowe produkty jego rozpadu. W roztworze zostają niskoczasteczkowe, zabarwione produkty reakcji.

W drugim przypadku zsieciowana nierozpuszczalna w wodzie skrobia ulega rozkładowi na drobne rozpuszczalne w wodzie barwne fragmenty.

Najstarszą metodą sięgającą początków XX wieku oznaczania aktywności amylazy jest metoda jodometryczna opracowana przez Wohlegemutha w 1908 r.

W 1938 roku Samogyi wprowadził standaryzację ilości skrobi i jodu co stanowiło podstawę do metod amyloklastycznych i sacharogenicznych.

METODY AMYLOKLASTYCZNE (JODOMETRYCZNE)

Polegają na rozkładzie w skrobi wiązań 1,4-glikozydowych w wyniku czego powstają drobnocząsteczkowe produkty, które nie dają zabarwienia z jodem. Szybkość zanikania zdolności tworzenia barwnych kompleksów z jodem jest miara aktywności amylazy (metoda Wohlegemutha i Caraway'a)

METODY SACHAROGENICZNE

Polegają na oznaczaniu monosacharydów lub disacharydów po inkubacji z substratem np. za pomocą kwasu dinitrosalicylowego (DNSA) w metodzie Samogyi. W metodach tycz wykorzystuje się także enzymy: maltazę, heksokinazę, oksydazę glukozy. Przykładem jest metoda spektrofotometryczna.

Metoda spektrofotometryczna

MALTOTETROZA ♣ ---------------------⇒ MALTOZA

MALTOZA ♦ -------------------- ⇒ GLUKOZA + β-GLUKOZO-1-P

β-GLUKOZO-1-P ♥-------------------- ⇒ β-GLUKOZO-6-P

β-GLUKOZO-6-P + NAD ♠------------⇒ 6-FOSFOGLUKONIAN + NADH

• AMYLAZA

♦ FOSFORYLAZA MALTOZY

♥ FOSFOGLUKOMUTAZA

• DEHYROGENAZA GLUKOZO-6-P

METODY CHROMOLITYCZNA (KOLORYMETRYCZNE)

Polegają na uwolnieniu barwnika z nierozpuszcalnego lub rozpuszczalnego substratu polisacharydowego. Substratem może być jakiś p-nitrofenyloglikozyd o różnej długości łańcucha (np. maltoheptozyd, maltotriozyd), z którego po hydrolizie uwalnia się p-nitrofenol.

Metoda chromolityczna wielostopniowa

PNPG₇ ♣ --------------⇒ PNPG_n + polimery glukozy ♣ α-amylaza

PNPG_n --------------⇒ PNPG + polimery glukozy ♦ glukoamylaza

PNPG ---------------⇒ p-nitrofenol + glukoza ♥ α-glukozydaza

Substratem jest maltoheptozyd (G₇) związany z p-nitrofenolem. α-amylaza hydrolizuje PNPG₇ dając krótszy łańcuch p-nitrofenylooligosacharydów, który pod wpływem glukoamylazy rozpada się do p-nitrofenylomonosacharydów. Te przy udziale α-glukozydazy ulegają hydrolizie do p-nitrofenolu i glukozy. Szybkość powstawania PNP jest proporcjonalna do aktywności amylazy.

Substrat może być „zablokowany” przez benzolidyne lub etylidynę co ma nacelu chronić przed działaniem egzo-amylazy. Założeniem tej metody jest że substrat długołańcuchowy ma większe powinowactwo do amylazy niż krókołańcuchowy.

Metoda chromolityczna jednostopniowa (bezpośrednia jednostopniowa)

PNPG₃ ♣ --------------⇒ CNP + PNPG₂ + maltotrioza + glukoza

♣ α-amylaza

Substrat stanowi 2-chloro-p-nitrofenylomaltotriozyd, który pod wpływem amylazy ulega hydrolizie i powstaje barwny związek 2-chloro-p-nitrofenol. Szybkość wzrostu absorbancji przy dł. fali 405nm jest proporcjonalna do aktywności enzymu w surowicy.

• najbardziej powszechna metoda oznaczania aktywności amylazy

• nie wymaga lag phase

• jednakowo czuła w stosunku do amylazy śliniankowej i trzustkowej

• posiada dobrą korelację z procedurami „blokującymi”

OZNACZANIE AMYLAZY TRZUSTKOWEJ

FAZA 1: W czasie inkubacji amylaza śliniankowa jest hamowana przez dwa

różne monoklonalne przeciwciała, które nie reagują z amylazą

trzustkową.

FAZA 2: Oznaczanie nie zablokowanej przez przeciwciała amylazy trzustkowej

jedną z metod oznaczania aktywności całkowitej amylazy.

UWAGI

• oznaczanie amylazy winno być wykonane w surowicy wolnej od hemolizy

• antykoagulanty takie jak EDTA, cytrynian wiążą wapń, który jest niezbędny do pełnej aktywności amylazy

• aktywność amylazy w surowicy i moczu jest stabilna tydzień w temp. pokojowej oraz 2 miesiące w temp. 2-8° C

• bilirubina i hemoglobina nie wpływają istotnie na wynik oznaczenia

NORMA

AMYLAZA w surowicy do 90 IU/L

AMYLAZA w moczu do 380 IU/L

LIPAZA

Jest enzymem wydalniczym trzustki. W surowicy osób zdrowych występuje w ilościach śladowych. Aktywność lipolityczna osób zdrowych uwarunkowana jest lipazą trzustkową, lipazą lipoproteinową i esterazami. Enzym jest aktywowany przez kwasy żółciowe, albuminy i sole wapnia. W prawidłowych warunkach aktywność lipolityczna surowicy jest bardzo mała i częściowo wywołana przez lipazę lipoproteinową.

1. METODA MIARECZKOWA (CHERRY CRANDALLA)

Substratem jest oliwa z oliwek zemulgowana gumą arabską. W inkubowanym (3 h) roztworze (bufor TRIS pH 8,0) znajdują się dwa aktywatory (EDTA i octan magnezu). Uwolnione kwasy tłuszczowe miareczkuje się ługiem sodowym wobec wskaźników (fenoloftaleiny i tymoloftaleiny).

2. METODA KOLORYMETRYCZNA

Lipaza rozkłada TG do kwasów tłuszczowych, które po wyekstrahowaniu chloroformem, tworzą mydła miedziowe z jonami miedzi. Jony te oznacza się w reakcji barwnej z dietyloditiokarbaminianem sodu.

3. METODA SPEKTROFOTOMETRYCZNA

Substratem jest trójoleinian, który pod wpływem lipazy ulega hydrolizie co powoduje spadek absorbancji przy dł. fali 340 nm (zmniejszenie zmętnienia).

4. METODY IMMUNOCHEMICZNE

1. Immunoaktywacja - fragmenty przeciwciał przeciwko lipazie trzustkowej są związane kowalentnie z peroksydazą. W obecności lipazy tworzą wysoko spolimeryzowane agregaty, co aktywuje peroksydazę. Zaaktywowana peroksydaza katalizuje reakcję barwną.

2. Aglutynacja lateksowa - przeciwciała przeciwko lipazie są związane z cząsteczkami lateksu. W obecności lipazy dochodzi do aglutynacji (metoda półilosciowa).

5. METODY ENZYMATYCZNE

Oparte na pomiarze stężenia glicerolu uwolnionego po hydrolizie triglicerydów.

• metoda kolorymetryczna

1,2 - digliceryd + H₂O ♣ ------------⇒ 2 - monogliceryd + kwas tłuszczowy

2 - monogliceryd + H₂O ♦ -------------⇒ glicerol + kwas tłuszczowy

glicerol + ATP ♥ -------------⇒ glicerolo-3-fosforan + ADP

glicerolo-3-fosforan + O₂ ♠ ------------⇒ fosfodihydroksyaceton + H₂O₂

H₂O₂ + 4-aminoantypiryna + p-chloro-fenol • ---------⇒ barwnik chinonowy

♣ - lipaza

♦ - lipaza monoglicerydowa

♥ - kinaza glicerolowa

♠ - oksydaza glicerolofosforanowa

• - peroksydaza

• wzrost absorbancji jest proporcjonalny do aktywności lipazy

• szybkość powstawania barwnika jest mierzona przy dł. fali 550 nm

• wysoce specyficzna procedura dzięki zastosowaniu kolipazy i dezoksycholanu jako aktywatorów

• brak interferencji w metodzie esterazy i lipazy lipoproteinowej

• metoda immunologiczna (IMAC)

Fragmenty przeciwciał (Fab) przeciwko ludzkiej lipazie trzustkowej są kowalentnie związane z peroksydazą (POD). W obecności antygenu (lipazy) tworzą w reakcji immunologicznej wysoce spolimeryzowane agregaty, które aktywują peroksydazę. Pod jej wpływem zachodzi reakcja Trindera z fenolem i 4 aminoantypiryną. Powstaje barwnik chinonowy.

• test ten mierzy specyficznie lipazę trzustkową

• metoda ta można oznaczać stężenie lipazy a nie tylko aktywność

UWAGI

• lipaza bakteryjna może wpływać na wynik oznaczenia

• wolny glicerol nie interferuje jeżeli jego stężenie nie przekracza 100mg/dl

• oznaczanie lipazy winno być wykonane w surowicy wolnej od hemolizy pobranej na czczo

• aktywność lipazy w surowicy jest stabilna 3 dni w temp. 2-8° C

NORMA

LIPAZA w surowicy 7 - 60 IU/L

γ - GLUTAMYLOTRANSPEPTYDAZA (GGTP; GTP)

Enzym katalizuje przeniesienie grupy γ-glutamylowej z peptydów γ-glutamylowych na aminokwasy lub peptydy z utworzeniem nowych peptydów γ-glutamylowych.

1. Metoda kolorymetryczna wg Orłowskiego

L-γ-glutamylo-p-nitroanilid + glicyloglicyna ------------⇒ L-γ-glutamylo-

glicyloglicyna + p-nitroanilina

Szybkość powstawania p-nitroaniliny jest proporcjonalna do aktywności GGTP

2. Metoda kolorymetryczna w modyfikacji Szasz

L-γ-glutamylo-3-karboksy-p-nitroanilid + glicyloglicyna ------------⇒

L-γ-glutamylo-glicyloglicyna + kwas 2-nitro-5-aminobenzoesowy

UWAGI

• oznaczanie wyłącznie w surowicy

• większość antykoagulantów hamuje aktywność GGTP

• aktywność GGTP w surowicy jest stabilna 7 dni w temp. 2-8° C

NORMA

u kobiet GGTP 10 - 40 IU/L

u mężczyzn GGTP 10 - 75 IU/L

KINAZA FOSFOKREATYNOWA (CPK, CK)

Enzym katalizuje fosforylacje kreatyny w obecności ATP lub odtworzenie ATP z fosfokreatyny w obecności ADP

1. METODA SPEKTROFOTOMETRYCZNA (ze wzrostem absorbancji)

ADP + FOSFOKREATYNA ♣ ------------⇒ KREATYNA + ATP

ATP + GLUKOZA ♦ -------------⇒ GLUKOZO-6-FOSFORAN + ADP

GLUKOZO-6-FOSFORAN + NAD ♥ ------⇒ 6-FOSFOGLUKONIAN +

NADH

• kinaza kreatynowa

♦ heksokinaza

♥ dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa

2. METODA SPEKTROFOTOMETRYCZNA (ze spadkiem absorbancji)

ADP + FOSFOKREATYNA ♣ ------------⇒ KREATYNA + ATP

ATP + GLUKOZA ♦ -------------⇒ GLUKOZO-6-FOSFORAN + ADP

ADP + FOSFOENOLOPIROGRONIAN ♥ -----⇒ PIROGRONIAN + ATP

PIROGRONIAN + NADH ♠ ------------⇒ MLECZAN + NAD

• kinaza kreatynowa

♦ heksokinaza

♥ kinaza pirogronianowa

♠ dehydrogenaza mleczanowa

IZOENZYM SERCOWY KINAZY FOSFOKREATYNOWEJ (CK-MB)

CK MM (CK - 3) - mięsnie szkieletowe

CK MB (CK - 2) - mięsień sercowy

CK BB (CK - 1) - mózg

MAKROFORMY CK

TYP I

• kompleks CK - BB z immunoglobuliną Ig G

• występuje w ilości 1 %

• obecność związana z procesami autoimmunologicznymi

(głównie miositis)

• interferencja w elektroforezie izoenzymów CK

• podwyższenie aktywności CK-MB w metodzie immunoinhibicji

TYP II

• oligomeryczna forma izoenzymu mitochondrialnego -prawdopodobnie fragment wewnętrznej błony mitochondrium

• występuje w ilości 3 %

• obecność związana z nowotworową proliferacją komórek lub z poważnymi uszkodzeniami komórek (marskość)

• nie interferuje w elektroforezie izoenzymów CK

• znaczne podwyższenie aktywności CK-MB w metodzie immunoinhibicji

Możliwość wykrycia atypowych izoenzymów CK daje test inaktywacji cieplnej. Makroformy pozostają aktywne po ogrzaniu w temp. 45° C przez 20 minut podczas gdy formy typowe ulegają w tych warunkach inaktywacji.

IZOFORMY CK

Posttranslacyjne modyfikacje zachodzące w surowicy pod wpływem karboksypeptydazy

IZOFORMY CK - MB

• tkankowa MB - 2 (występuje w miokardium)

• surowicza MB - 1

IZOFORMY CK - MM

• tkankowa MM - 3 (występuje w miokardium)

• surowicze MM - 1 i MM - 2

Izoformy tkankowe i surowicze są rozdzielane elektroforetycznie i mają znaczenie diagnostyczne w zawale mięśnia sercowego.

1. METODA IMMUNOINHIBICJI

W metodzie tej wykorzystuje się przeciwciała przeciwko podjednostkom M, hamującym aktywność całkowicie CK-MM i w połowie CK-MB. Aktywne pozostają jedynie podjednostki B pochodzące z CK-MB. Aktywność tych podjednostek oznaczana jest metodą spektrofotometryczną a wynik mnożony razy 2. Warunkiem zastosowania tej metody jest założenie, że w surowicy nie pojawia się izoenzym CK-BB. Obecność tego izoenzymu ora obecność makroform CK-BB (kompleksy z IG) zawyżają wyniki oznaczeń tej metody.

2. ELEKTROFOREZA

Nośnikami mogą być agaroza, octan celulozy lub poliakrylamid. Ruchliwość izoenzymów CK w pH 8.6 jest następująca (do anody):

BB > MB > MM

Drugim etapem jest inkubacja żelu z substratem do oznaczania CK. Trzeci etap stanowi pomiar ilości powstałego NADPH metodą densytometrii fluorescencyjnej.

W elektroforezie uwidaczniane są także makroformy CK oraz forma mitochondrialna.

3. CHROMATOGRAFIA JONOWYMIENNA

W metodzie tej stosowane są mikrokolumny wypełnione DEAE-Sephadexem lub DEAE-Celulozą. W drugim etapie izoenzymy są wypłukiwane z mikrokolumn za pomocą buforu TRIS ze wzrastającymi stężeniami NaCl.

4. METODA CHEMILUMINESCENCYJNA

W metodzie tej zastosowane są dwa rodzaje przeciwciał:

• monoklonalne przeciwciała anty-CK-MB znakowane estrem akrydyny

• monoklonalne przeciwciała anty-CK-BB związane kowalentnie z cząsteczkami paramagnetycznymi.

Istnieje bezpośrednia zależność między ilośćią izoenzymu CK-MB a poziomem chemiluminescencji. W metodzie tej nie interferują inne izoenzymy CK.

5. POMIAR CK-MB mass

Pomiar CK-MB mass oparty jest na immunometrycznej reakcji typu kanapkowego (sandwicz). Poliklonalne lub monoklonalne przeciwciała wiążą izoenzym CK-MB. Natomiast izoenzymy CK-MM i CK-BB zostają kowalentnie związane przez przeciwciała z powierzchnią stałą lub cząstkami paramagnetycznymi. CK-MB jest mierzona przez powstawanie powstawanie fluorogennego substratu (IMX Abbot) lub chemiluminescencyjnie (ACS:180, Bayer)

6. INDEKA WZGLĘDNY CK-MB (RI)

CK-MB mass (μg/l)

RI = ________________

Aktywność całkowita CK (IU/l)

Wartości Elektroforeza Pomiar CK-MB mass

Normalne ≤ 3 % < 3.5 %

Podejrzane (wątpliwe) 4 - 7 % 3.5 - 4.5 %

Potwierdzające > 7 % > 4.5 %

UWAGI

• oznaczanie CK całkowitej i CK-MB wykonuje się w surowicy lub w osoczu pobranym na heparynę

• większość antykoagulantów (EDTA, cytryniany, fluorki) hamują aktywność CK i CK-MB

• oznaczanie CK i CK-MB winno być wykonane w surowicy wolnej od hemolizy ((erytrocyty zawierają ATP, G-6-P, kinazę adenylową, które interferują podczas oznaczania)

• aktywność CK i CK-MB w surowicy jest stabilna 2 dni w temp. pokojowej i 7 dni w temp. 2-8° C

NORMA

u kobiet CPK 25 - 170 IU/L

u mężczyzn CPK 25 - 195 IU/L

CK - MB < 26 IU/L

AMINOTRANSFERAZA ASPARAGINIANOWA

(AspAT, ASAT, GOT)

Katalizuje reakcje przeniesienia grupy aminowej z kwasu asparaginowego na cząsteczkę ketokwasu z wytworzeniem nowego aminokwasu i ketokwasu.

1. METODA CHEMICZNA

Zasada tej metody oparta jest na reakcji ketokwasów z 2,4-difenylohydrazyną, w wyniku której powstają brunatnoczerwone fenylohydrazony. Intensywność zabarwienia mierzona przy dł. fali 505 nm jest miarą aktywności enzymu.

Jest to reakcja nieswoista, reaguję każdy z ketokwasów.

2. KINETYCZNA METODA ENZYMATYCZNA

• 1955 - Karmen i Wróblewski opisuja metodę oznaczania AspAT

• lata 60-te - Henry i Amador zaproponowali modyfikacje prowadzące do wzrostu powtarzalności i zmniejszenia interferencji substancji

• 1978 - IFCC zarekomendowało dodawanie do mieszaniny reakcyjnej 5-fosforanu pirydoksalu dla osiągnięcia maksymalnej aktywności

L-asparaginian + α-ketoglutaran ♣ ------⇒ szczawiooctan + L-glutaminian

szczawiooctan + NADH ♦ -------------⇒ jabłczan + NAD

• aminotransferaza asparaginianowa

♦ dehydrogenaza jabłczanowa

Mieszanina zawiera także dehydrogenazę mleczanową (LDH) niezbędną do usunięcia endogennego pirogronianu obecnego w surowicy.

AMINOTRANSFERAZA ALANINOWA (ALAT, GPT)

Katalizuje reakcje przeniesienia grupy aminowej z alaniny na cząsteczkę ketokwasu z wytworzeniem nowego aminokwasu i ketokwasu.

1. METODA CHEMICZNA

Zasada tej metody oparta jest na reakcji ketokwasów z 2,4-difenylohydrazyną, w wyniku której powstają brunatnoczerwone fenylohydrazony. Intensywność zabarwienia mierzona przy dł. fali 505 nm jest miarą aktywności enzymu.

Jest to reakcja nieswoista, reaguje każdy z ketokwasów.

2. KINETYCZNA METODA ENZYMATYCZNA

• 1955 - Henley opisał metodę oznaczania AlAT

• 1960 - metoda zostaje zoptymalizowana przez Henre'go

• 1980 - IFCC akceptuje procedurę wykorzystującą sprzężenie LDH-NADH

L-alanina + α-ketoglutaran ♣ ------⇒ pirogronian + L-glutaminian

pirogronian + NADH ♦ -------------⇒ mleczan + NAD

• aminotransferaza alaninowa

♦ dehydrogenaza mleczanowa

WARUNKI POMIARU ASAT i ALT wg DGKC

ASAT ALAT .

Bufor fosforanowy pH 7.4 80 mmol/l pH 7.4 80 mmol/l

Substrat L-asparaginian L-alanina

200 mmol/l 200 mmol/l

α-ketoglutaran 12 mmol/l 18 mmol/l

NADH 0.18 mmol/l 0.18 mmol/l

LDH > 1200 IU/l > 1200 IU/l

MDH > 600 IU/l ------------

Temperatura 25° C 25° C

WARUNKI POMIARU ASAT i ALT wg IFCC

ASAT ALAT .

BuforTRIS/HCl pH 7.8 80 mmol/l pH 7.3 100 mmol/l

Substrat L-asparaginian L-alanina

240 mmol/l 500 mmol/l

α-ketoglutaran 12 mmol/l 15 mmol/l

Fosforan pirydoksalu 0.1 mmol/l 0.1 mmol/l

NADH 0.18 mmol/l 0.18 mmol/l

LDH > 600 IU/l > 1200 IU/l

MDH > 420 IU/l ------------

Temperatura 30° C 30° C

Inną modyfikacją metody enzymatycznej oznaczania aktywności aminotransferaz jest procedura zaproponowana przez Skandynawskie Towarzystwo Chemii Klinicznej i Fizjologii Klinicznej (SSCC), w której zastosowano bufor TRIS/ EDTA i temperature oznaczania 37° C (bez fosforanu pirydoksalu).

Obecnie wiele firm produkuje zestawy diagnostyczne do oznaczeń aktywności aminotransferaz, stosując zalecane metody z tym, że bez względu na stosowany bufor przyjmuje się temperaturę 37° C.

UWAGI

• oznaczanie AspAT i AlAT winno być wykonane w surowicy wolnej od hemolizy

• aktywność AspAT i AlAT w surowicy jest stabilna 3-4 dni w temp. pokojowej i 7 - 10 dni w temp. 2-8° C

• surowice lipemiczne i żółtaczkowe interferują w oznaczeniu

NORMA

AspAT w surowicy 5 - 50 IU/L

AlAT w surowicy 5 - 50 IU/L

DEHYDROGENAZA MLECZANOWA (LDH)

Katalizuje odwracalną reakcję utleniania mleczanu do pirogronianu

1. METODY SPEKTROFOTOMETRYCZNE

I metoda (P →L) - przebiega w pH obojętnym

pirogronian + NADH -------------⇒ mleczan + NAD

II metoda (L→P)- przebiega w pH alkalicznym

mleczan + NAD -------------⇒ pirogronian + NADH

I metoda jest dwukrotnie szybsza, wykazuje większe aktywności

2. METODA KOLORYMETRYCZNA

W metodzie tej LDH katalizuje redukcję pirogronianu do mleczanu w obecności NADH. Następnie pozostały kwas pirogronowy wchodzi w reakcje z 2,4-difenylihydrazyną, w wyniku czego powstają barwne fenylohydrazony.

UWAGI

• oznaczanie LDH winno być wykonane w surowicy wolnej od hemolizy

• surowicy nie powinno się zamrażać (inaktywacji ulegają izoenzymy wątrobowe LDH) ani poddawać działaniu podwyższonej temperatury

• aktywność AspAT i AlAT w surowicy jest stabilna 3-4 dni w temp. pokojowej i 7 dni w temp. 2-8° C

NORMA

LDH w surowicy 200 - 480 IU/L

IZOENZYMY LDH

1. ROZDZIAŁ ELEKTROFORETYCZNY IZOENZYMÓW LDH

Klasyczna metoda rozdziału izoenzymów LDH prowadzona jest na żelu agarozowym.Po rozdziale izoenzymogram barwiony jest błękitem nitrotetrazolilowym (NBT) i oznaczany densytometrycznie.

Uzyskany ta metodą izoenzymogram wygląda następująco:

LDH 1 27 ± 3,8 %

LDH 2 41 ± 1,5 %

LDH 3 20 ± 2,5 %

LDH 4 6 ± 1,6 %

LDH 5 6 ± 1,5 %

W normalnym izoenzymogramie odsetek podjednostek H wynosi 70 %, zaś podjednostek M około 30 %. Istnieje możliwość uwidocznienia prążków LDH metodą fluorescencyjną lub w świetle UV.

2. METODA INAKTYWACJI CIEPLNEJ

Poszczególne izoenzymy LDH różnią się termostabilnością. Izoenzymy szybciej wędrujące (LDH 1, LDH 2) w polu elektrycznym cechują się większą termostabilnością niż izoenzymy wolnowędrujace (LDH 4, LDH 5). LDH 1 jest trwała nawet po 30 min. w temp 65°C. LDH 5 ulega inaktywacji po 30 min w temp 57°C.

3. METODA ABSORPCYJNA

Do rozdziału izoenzymów LDH wykorzystano fakt, że izoenzymy szybciej wędrujące (LDH 1, LDH 2) w polu elektrycznym absorbują się na DEAE-SEFADEKSIE. Izoenzymy wolnowędrujace (LDH 4, LDH 5) tylko w nieznacznym stopniu ulegają absorbcji. Normalnie na SEFADEKSIE absorbuje się 60 % izoenzymów LDH.

4. METODA IMMUNOCHEMICZNA

Wykorzystuje przeciwciała skierowane przeciwko podjednostkom M. Izoenzymy z tą podjednostką ulegają precypitacji. W nadsączu pozostają jedynie izoenzymy z przewaga podjednostek H.

5. WSKAŹNIK ZAHAMOWANIA LDH

Poszczególne izoenzymy LDH różnią się wrażliwością na działanie szczawianów i mocznika. Szczawian hamują aktywność izoenzymów szybko wędrujących w polu elektrycznym (LDH 1, LDH 2) a mocznik hamują aktywność frakcji wolno wędrującej w polu elektrycznym (LDH 4, LDH 5). Na tej podstawie wylicza się procent zahamowania przez szczawiany i mocznik.

Is% = (Ac - Ar)/Ac x 100

Im% = (Ac - Ar)/Ac x 100

Ac - aktywność całkowita

Ar - aktywność resztkowa po inkubacji ze szczawianami lub mocznikiem

Wskaźnik zahamowania II = Is / Im

Norma 0,77 - 1,85

DEHYDROGANAZA α-HYDROKSYMAŚLANOWA (HBDH)

Aktywność HBDH odpowiada aktywności LDH 1 i LDH 2, które katalizują reakcję utleniania α-hydroksymaślanu do α-ketomaślanu.

1. METODA KOLORYMETRYCZNA

Wykorzystuje reakcje redukcji α-ketomaślanu do α-hydroksymaślanu. Następnie niezredukowany α-ketomaślan łączy się z 2,4-difenylihydrazyną, w wyniku czego powstają barwne fenylohydrazony.

2. METODA SPEKTROFOTOMETRYCZNA

α-ketomaślan + NADH -------------⇒ α-hydroksymaślan + NAD

Miarą aktywności enzymu jest zmniejszenie absorbancji przy 340 nm.

NORMA

HBDH w surowicy 80 - 220 IU/L

ESTERAZA CHOLINOWA (ChE)

Katalizuje reakcję rozkładu estrów choliny. W odróżnieniu od esterazy acetylocholinowej nazywana jest pseudocholinoesterazą. Aktywność enzymu określana jest na podstawie:

• pomiaru nierozłożonej acetylocholiny (metodą kolorymetryczną)

• pomiaru kwasu powstającego z rozkładu estrów choliny (manometrycznie lub elektrometrycznie)

Opracowane są również szybkie testy paskowe do od oznaczania ChE (Acholest i Biophan C). Papierki nasycone są estrem choliny i wskaźnikiem. Uwolniony z estrów kwas powoduje zakwaszenie środowiska i zmianę barwy wskaźnika. Mierzony jest czas od momentu zamoczenia papierka do uzyskania barwy jak na papierku kontrolnym. Im dłuższy czas tym niższa aktywność cholinoesterazy.

1. METODA KOLORYMETRYCZNA

Zasadą jest pomiar ilości nierozłożonej acetylocholiny, która reaguje w środowisku alkalicznym z hydroksylaminą tworząc kwas acetylohydroksyamowy. Kwas ten w środowisku kwaśnym reaguje z jonami Fe³⁺ tworząc barwny kompleks.

2. METODA KINETYCZNA ELLMANA

maślan tiocholiny + H₂O₂ ---------⇒ tiocholina + maślan

tiocholina +DTNB --------⇒ 2-nitrobenzoesan-5-merkaptotiocholiny + TNB

DTNB - ditionitrobenzoesan

TNB - tionitrobenzoesan

NORMA

ChE w surowicy 2150 - 4950 IU/L

OKREŚLENIE LICZBY DIBUKAINOWEJ

Cholinoesteraza może występować w formie typowej i atypowej. W populacji spotyka się

• osobników homozygotycznych z normalną ChE (95 - 97 %)

• osobników heterozygotycznych z częściowo (50 %) normalną ChE i częściowo atypową (3 %)

• osobników homozygotycznych tylko z formą atypową ChE (0,01 - 0,03 %)

Typowa formę od atypowej można rozróżnić na podstawie wrażliwości w stosunku do dibukainy.

• forma typowa jest hamowana przez dibukainę w stężeniu 10^-5 mol/l

• forma atypowa jest niewrażliwa na dibukainę w tych warunkach

Stopień zahamowania enzymu określa LICZBA DIBUKAINOWA

LICZBA DIBUKAINOWA (DN) - jest to różnica między teoretyczną całkowitą aktywnością ChE w surowicy wyrażoną jako 100 % a wyrażoną w odsetkach aktywnością enzymu po dodaniu dibukainy.

Typowa ChE posiada wysoką DN, a atypowa niską DN.

FOSFATAZA ALKALICZNA (ALP, AP, PAL)

Katalizuje hydrolizę estrów kwasu fosforowego uwalniając resztę kwasu fosforowego. Obok tej funkcji wykazano funkcję transferazową polegającą na zdolności do przenoszenia reszty fosforanowej.

Aktywność enzymu mierzy się ilością uwolnionego nieorganicznego fosforanu lub ilością uwolnionej reszty organicznej.

1. METODY KOLORYMETRYCZNE

a) metoda Bessey, Lowry, Brocka (najczęściej stosowana)

nitro-4-fenylofosforan -------------⇒ nitro-4-fenol + reszta fosforanowa

Reakcja zachodzi w środowisku alkalicznym pH 10,5 w obecności buforu AMP - aminometylopropanolu.

2. metoda Shinowara - substrat β-glicerofosforan - reakcja barwna z

kwasem fosfomolibdenowym

3. metoda Kinga - Armstronga - substrat fenylofosforan - reakcja barwna z odczynnikiem Folina - Ciocalteu

4. metoda Kinda - Kinga - substrat fenylofosforan - reakcja barwna z 4-aminoantypiryną

UWAGI

• oznaczanie ALP winno być wykonane w surowicy wolnej od hemolizy

• aktywność ALP w surowicy jest stabilna 4 - 7 dni w temp. 2-8° C

• nie należy oznaczać w osoczu bo antykoagulanty hamują ALP

NORMA

u kobiet ALP 37 - 110 IU/L

u mężczyzn ALP 37 - 123 IU/L

IZOENZYMY ALP

• izoenzym wątrobowy (hepatocyty, kanaliki żółciowe)

• izoenzym kostny

• izoenzym jelitowy (szczoteczkowy zrąb nabłonka jelitowego)

• izoenzym łożyskowy (syncytiotrofoblastach od 12 tygodnia ciąży)

Ponadto występują inne odmiany ALP takie jak: izoenzym Regana, Nagano, Kasahary związane z nowotworami wątroby, czy izoenzym łożyskowo-podobny występujący w grasicy i jądrach.

1. ROZDZIAŁ ELEKTROFORETYCZNY IZOENZYMÓW ALP

Nośnikami są agaroza, skrobia, żel poliakrylamidowy lub octan celulozy. Migracja zależy od wielkości cząsteczek. Najszybciej do anody wędrują:

• frakcja wątrobowa

• frakcja kostna

• łożyskowa

• jelitowa

• izoenzymy żółciowe

U zdrowych jest tylko prążek wątrobowy i kostny. Izoenzym jelitowy jest widoczny po posiłku bogatotłuszczowym lub u pacjentów z chorobami jelit.

2. METODA INAKTYWACJI CIEPLNEJ

Podczas ogrzewania surowicy w temp. 56°C aktywnośc ALP zmniejsza się dwukrotnie. Izoenzym kostny posiada półokres inaktywacji cieplnej 112 sekund, wątrobowy 456 sekund. Izoenzym łożyskowy łożyskowy jest odporny na podgrzewanie nawet w temp. 65°C.

3. INAKTYWACJA CHEMICZNA

izoenzym jelitowy kostny wątrobowy

L-fenyloalanina 91 % 18 % 16 %

MOCZNIK 48 % 93 % 60 %

4. OGNISKOWANIE IZOELEKTRYCZNE

Jest odmianą elektroforezy w gradiencie pH. Białka wędrują do momentu wyrównania pI z pH żelu. Technika ta pozwala uzyskać 12 izoenzymów i izoform ALP.

SCHEMAT OKREŚLENIA NARZĄDOWEJ SWOISTOŚCI ALP

Inaktywacja Wytrącanie Inaktywacja

cieplna 54°C 6 min. rywanolem L-β-Phe

ALP kostna ++++ + +

ALP wątrobowa ++ ++++ +

ALP jelitowa + - ++++

ALP łożyskowa - + -

FOSFATAZA KWAŚNA (AcP)

1. METODY KOLORYMETRYCZNE

1. metoda Hilmana

α -naftylofosforan + H₂O -------------⇒ α -naftol + reszta fosforanowa

α -naftol + Fast Red TR -------------⇒ barwnik dwuazowy

Fast Red TR - 2-amino-5-chlorotoulen

2. metoda Babson-Reeda - substrat α-naftol - reakcja barwna z o-diazydyną

3. metoda Seligmana - substrat β-naftol - reakcja barwna z o-diazydyną

4. metoda Jaffe-Bodansky'ego - substrat β-glicerofosforan - reakcja barwna z kwasem fosfomolibdenowym

5. metoda Gutmana - substrat fenylofosforan - reakcja barwna z odczynnikiem Folina - Ciocalteu

6. metoda Hudsona - substrat p-nitrofenylofosforan - reakcja barwna z NaOH

UWAGI

• oznaczanie AcP winno być wykonane w surowicy wolnej od hemolizy (surowicę od skrzepu należy oddzielić w ciągu 2 godzin)

• aktywność AcP w surowicy w temp. pokojowej jest bardzo labilna. Stabilizację można osiągnąć przez zakwaszenie buforem octanowym. Zakwaszone próbki są stabilne 7 dni w temp. 2-8° C.

• nie należy oznaczać w osoczu bo antykoagulanty hamują aktywność AcP

IZOENZYMY AcP

• gruczoł krokowy (PAP, AcPs)

• erytrocyty

• wątroba, nerki

1. HAMOWANIE AKTYWNOŚCI PAP KWASEM L-WINOWYM

L-winian hamuje aktywność izoenzymu sterczowego fosfatazy kwaśnej. Aktywna resztę niesterczową oznaczamy jedną z metod oznaczania całkowitej AcP. Aktywność PAP obliczamy ze wzoru:

Aktywność PAP = AcP całkowita - AcP niesterczowa

2. METODA FLUORYMETRYCZNA

Substratem jest fosforan 4-metyloumbelliferonu, który ulega hydrolizie uwalniając fluoryzujący 4-metyloumbelliferon.

3. METODA RIA - PAP znakowana jodem, przewciwciała przeciwko PAP

4. IMMUNOELEKTROFOREZA PRZECIWPRĄDOWA - CIEP

Wykorzystuje migrację izoenzymu sterczowego i przeciwciał anty-PAP w polu elektrycznym. W miejscu zetknięcia tworzą się linie precypitacyjne. Do ich uwidocznienia stosuje się α -naftylofosforan.

5. METODA ELISA

Reakcja typu kanapkowego. Wiązanie PAP z przeciwciałami anty-PAP a następnie z przeciwciałami anty-PAP związanymi z peroksydazą.

NORMA

AcP w surowicy < 10 IU/L

AcPs w surowicy < 3,5 IU/L

AMINOPEPTYDAZA LEUCYNOWA (LAP)

• enzym cytoplazmatyczny

• aktywność wzrasta w chorobach wątroby (WZW, nowotwory, żółtaczki zastoinowe), utrzymuje się dłużej niż aminotransferazy, wzrost równolegle ze wzrostem aktywności 5'nukleotydazy

• w OZT wzrost aktywności LAP utrzymuje się dłużej niż amylazy

METODA KOLORYMETRYCZNA

L-leucyno-4-nitroanilid + H₂O -------------⇒ L-leucyna + 4-nitroanilid

Wzrost stężenia 4-nitroaniliny mierzony przy dł. fali 405 nm jest proporcjonalny do aktywności enzymu

NORMA

LAP w surowicy 8 - 22 IU/L

5'NUKLEOTYDAZA (5'NU)

5'Nu jest czułym specyficznym markerem funkcji wewnątrzwątrobowych dróg żółciowych. Jest szczególnie użyteczna w diagnostyce żółtaczek oraz jako marker metastazy w watrobie.

METODA KOLORYMETRYCZNA

5'MONOFOSFORAN INOZYNY ♣ ----------⇒ INOZYNA + FOSFORAN

INOZYNA + FOSFORAN ♦ ---------⇒ HYPOKSANTYNA + FOSFORAN

RYBOZY

HYPOKSANTYNA + O₂ ♥ ------⇒ KSANTYNA + H₂O₂

KSANTYNA + O₂ ♠ ------------⇒ KWAS MOCZOWY + H₂O₂

H₂O₂ + 4-aminoantypiryna + p-chloro-fenol • ---------⇒ barwnik chinonowy

• 5'nukleotydaza

♦ fosforylaza nukleozydowa

♥ oksydaza ksantynowa

♠ oksydaza ksantynowa

• peroksydaza

szybkość powstawania barwnika jest mierzona przy dł. fali 500 nm

NORMA

5'NU w surowicy < 9 IU/L

3

---